Mapeamento de proteínas alvo para novos antifúngicos na fração microssomal e citosólica do patógeno humano Aspergillus fumigatus

A incidência de infecções fúngicas invasivas vem aumentando nos últimos anos. Estas infecções, em geral, apresentam altas taxas de mortalidade. A profilaxia com antifúngicos ainda é a estratégia mais comum na contenção da mortalidade e prevenção contra infecções fúngicas invasivas, porém, apresenta baixa eficiência, e relatos de resistência às drogas. Além disso, a terapia antifúngica é limitada a um pequeno grupo de drogas, como os polienos, azóis e equinocandinas. Desta forma, a busca de novos alvos de drogas é fundamental para o desenvolvimento de novos antifúngicos. Estudos in silico indicaram quatro genes como potenciais alvo de drogas em fungos patogênicos. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi verificar a expressão das proteínas codificadas por dois destes possíveis genes alvo, a proteína erg6, na fração microssomal, e trr1, na fração citosólica, em hifas de A. fumigatus. Visando alcançar este objetivo, foram primeiramente padronizadas todas as etapas de fracionamento celular visando isolar estas duas subfrações celulares de A. fumigatus. Posteriormente, foi otimizado o protocolo de extração e reidratação de proteínas microssomais bem como reidratação de proteínas citosólicas. Estes extratos foram submetidos a diferentes protocolos de fracionamento proteico em um sistema de eletroforese OFFGEL (OGE). Os resultados de Western immunoblot mostraram que estas duas proteínas, erg6 e trr1, são de fato expressas na fase filamentosa de A. fumigatus. O extrato proteico da fração microssomal submetido ao OGE em doze subfrações apresentou três subunidades da proteína erg6, reconhecidas pelo anticorpo monoclonal, com massas moleculares e pI distintos: uma subunidade de aproximadamente 79 kDa com pI entre 5,91 e 6,49, e outras duas subunidades de aproximadamente 35 kDa e 32 kDa, ambas com pI entre 6,49 e 7,08. A enzima erg6 foi descrita como um homotetrâmero em outros fungos. Porém, nossos resultados sugerem que, em A. fumigatus, a erg6 possui uma estrutura heterotetramérica. Quanto à proteína trr1, tanto no extrato total quanto nas frações resultantes do fracionamento em OGE, uma banda única de aproximadamente 40 kDa, com pI na faixa de 4,79 e 5,33, foi reconhecida pelo anticorpo policlonal. Desta forma, esta proteína parece ter uma estrutura homodimérica, assim como descrito em outros micro-organismos.

Biochemical biomarkers in samples processed by different methods in Environmental Specimen Banks

In the last decades the creation of new Environmental Specimen Banks (ESB) is increasing due to the necessity of knowing the effects of pollutants in both the environment and human populations. ESBs analyze and store samples in order to understand the effects of chemicals, emerging substances and the environmental changes in biota. For a correct analysis of the effect induced by these variables, there is a need to add biological endpoints, such as biomarkers, to the endpoints based on chemical approaches which have being used until now. It is essential to adapt ESB´s sampling strategies in order to enable scientists to apply new biological methods. The present study was performed to obtain biochemical endpoints from samples stored in the BBEBB (Biscay Bay Environmental Biospecimen Bank) of the Marine Station of Plentzia (PIE - UPV/EHU). The main objective of the present work was to study the variability caused in biochemical biomarkers by different processing methods in mussels (Mytilus galloprovincialis) from two localities (Plentzia and Arriluze) with different pollution history. It can be concluded that the selected biomarkers (glutathione S-transferase and acetylcholinesterase) can be accurately measured in samples stored for years in the ESBs. The results also allowed the discrimination of both sampling sites. However, in a further step, the threshold levels and baseline values should be characterized for a correct interpretation of the results in relation to the assessment of the ecosystem health status.

Influência do desequilíbrio redox e resposta inflamatória na fibrose pulmonar associada a estímulo inflamatório prévio

A fibrose pulmonar é uma doença pulmonar crônica caracterizada pelo acúmulo excessivo de matriz extracelular (MEC) e um remodelamento na arquitetura pulmonar. Embora já se saiba da participação do estresse oxidativo e da inflamação na fibrose de forma isolada, é importante observar como se comporta o estresse oxidativo na fibrose quando esta ocorre associada a uma doença de base. O presente estudo teve como objetivo investigar o perfil inflamatório e oxidativo na fibrose pulmonar associado ao enfisema pulmonar prévio. Camundongos C57BL/6 foram divididos em três grupos: grupo controle (n=5) que receberam salina intranasal (50 l) e foram sacrificados no 21 dia; grupo bleomicina (BLEO) (n=15) que receberam bleomicina intratraqueal (0.1 U/animal) no dia 0 e foram sacrificados nos 7 (n=5), 14 (n=5) e 21 (n=5) dias e grupo PPE (elastase) + BLEO (n=21) que receberam elastase (3U/animal) e após 14 dias receberam bleomicina e foram sacrificados nos 14(n=7), 21 (n=7), 28 (n=7) e 35 (n=7) dias. Foram realizadas análises histológicas através de H&E e picro-sirius; análises bioquímicas para superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT), glutationa peroxidase (GPx) e glutationa-S-transferase (GST) e ELISA para Interleucina (IL)-1β e IL-6. A fibrose pulmonar ocorreu a partir do 14 dia (p<0.001) e o enfisema concomitante a fibrose pulmonar a partir do 28 dia (p<0.001) e um aumento de fibras colágenas no grupo BLEO 21(p<0.001) e PPE + BLEO 21(p<0.001). As enzimas antioxidantes CAT (p<0.01), SOD (p<0.01) e GPx (p<0.01) reduziram e a GST aumentou no grupo BLEO 21 dias (p<0.05). No grupo PPE + BLEO 21 dias houve redução das enzimas antioxidantes CAT, SOD, GPx (p<0.05) e GST. Os níveis de óxido foram altos nos grupos BLEO 21 dias (p<0.01) e PPE + BLEO 21 dias (p<0.01). A IL-1β mostrou-se elevada no grupo BLEO 7 dias quando comparado ao controle (p<0.001) e ao grupo PPE + BLEO 7 dias (p<0.01). Concluímos que a resposta inflamatória inibiu a ação do sistema antioxidante contribuindo para o agravamento da lesão. Isso sugere que terapias anti-inflamatórias podem contribuir tanto para redução da resposta inflamatória quanto de forma indireta no sistema antioxidante.

