Producció i caracterització de variants de la ribonucleasa pancreàtica humana dissenyades per a adquirir propietats citotòxiques

Amb la finalitat d'aprofundir en les bases moleculars de la citotoxicitat de les ribonucleases pancreàtiques, es van construir variants derivades de l'HP-RNasa seguint dues estratègies. En la primera, es van generar variants de l'enzim resistents a l'acció de l'inhibidor proteic de les ribonucleases (hRI), substituint residus implicats en la interfície de contacte entre la ribonucleasa i l'hRI. En la segona, es va addicionar el motiu RGD en regions de superfície de la proteïna implicades en la formació del complex amb l'hRI, a fi de promoure la seva interacció amb la membrana plasmàtica de les cèl·lules i a la vegada disminuir l'afinitat de les variants per l'hRI. Es va comprovar que només les variants portadores de substitucions múltiples adquirien la capacitat de resistència a l'hRI. L'estudi del percentatge d'inhibició de la síntesi proteica en cèl·lules incubades amb cadascuna de les variants va mostrar que només dues de les variants construïdes havien adquirit propietats citotòxiques. La citotoxicitat més elevada la va presentar una variant que no era resistent a l'hRI, amb valors que eren només entre 5 i 15 vegades inferiors als de l'onconasa. Aquest resultat demostrà que la sensibilitat a l'hRI no és necessàriament un paràmetre limitant per a la citotoxicitat de les ribonucleases. Cap de les variants que incorporava un motiu RGD presentà citotoxicitat, evidenciant que aquest motiu no és efectiu a fi de dotar les ribonucleases pancreàtiques de propietats citotòxiques. Es van estudiar les bases moleculars de la citotoxicitat de la variant més citotòxica. En primer lloc, l'anàlisi de la internalització per marcatge radioactiu d'aquesta variant en relació amb l'onconasa i amb altres variants de l'HP-RNasa no citotòxiques, va posar en evidència que només l'onconasa era internalitzada eficientment. Es descartava així la possibilitat que l'acció citotòxica de l'enzim estudiat fos conseqüència d'una major eficiència d'endocitosi. També es va comprovar que l'addició del motiu RGD no era capaç de promoure la internalització de les proteïnes amb més eficàcia. Per microscòpia confocal de fluorescència, les variants humanes només es van començar a detectar a l'interior de la cèl·lula a partir de les 24 h d'incubació. Totes les variants generades van presentar una eficiència catalítica superior al 50 % de l'activitat de la seva proteïna parental, PM5, indicant que probablement l'estructura del centre actiu no havia estat afectada de manera dràstica per les substitucions introduïdes. No obstant, en tots els casos es va produir una disminució en la termoestabilitat respecte a PM5. Aquest resultat indicà que la correlació descrita a la bibliografia entre l'increment de termoestabilitat i l'increment de citotoxicitat per les ribonucleases no sempre es compleix. Per microscòpia confocal es va comprovar que tant la proteïna més citotòxica, com una variant no citotòxica resistent a l'hRI, així com la proteïna parental, seguien la via de degradació lisosomal. Aquesta ruta de trànsit no va ser afectada per l'addició de drogues que alteren les vies de trànsit retrògrad (monensina i brefeldina A), però sí per l'addició de la bafilomicina A1, una droga que neutralitza el pH endosomal i que va actuar alentint el trànsit de les proteïnes als lisosomes. D'acord amb aquests resultats, els valors de citotoxicitat de les variants es van incrementar de manera significativa només en presència de bafilomicina A1, suggerint que les ribonucleases transloquen al citoplasma a partir d'algun punt de la via de trànsit endosomal. Es va comprovar que l'acció de la variant més citotòxica era deguda a que l'addició d'un segon motiu de tres Arg en PE5 dota a aquesta proteïna amb un senyal de transport nuclear. La fracció d'enzim que aconsegueix translocar al citoplasma a partir d'algun punt de la via endosomal previ als lisosomes, és conduït ràpidament al nucli de la cèl·lula per mitjà del mecanisme clàssic de transport actiu. Per la seva afinitat amb l'rRNA, l'enzim es concentra en el nuclèol, on probablement duu a terme la seva activitat catalítica. La interacció d'aquesta variant amb els receptors nucleocitoplasmàtics, les importines, impediria per altra banda el bloqueig de l'enzim per part de l'hRI. Els resultats obtinguts presenten una nova estratègia de disseny de ribonucleases citotòxiques, basada en l'addició de segments NLS a fi de promoure el transport nuclear dels enzims. Aquesta estratègia podria permetre superar limitacions que fins al moment han estat descrites com a limitants de la citotoxicitat de les ribonucleases pancreàtiques, com la sensibilitat a l'hRI o la baixa eficiència d'internalització.