Alterações eritrocitárias induzidas pelo exercício físico

Evidências crescentes têm demonstrado que o exercício prejudica a estrutura da membrana eritrocitária, como consequência do aumento do estresse físico e químico. O óxido nítrico (NO) derivado dos eritrócitos afeta a fluidez da membrana e a sua biodisponibilidade depende do equilíbrio entre a sua síntese e eliminação por espécies reativas de oxigênio. Nós investigamos se o exercício realizado em diferentes intensidades afetaria biodisponibilidade do NO eritrocitário e se levaria a um quadro de estresse oxidativo. Dez homens (26 4 anos, VO2pico 44,1 4,3 mL.kg-1.min-1) realizaram um teste cardiopulmonar máximo em esteira e um teste de exercício submáximo a 70% VO2pico durante 30 min. O sangue foi coletado em repouso e imediatamente após os exercícios para isolamento dos eritrócitos. O exercício máximo aumentou a contagem de eritrócitos, hemoglobina e hematócrito, sem levar a qualquer alteração na massa corporal que pudesse sugerir hemoconcentração devido a uma redução do volume plasmático. Observou-se uma diminuição do influxo de L-arginina depois do teste submáximo, mas não no teste máximo. No entanto, a atividade da óxido nítrico sintase, ou seja, a produção de NO, foi aumentada após o teste máximo. Os níveis de GMPc não se alteraram após ambos os teste de exercício. Em relação aos biomarcadores de estresse oxidativo, o exercício submáximo reduziu a oxidação proteica e aumentou a atividade da catalase e a expressão da glutationa peroxidase, enquanto que o exercício máximo levou a uma maior peroxidação lipídica e diminuição da atividade da SOD. Nem a atividade glutationa peroxidase ou a expressão NADPH oxidase foram afetadas pelo exercício. Estes resultados sugerem que o exercício induziu alterações no estresse oxidativo de eritrócitos, que parecem estar mais associadas com a intensidade do que a duração do execicio. Além disso, nas intensidades recomendadas para a promoção da saúde, o exercício mostrou ser protetor, aumentando a atividade e a expressão de enzimas antioxidantes importantes e reduzindo os danos oxidativos.

Investigação da atividade toxicológica de análogos de estatinas em modelos experimentais in vitro

As estatinas são fármacos inibidores competitivos da enzima hidroxi-3-metil-glutaril Coenzima A (HMGCoA) redutase, amplamente utilizados para o controle da hipercolesterolemia total e, em especial, para a redução dos níveis séricos de LDLc (Low Density Lipoprotein cholesterol). Além do efeito primário, esses fármacos apresentam vários efeitos secundários, chamados de efeitos pleiotrópicos, envolvendo atividade anti-inflamatória, antitumoral e antiparasitária. Para o desenvolvimento de inovações na área de química medicinal é imprescindível avaliar o risco de efeitos adversos para saúde ou, em outras palavras, a segurança terapêutica do novo produto nas condições propostas de uso. Nesse sentido, o objetivo desse trabalho foi investigar a genotoxicidade de quatro análogos inibidores da biossíntese de lipídios, da classe das estatinas, em modelos experimentais in vitro, testados previamente contra o clone W2 de Plasmodium falciparum a fim de se obter o IC50 dessas moléculas frente ao patógeno. Foram desenvolvidas quatro novas moléculas (PCSR02.001, PCSR09.001, PCSR08.002 e PCSR10.002). Para a avaliação da toxicidade, foram realizados o teste de mutagenicidade bacteriana (teste de Ames), o ensaio de viabilidade celular utilizando o reagente WST-1 e o ensaio de indução de micronúcleos, ambos utilizando uma linhagem ovariana (CHO-K1) e uma linhagem hepática (HepG2). Levando em conta o fato de nenhuma das amostras ter induzido efeitos mutagênicos nas linhagens de S. enterica sorovar Typhimurium, e PCSR10.002 ter apresentado citotoxicidade sugere-se então que este composto seja o mais tóxico. Comparativamente, PCSR10.002 foi mais genotóxico e citotóxico para a linhagem CHO-K1 do que para a linhagem HepG2. PCSR02.001 apresentou elevado potencial genotóxico para células ovarianas, mas não foi capaz de induzir a formação de micronúcleos em células hepáticas, apresentando, portanto um perfil similar ao observado em PCSR10.002. Assim como a atorvastatina, PCSR09.001 apresentou elevado potencial pró-apoptótico para a linhagem de hepatócitos. Já PCSR08.002, apresentou aumento na apoptose de CHO-K1. A indução de apoptose não é necessariamente um evento negativo, já que é pouco lesiva e responsável pela eliminação de células danificadas. Porém, as respostas de apoptose induzidas por esse composto foram muito inferiores àquelas induzidas pela atorvastatina (cerca de 4 vezes menor que a atorvastatina). PCSR08.002 foi aquele se mostrou menos tóxico e essa amostra foi a que teve menor risco relativo, em uma análise global das respostas de citotoxicidade e não demonstrou ter potencial genotóxico para as linhagens utilizadas nesse estudo. Conclui-se, portanto, que a análise da atividade toxicológica utilizando modelos experimentais in vitro dessas estatinas constitui um importante passo para o estabelecimento de novos candidatos à fármacos com maior segurança.

Efeito do tratamento com o extrato hidro-alcoólico do açaí (Euterpe oleracea Mart.) sobre as alterações cardiovasculares em ratos espontaneamente hipertensos (SHR)

A hipertensão é uma das mais importantes causas de morte prematura no mundo. Estudos sobre a Euterpe oleracea Mart. (açaí), uma planta típica do Brasil e rica em polifenóis, têm mostrado grande potencial terapêutico contra a hipertensão, uma vez que seus benefícios podem ser associados às ações antioxidante, vasodilatadora e anti-hipertensiva. O rato espontaneamente hipertenso (SHR) é um modelo experimental utilizado para o estudo da hipertensão essencial. Neste estudo, investigamos o efeito do tratamento crônico do extrato hidroalcoólico do caroço de açaí (ASE) sobre a hipertensão de SHR. Animais SHR e Wistar receberam tratamento com ASE (200 mg/Kg/dia) na água de beber, ou veículo, desde 21 dias até 4 meses de idade e tiveram a pressão arterial sistólica (PAS) aferida por pletismografia de cauda. Os efeitos vasodilatadores da acetilcolina (ACh) e nitroglicerina (NG) foram estudados em leito arterial mesentérico (LAM) perfundido e pré-contraído com norepinefrina. A atividade das enzimas superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT), glutationa peroxidase (GPx), os níveis de malondialdeído (MDA), a carbonilação de proteínas e os níveis de nitrito foram avaliados em plasma, LAM, coração e rim por espectrofotometria. A expressão das proteínas SOD e eNOS foram avaliadas por western blot em LAM e as alterações vasculares pela espessura da túnica média em aorta. A PAS foi maior (p<0.05) nos animais SHR, e reduzida pelo tratamento com ASE. O efeito vasodilatador reduzido da ACh em SHR foi recuperado pelo ASE e o da NG não foi diferente entre os grupos. Não houve diferença nos níveis de glicose e insulina em SHR comparados aos controles. Entretanto, a insulina se apresentou reduzida no grupo SHR+ASE. O nível de renina foi maior nos SHR e normalizado pelo ASE (p<0.05). Os níveis de MDA não foram diferentes entre SHR e controles, entretanto o tratamento com ASE reduziu esses níveis em rim de SHR (p<0.05). Os níveis de carbonilação de proteínas foram maiores em amostras de rim e coração de SHR e o ASE reduziu o dano sobre proteínas (p<0.05), não tendo diferença em plasma e LAM. A atividade da SOD foi menor em amostras de rim nos animais SHR e aumentada pelo tratamento com ASE (p<0.05). Entretanto, a atividade aumentada da SOD em coração e LAM dos SHR, foi reduzida pelo tratamento com ASE, não havendo diferença em amostras de plasma. Não houve diferença na atividade da GPx em amostras de LAM e coração dos diferentes grupos, porém sua atividade foi aumentada em rim dos SHR, e o tratamento com ASE normalizou essa atividade. Em plasma, a atividade da GPx foi reduzida em SHR e aumentada pelo tratamento (p<0.05). A atividade da enzima CAT foi reduzida em plasma e rim de SHR e o ASE aumentou sua atividade. Não houve diferença em amostras de LAM, entretanto em amostras de coração o tratamento aumentou a atividade da CAT em SHR (p<0.05). Em amostras de plasma, coração e rim, não houve diferença nos níveis de nitrito entre os diferentes grupos, porém em amostras de LAM foram menores em SHR e SHR+ASE (p<0.05). A expressão das proteínas eNOS e SOD apresentaram-se aumentadas em SHR (p<0.05) sem alteração com o tratamento. Os SHR apresentaram um aumento na espessura da camada média da aorta que foi reduzido (p<0.05) pelo ASE. Este estudo demonstrou que o tratamento crônico com ASE em SHR reduziu a hipertensão, preveniu a disfunção endotelial e o remodelamento vascular. O aumento da defesa antioxidante e redução do dano oxidativo devem contribuir para os efeitos benéficos de ASE. Portanto, sugerimos que o ASE pode ser uma ferramenta importante para o tratamento das alterações cardiovasculares associadas à hipertensão essencial.