The main objective of this thesis is to study the molecular bases of the cytotoxicity of certain ribonucleases. With the final aim to obtain cytotoxic variants derived from human pancreatic ribonuclease. For this purpose, we created variants derived from HP-RNase by using two different strategies. In the first, variants of the enzyme that were resistant to the action of the protein inhibitor of the ribonuclease (RI) were generated, replacing residues involved in the contact interfase between the ribonuclease and RI. In the second, RGD motifs were added to the surface of the proteins involved in the formation of the RI complex, with the aim of promoting their interaction with the cell plasmatic membrane, whilst at the same time decreasing the variant's affinity for RI. We showed that only variants carrying multiple substitutions acquired the capacity to resist the RI. The study of the percentage of inhibition of protein synthesis in incubated cells using each of the variants showed that only two variants had acquired cytotoxic properties. The highest level of cytotoxicity found in a non-resistant variant to RI had a value that was only 5 and 25 times lower than those registered by Onconase®. This result shows that RI sensitivity is not a limiting factor for the cytotoxicity of the ribonuclease. None of the variants which contained RGD motifs showed any sign of toxicity, suggesting that for this reason it is not effective in giving pancreatic ribonuclease cytotoxic properties. The cytotoxic molecular bases of the most cytotoxic variant were studied. Firstly by the analysis of the internalisation of this particular variant by radioactive marking in relation to Onconase and other non-cytotoxic variants of HP-RNase, which showed that only Onconase was effectively internalised. Thus the possibility that the cytotoxic action of the enzyme under observation was a result of a more efficient endocytosis was ruled out. It was also shown that the addition of the RGD motif was unable to encourage the internalisation of the proteins more effectively. Using confocal microscopy, the human variants only began to be noted inside the cell after 24 hours incubation. All the variants that were created retained a catalytic efficiency that was never less than 50 % of the catalytic activity achieved by the parent protein PM5. This suggests that the structure within the active centre had not been affected in any serious way by the introduction of the substitutions. However a decrease in thermostabilty was noted across the board with regards to PM5. This result indicates that the correlation mentioned in the bibliography between the increase of thermostability and the increase of cytotoxicity of the ribonuclease does not always exist. Using a confocal microscope, we confirmed that both the most cytotoxic protein, such as a non-cytotoxic variant resistant to RI, and the parent protein, followed the same lysosomal pathway of degradation. This outcome was unaffected by the addition of drugs which can change retrograde transit pathways (monensine and brefeldine A), but was effected by the addition of bafilomicine A1 a drug which neutralises endosomal pH and which in this case acted by slowing down the movement of proteins to lysosomes. In accordance with these results, the cytotoxicity values of the variants were significantly increased only by the presence bafilomicine A1 suggesting that the ribonuclease translocate into the cytoplasm starting from a point somewhere along the endosomal transit pathway. We confirmed that the behaviour of the most cytotoxic variant was due to the fact that the addition of a second motif of 3 Arg in PE5 endowed the protein with a nuclear transport signal. The division of the enzyme that translocates into the cytoplasm (from somewhere along the endosomal transit path before the lysosomes) is rapidly moved towards the core of the cell via the conventional mechanism for nucleus transport. Due to its affinity for rRNA, the enzyme gathers in the nucleolus, where it probably carries out its catalytic activity. On the other hand, the interaction of this variant with nucleocytoplasmatic receptors will prevent the RI from inhibiting the enzyme. These results offer a new strategy for the design of cytotoxic ribonuclease, based on the addition of NLS motifs, with the aim of encouraging the nuclear transport of enzymes. This strategy could allow one to overcome limitations that up until now have been the down-side to the cytotoxicity of pancreatic ribonuclease, such as a sensitivity for RI or the limited efficiency of internalisation.