Alterações na biodisponibilidade de óxido nítrico e no estresse oxidativo em plaquetas de mulheres na pós-menopausa

O risco de desenvolver doença cardiovascular aumenta com o avançar da idade, sendo exponencialmente maior em mulheres após a menopausa em relação a mulheres em idade reprodutiva. Esse aumento pode ser, em parte, explicado por uma hiperatividade plaquetária e disfunção endotelial nessas mulheres. Em plaquetas, o óxido nítrico é uma molécula essencial para a inibição da sua ativação e agregação; cuja biodisponibilidade depende de sua síntese e inativação por espécies reativas de oxigênio. Assim, o presente estudo visa determinar os efeitos da menopausa sobre a função plaquetária, biodisponibilidade de óxido nítrico e estresse oxidativo. Para tal, a amostra foi constituída por mulheres sendo elas 15 jovens entre 20 e 40 anos (grupo controle), 12 mulheres entre 45 e 60 anos pós-menopausadas há no mínimo 12 meses que não faziam uso de reposição hormonal e que não possuíam fatores de risco para doença cardiovascular. Os resultados demonstraram que mulheres pós-menopausadas apresentam uma hiperagregação plaquetária induzida por colágeno em relação a mulheres jovens. Essas mulheres também apresentaram o influxo de L-arginina aumentado em relação ao grupo controle. No entanto, a atividade da enzima óxido nítrico sintase estava diminuída nas mulheres após a menopausa, assim como os níveis plasmáticos de L-arginina. A expressão das enzimas iNOS e eNOS não diferiu significativamente entre os grupos. A expressão das subunidades 1 e 1 da enzima guanilato ciclase, e a fosfodiesterase 5 não se apresentaram diferentes entre os grupos. A expressão das enzimas glutationa peroxidase, subunidades gp91phox e p47phox da NADPH oxidase não estavam alteradas em plaquetas de mulheres pós-menopausadas, já a catalase estava mais expressa neste grupo. Em relação à atividade das enzimas antioxidantes, foi observado um aumento na superóxido dismutase em mulheres pós-menopausadas. Esse grupo apresentou ainda níveis mais elevados de grupamentos sulfidrila. Já em relação a danos proteicos não foi possível observar diferença entre os grupos. Dessa forma, esses resultados podem contribuir para uma melhor compreensão da hiperagregação plaquetária observada nas mulheres após a menopausa, o que, por sua vez, pode contribuir para a elucidação de mecanismos envolvidos na morbidade e mortalidade cardiovascular elevada nessa população.

Enzimas antioxidantes em sangue de peixes expostos à hipoxia e hiperoxia

O oxigênio é importante não só por sua participação no metabolismo energético, mas também por sua conversão em derivados parcialmente reduzidos, as espécies reativas de oxigênio (ERO). ERO participam de funções importantes em diversas vias do metabolismo, entretanto, em concentrações desequilibradamente elevadas deflagram a peroxidação lipídica, processo deletério que forma aldeídos tóxicos, como o 4-hidroxi-2-nonenal (4-HNE). A manutenção de concentrações não deletérias das ERO é realizada por moléculas componentes do sistema antioxidante. Peixes podem ser expostos a grandes variações das concentrações de oxigênio, o que provoca ciclos oxidantes. A maioria dos estudos usa fígado e rim para avaliar estresse oxidante por meio de ensaios das atividades antioxidantes, o que requer o sacrifício dos animais. Contudo, o sangue sofre efeitos das ERO e avaliações no sangue podem permitir o estudo de antioxidantes no mesmo animal, sem a necessidade de sacrifício. Em consequência, foram nossos objetivos estabelecer uma técnica de cateterismo branquial em peixes, a padronização dos ensaios e a avaliação em sangue de componentes do sistema antioxidante de duas espécies de teleósteos em diferentes tensões de oxigênio. Pacus e tilápias foram avaliados em 6,0 mg de O2.L-1 e em hipoxia a 0,5 mg de O2.L-1 por 42 horas . Para os ensaios de hiperoxia os animais foram avaliados em 6,0 mg de O2.L-1, depois de 6 horas em 9,5 mg de O2.L-1 e depois de 30 horas de recuperação a 6,0 mg de O2.L-1. A utilização de materiais para o cateterismo de humanos permitiu a implantação de um acesso branquial. Infelizmente, houve formação de trombo após 24 horas. Mesmo assim, a observação de fluxo sanguíneo no interior da cânula e a sobrevida dos animais testados, confirmam a viabilidade da técnica. Verificamos em sangue uma maior atividade da enzima glutationa S-transferase (GST) sobre o 4-HNE em relação ao 1-cloro-2-dinitrobenzeno (CDNB). Isto reflete a importância de avaliações de atividade de enzimas, como a GST, sobre substratos endógenos. As respostas enzimáticas de tilápias mostraram-se mais sensíveis que as dos pacus quando comparadas em diferentes tensões de oxigênio.

Efeito protetor do extrato hidroalcoólico de Euterpe oleracea Mart. (Açaí) nas alterações renais, cardiovasculares e metabólicas induzidas pela restrição protéica materna durante a gestação

Alguns trabalhos demonstraram que a planta, Euterpe oleracea Mart. (açaí) é rica em polifenóis e que uma dieta rica em polifenóis pode estar envolvida na proteção contra o risco cardiovascular. Desta forma, o objetivo deste estudo foi avaliar o efeito do tratamento com o extrato hidroalcoólico do caroço do açaí (ASE) (200mg/Kg/dia), sobre as alterações renais, cardiovasculares, metabólicas, morfológicas e o estresse oxidativo na prole adulta com dezesseis semanas, cujas mães foram submetidas a uma dieta hipoprotéica durante a gestação. Quatro grupos de ratas foram alimentados com dietas experimentais: controle (20% de proteínas); controle + ASE (20% de proteína + ASE); hipoprotéica (6% de proteína); hipoprotéica + ASE (6% de proteína + ASE) durante a gestação. Após o desmame, todos os filhotes passaram a ser alimentados com uma dieta controle e foram sacrificados com 4 meses de idade. A pressão arterial sistólica (PAS) foi medida por pletismografia de cauda e o efeito vasodilatador da acetilcolina (ACh) e nitroglicerina (NG) foi avaliado em leito arterial mesentérico (LAM) perfundido. Foram determinados o peso corporal, níveis séricos de colesterol total, triglicerídeos, lipoproteína de alta densidade (HDL), albumina, uréia, creatinina, glicose, insulina, resistência à insulina (índice de Homa IR), sódio, potássio e a renina plasmática. Foi avaliada a depuração de creatinina, volume de urina, excreção fracionada de sódio (EFNa) e o número de glomérulos renais. O dano oxidativo, níveis de nitrito e a atividade das enzimas antioxidantes: superóxido dismutase, catalase e glutationa peroxidase foram dosados no plasma e homogenato de rim. O peso corporal foi menor no grupo hipoprotéico e recuperado com ASE. A PAS foi aumentada no grupo hipoprotéico e revertida pelo tratamento com ASE. Os níveis de renina plasmática foram aumentados no grupo hipoprotéico e reduzidos com ASE. A resposta vasodilatadora à ACh em LAM estava reduzida no grupo hipoprotéico com ASE houve uma melhora dessa resposta.O efeito vasodilatador da NG não foi diferente entre os grupos. No grupo hipoprotéico também foi observado o aumento dos níveis de triglicerídeos, colesterol total, uréia, creatinina, glicose e insulina, os mesmos foram reduzidos pelo ASE. Não houve diferença nos níveis de HDL, sódio, potássio, depuração de creatinina e volume urinário nos grupos estudados. Os níveis de malondialdeído e carbonilação de proteínas estavam aumentados e os níveis de nitrito reduzidos no grupo hipoprotéico e foram revertidos pelo ASE. As atividades das enzimas antioxidantes no plasma e no rim foram reduzidas no grupo hipoprotéico e aumentadas pelo ASE, com exceção da catalase que não apresentou diferença entre os grupos. Os animais hipoprotéicos apresentaram redução no número de glomérulos renais e aumento da EFNa e o tratamento com ASE preveniu as alterações renais encontradas neste modelo. Em conclusão, o ASE parece proteger a prole, cujas mães foram expostas a uma dieta com pouca proteína durante a gestação, através do efeito anti-hipertensivo, vasodilatador e antioxidante observado neste trabalho.

小麦肉桂酰辅酶A还原酶（CCR）基因的分离和功能分析

作为植物界广泛存在的一类酚类聚合物，木质素是陆生植物正常生长发育过程中非常重要的生物大分子，而且与人类的生活息息相关。利用分子生物学手段和基因工程方法，从小麦中分离木质素生物合成途径的关键酶-肉桂酰辅酶A还原酶基因（CCR），研究肉桂酰辅酶A还原酶基因在木质素代谢途径中的调控规律，从其催化的限速步骤入手，来调控木质素的合成，有效的改变木质素的组成、含量和结构，是改善木质素在植物生长发育中的作用乃至开发木质素资源的关键所在。本文就小麦肉桂酰辅酶A还原酶基因的分离、表达特征及其在木质素合成途径中的作用开展了研究工作。 首先用RACE方法从小麦中克隆了CCR的两个cDNA的部分序列，序列分析表明它们编码的蛋白具有CCR的典型特点，GC含量高于均60%，两者在核酸水平和蛋白水平的同源性为76%和 69%，证明在小麦中至少存在着两个CCR基因。通过 RT-PCR和Northern 杂交确定W-cr6和W-cr19在小麦的发育中具有不同的表达特征，W-cr6主要在茎中表达，而W-cr19的表达集中在根中。以W-cr6为探针，从cDNA文库中筛选到一个全长1317bp的cDNA，命名为TaCCR1。TaCCR1包括开放阅读框 (ORF) 1047bp、5′端侧翼 72bp和3′端侧翼198bp的非翻译序列。TaCCR1能够编码由349个氨基酸组成的蛋白质，预期的分子量为37.4kD。同源性比较显示TaCCR1基因在核酸水平和蛋白质水平与其他物种的CCR基因的同源性高于60%。 为了分析CCR在木质素合成中的作用，用TaCCR1构建了用于转化烟草的正义和反义表达载体pStCCR和pAtCCR、用于转化小麦的正义和反义表达载体pBSC1和pBAC1。通过农杆菌介导得到了30株反义转基因烟草和12株正义转基因烟草。由于外源基因的抑制作用，转基因烟草在形态、木质素组成和含量、木质部显微结构上都程度不同的发生了变化。正义和反义的转基因株系呈现出株型矮化、木质素含量下降、木质部导管细胞壁受到破坏等现象。同时利用花粉管通道法转化小麦种子5000多粒，部分处理经过初步的PCR和 Southern分子鉴定获得了1株转基因株系，需要对其遗传、生理和形态特征做进一步的研究。 本文还对木质素对小麦茎杆的机械强度的影响做了初步的探讨，得到的结果是小麦茎杆的木质素含量、维管束的数量、茎杆有效的横界面积与其最大弯曲应力存在着正相关，而维管束的结构、密度对茎杆的最大弯曲应力没有明显的影响，从而为通过CCR基因来改善小麦茎杆的抗倒特性建立了生理学基础。

无根萍生物学特性研究

无根萍属（Wolffia ）隶属于浮萍科天南星目，是世界上最小的被子植物。该属植物繁殖速度快;易于培养;结构简单，只具有一个雄蕊和一个雌蕊;自然状态下通常为克隆繁殖，遗传结构高度一致，具备特定研究目的模式植物的特点，正在或已经成为一些实验室研究光合作用、生物反应器、毒理学、生态修复和环境监测等的重要模式生物材料;同时还被作为建造航天生活仓和地外生命支撑系统的首选植物。该属植物蛋白含量高且氨基酸组分平衡，营养价值可与大豆相媲美。但该属植物一直是分类学界的疑难类群，不同的学者对该属的分类处理比较混乱;其次，对该属的生物地理研究也很不够，尤其是对国产类群的研究;另外，W. globosa 作为该属中国分布的物种，其生理学特性和形态结构发育还缺乏研究。为此，本文通过mat K 基因测序、RAPD 标记等手段，结合野外和室内的长期观测，对其分类和中国的地理分布以及生理学特性进行了研究。针对浮萍科植物作为水生植物，其对重金属和芳香烃衍生物的耐受逆境能力大小，和对淡水水体环境生态的指示作用。本文研究了W. globosa 具解毒功能的谷胱甘肽转硫酶的活性;最后，探索了从黄鳝（Monpterus albus Zuiew ）中分离纯化GSTs 的技术与方法并对maGST 的部分特性进行了研究。主要研究结果如下： 1. Wolffia 系统分类学研究 前人认为，Wolffia 柱头的颜色是重要的分组、分种检索性状。我们对其长期、活体、原位、实时跟踪观测结果表明，柱头颜色是Wolffia 个体发育上的变化过程，不是一个稳定性状，用作Wolffia subgroup 内组的划分特征和种的鉴别特征是不适合的。在此基础上我们重新修定了该属的分种检索表。利用形态分类学性状——气孔、长/宽、高/宽以及最大宽度在水面上还是水面下等性状，认为中国分布的类群应是W. globosa，但亦有W. neglecta 存在的证据。mat K 基因片段结果支持形态学的结论。通过广泛的野外采集，在我国北京、河北和吉林发现Wolffia 的新分布。 2. 中国Wolffia 居群遗传学研究 以RAPD 分子标记对广泛分布的居群遗传多样性研究表明，无根萍属植物主要以无性繁殖方式繁育，居群主要由单一克隆后代组成，如海河流域以及松花江流域居群;但一些居群亦兼有性繁殖方式，并具较高的遗传多样性，如武汉、海南居群。利用MVSP, Popgene 和Ntsys 等分析方法探讨了中国产Wolffia 居群遗传多样性和地理分布格局间关系。 3. W. globosa 的生理学研究 建立了较为完善的W. globosa 的无菌培养和保存体系。W. globosa 在逆境中，会形成休眠体;同时，发现不同居群甚至不同克隆系之间其抗逆性和生长速度存在着显著差异，差异最大的如海南文昌居群的生长速率，是长春居群的4.19 倍;不同的时间统计生长周期存在着不同结果，生长节律每天有两个生长高峰呈双“S”型;W. globosa 的耐受温度范围和pH 范围广;低浓度的IAA，GA，6-BA， EDDHA-Fe 以及EDTA 等物质具有促进W. globosa 生长的特性;但是，所有这些处理均没能促使W. globosa 从营养生长转入生殖生长。 4. W. globosa 的解剖学研究 W. globosa 通常是进行克隆繁殖，通过组织切片发现无性分枝子体还未伸出母株之前就已经完成分化，与此同时分枝子体中又分化出新的子体，分枝呈聚伞状，子体生长方向彼此相对;另外，生殖生长结构的分化也是在母体中完成的;生殖生长点与营养生长点不是同一生长点。 5. 浮萍科植物的毒理学研究 以重金属Cr3+和芳香烃衍生物CDNB 溶液处理Wolffia，Spirodela 和Lemna， 三种水生生物，结果表明Wolffia 比Spirodela， Lemna 对重金属和芳香烃衍生物有更强的抗逆能力，如在同等条件下对于Cr3+Wolffia 的半致死剂量800GB(≈ 80mg/L)，而Spirodela 和Lemna 则分别为10mg/L;20mg/L;表明W. globosa 是一个优良的生态环境修复植物。与此同时，研究了W. globosa 中具有解毒功能的GSTs 粗酶液活力在不同浓度的重金属离子（Cu2+和Cd2+）以及芳香烃衍生物（CDNB 和NBD-Cl）随处理时间的变化情况。 6. 从水生生物黄鳝Monpterus albus Zuiew 中分离纯化GSTs 的研究GSTs 活性的变化是环境监测的一个Biomarker，为此研究从M. albus 中分离 纯化GSTs 的技术与方法。经GSH 亲和层析纯化的酶活力为粗酶液的207 倍，进而鉴定了maGST 的部分特性。SDS-PAGE 电泳和MALDI-TOF/MS 表明MaGST 为同源二聚体，分子量约为52kDa，单亚基分子量约为26 kDa。maGST 酶动力学表明对CDNB 为13.07 ± 0.37 微摩尔每分钟每毫克蛋白;对NBD-Cl 为5.54 ± 微摩尔每分钟每毫克蛋白;对ECA、4-NPA 几乎没有活性。在GSH 底物饱和，CDNB 的Km 值和Vmax 分别为0.32 mM 和16.19 微摩尔每分钟每毫克蛋白;CDNB 底物饱和，GSH 的Km 值和Vmax 分别为0.44 mM 和28.83 微摩尔每分钟每毫克蛋白。maGST 的酶活性pH 值较宽，温度范围广：在pH7.0-7.5 具有最大速度，在pH6.5 和pH8.5 时分别具有65%和72%的酶活力;在45℃时具有最大活性，30℃和55℃时为最大活力的80%，60℃几乎完全丧失酶活力。

水稻Phi类谷胱甘肽转移酶基因家族的功能分化研究

在植物中大多数功能基因是以基因家族的形式存在的，而基因重复则是基因家族的一种重要的进化方式。很多基因往往是由重复事件产生形成不同的拷贝，进而分化形成基因家族。谷胱甘肽转移酶（GSTs）是一类古老、庞大、行使解毒、抗逆、信号转导等多种功能的一个基因家族。本研究以栽培水稻（Oryza sativa ssp. japonica c.v. Nipponbare）为研究材料，以栽培水稻的Phi类GST的5个基因（OsGSTF3、OsGSTF6、OsGSTF14、OsGSTF15、OsGSTF16）为研究对象，分析了它们的系统发生和起源历史、不同组织的差异性表达、编码蛋白质的功能差异等问题，探讨了基因重复后5个基因的功能变化，主要结果如下： 1. OsGSTF3、OsGSTF14、OsGSTF15、OsGSTF16由串联重复产生，而OsGSTF6则由DNA转座产生;它们起源时间早在稻属（Oryza）分化之前。 2. 对水稻不同部位组织的RT-PCR结果表明这5个基因在水稻中的特异性表达组织部位有较大差异：OsGSTF3基因在叶、叶鞘、茎、根4个部位均有大量表达;OsGSTF6基因仅在叶中有表达;OsGSTF14基因在叶鞘、茎2个部位中有表达;OsGSTF15基因在茎、根2个部位中有表达;OsGSTF16则在叶、茎、根3个部位中有表达。 3. 将这5个基因连接原核表达载体PET30a并转化大肠杆菌BL21（DE3），获得了高表达菌株。将表达菌株进行大量表达，表达形式分析显示OsGSTF3蛋白是可溶性表达，而其余4个蛋白以包涵体的形式表达。通过亲和层析获得了纯化的OsGSTF3融合蛋白，OsGSTF3融合蛋白对底物CDNB和NBD-Cl具有高活性，酶动力学分析显示OsGSTF3融合蛋白对GSH与NBD-Cl有较高的亲和力，热力学分析显示该蛋白在40℃以下是热稳定的。通过对包涵体进行洗涤、亲和层析获得了纯化的OsGSTF6、OsGSTF14、OsGSTF15、OsGSTF16的融合蛋白，OsGSTF14融合蛋白对NBD-Cl有微弱活性，OsGSTF15融合蛋白对NBC有较高的活性，而没有检测到OsGSTF6与OsGSTF16融合蛋白的活性。

Liver genomic responses to ciguatoxin: evidence for activation of Phase I and Phase II detoxification pathways following an acute hypothermic response in mice

Ciguatoxins (CTX) are polyether neurotoxins that target voltage-gated sodium channels and are responsible for ciguatera, the most common fish-borne food poisoning in humans. This study characterizes the global transcriptional response of mouse liver to a symptomatic dose (0.26 ng/g) of the highly potent Pacific ciguatoxin-1 (P-CTX-1). At 1 h post-exposure 2.4% of features on a 44K whole genome array were differentially expressed (p ≤ 0.0001), increasing to 5.2% at 4 h and decreasing to 1.4% by 24 h post-CTX exposure. Data were filtered (|fold change| ≥ 1.5 and p ≤ 0.0001 in at least one time point) and a trend set of 1550 genes were used for further analysis. Early gene expression was likely influenced prominently by an acute 4°C decline in core body temperature by 1 h, which resolved by 8 h following exposure. An initial downregulation of 32 different solute carriers, many involved in sodium transport, was observed. Differential gene expression in pathways involving eicosanoid biosynthesis and cholesterol homeostasis was also noted. Cytochrome P450s (Cyps) were of particular interest due to their role in xenobiotic metabolism. Twenty-seven genes, mostly members of Cyp2 and Cyp4 families, showed significant changes in expression. Many Cyps underwent an initial downregulation at 1 h but were quickly and strongly upregulated at 4 and 24 h post-exposure. In addition to Cyps, increases in several glutathione S-transferases were observed, an indication that both phase I and phase II metabolic reactions are involved in the hepatic response to CTX in mice.

转基因植物生产生物可降解塑料PHB的研究-phbA功能鉴定、多价表达载体的构建及转基因植物的获得

聚-β-羟基链烷酸（PHA）是许多微生物作为碳源、能源的一类贮藏性聚酯，具有广泛的应用价值。该聚酯可被微生物完全降解且有与塑料相似的性质，因而研究并提高PHA在植物中的合成为解决环境污染提供了新的解决途径。 聚-β-羟基于酸酯（PHB）是研究的最早、研究的最清楚的一种PHA。用聚合酶链式反应扩增并克隆了真养产碱杆菌（Alcaligenes eutrophus）中合成PHB的一个关键酶——3-酮硫裂解酶基因phbA。DNA序列分析表明所克隆的基因与国外报道序列同源性很高，只有一个碱基对的区别。为了检测该基因的功能及导肽的定位效率，构建了带有导肽基因的组成型表达载体，由根癌农杆菌介导转化烟草（Nicotiana tabacum cv. Wisconsin 38）得到转基因植株。蛋白质电泳结果表明导肽可以将外源蛋白定位于质体，phbA基因能翻译成相应大小的蛋白。酶活性分析证实了转基因烟草中phbA编码的3-酮硫裂解酶可以催化乙酰-CoA合成乙酰乙酰-CoA。 将携有导肽序列的phbC（编码PHB合酶）和phbB（编码乙酰乙酰-CoA还原酶）连入pBIB-HYG得到组成型表达载体pZCB，用冻融法转入根癌农杆菌，介导转化烟草。烟草为已获得的具有卡那霉素抗性整合并表达phbA的转基因烟草。通过二次转化将携有潮霉素抗性的phbB基因和phbC基因导入已整合phbA的烟草，各基因均由质体导肽控制，最后得到整合PHB合成的三个酶基因的转基因烟草。转基因烟草经PCR、PCR-Southern检测，初步确定整合phbB和phbC烟草植株。以气相色谱初步分析，转基因烟草中PHB的含量可达鲜重的0.233%。 结果表明phbB和phbC基因可以在真核表达系统中编码相应的蛋白。通过色素分析、荧光动力学等手段分析了PHB在叶绿体中的累积对其功能的影响。 为了提高底物乙酰-CoA的供应能力及减少惰性聚酯对植物体的伤害，分离了种子特异性启动子和质体导肽序列，利用忆经克隆的合成PHB的三个关键酶基因，通过一系列DNA重组，分别构建了含有种子特异性启动子的嵌合phbC、phbB的二价表达载体pSCB及嵌合phbC、phbA、phbB的三价表达载体pSCAB，并由导肽将基因表达产物定位于质体。经根癌农杆菌介导转化油菜（Brassica napus L.) H165，获得转基因油菜植株，并进行了PCR、Southern blot及RT-PCR-DNA杂交等分检测。结果表明，三基因已经分别整合到相应的转基因油菜中，并已在转录水平表达。同时转化了油菜不育系、恢复系和保持系，获得批量转化株，并移入温室栽培。

烟草FtsZ基因的表达特征分析及其对质体发生的影响

FtsZ (filamentation temperature-sensitive，fts)是广泛存在于原核生物和高等植物中的一种功能蛋白。它控制着原核细胞和质体的分裂过程。研究该基因的表达调控特征，为我们进一步认识原核细胞和质体分裂的分子机制及真核细胞的起源和进化等重要问题提供了新的思路。从烟草克隆FtsZ cDNA，构建了谷胱甘肽转移酶（GST, glutathione S-transferase，EC 2.5.1.18）与FtsZ融合蛋白的表达质粒，并将其导入到在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导下能高效表达的JM109大肠杆菌中。高表达的融合蛋白通过谷胱甘肽一琼脂糖(glutathione-agarose)亲和层析和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化后，用以免疫兔子制备抗血清。免疫印迹法表明烟草FtsZ基因表达具有明显的组织器官特征，在质体（叶绿体）分裂活跃部位表达强：幼嫩花瓣>幼叶>幼根>老叶>茎。黑暗处理l天对FtsZ表达似乎无影响，随黑暗培养时间延长，FtsZ蛋白表达逐渐降低，叶绿体转化成为数目众多（增加2-3倍）体积小的淡黄色或白色质体。该实验结果显示，光对植物FtsZ基因表达很可能无直接影响，FtsZ基因表达强弱是决定质体（叶绿体）分裂和细胞中质体（叶绿体）数目多少的主要原因之一。