Complete mitochondrial genome of the Asian paddle crab Charybdis japonica (Crustacea: Decapoda: Portunidae): gene rearrangement of the marine brachyurans and phylogenetic considerations of the decapods

Given the commercial and ecological importance of the Asian paddle crab, Charybdis japonica, there is a clearly need for genetic and molecular research on this species. Here, we present the complete mitochondrial genome sequence of C. japonica, determined by the long-polymerase chain reaction and primer walking sequencing method. The entire genome is 15,738 bp in length, encoding a standard set of 13 protein-coding genes, two ribosomal RNA genes, and 22 transfer RNA genes, plus the putative control region, which is typical for metazoans. The total A+T content of the genome is 69.2%, lower than the other brachyuran crabs except for Callinectes sapidus. The gene order is identical to the published marine brachyurans and differs from the ancestral pancrustacean order by only the position of the tRNA (His) gene. Phylogenetic analyses using the concatenated nucleotide and amino acid sequences of 13 protein-coding genes strongly support the monophyly of Dendrobranchiata and Pleocyemata, which is consistent with the previous taxonomic classification. However, the systematic status of Charybdis within subfamily Thalamitinae of family Portunidae is not supported. C. japonica, as the first species of Charybdis with complete mitochondrial genome available, will provide important information on both genomics and molecular ecology of the group.

Molecular cloning, characterization and evolutionary analysis of phytoene desaturase (PDS) gene from Haematococcus pluvialis

Phytoene desaturase is one of the most important enzymes necessary for the biosynthesis of carotenoids in some cyanobacteria, green algae and plants. In this study, genomic DNA and cDNA of pds were cloned from unicellular green alga Haematococcus pluvialis strain323 using PCR and RT-PCR methods. The cDNA was cloned into plasmid pET-28a and efficiently expressed in Escherichia coli BL21. The complete genomic PDS gene of H. pluvialis, 3.3 kb in size, included eight exons and seven introns. To locate transcriptional regulation elements, an approximate 1 kb of 5'-flanking region was isolated by genome-walking method. Results of bioinformatic analysis showed several putative cis-elements e.g. the ABRE motif (abscisic acid responsive element), the C-repeat/DRE (dehydration responsive element) motif and the GCN4 motif were located in 5'-flanking region of pds. Results of phylogenetic analyses reveal that different sources of PDS genes form a separate clade, respectively, with 100% bootstrap support. Moreover, a maximum likelihood approach was employed to detect evidence of positive selection in the evolution of PDS genes. Results of branch-site model analysis suggest that 7.9% of sites along the green algal branch are under positive selection, and the PDS gene in green algae exhibits a different evolutionary pattern from its counterparts in cyanobacteria and plants.

扇贝大防御素和G型溶菌酶的基因克隆与重组表达

扇贝养殖是我国传统的海水养殖产业，但自1997 年以来，养殖扇贝陆续爆发的大规模死亡，不但造成了巨大的经济损失，而且严重影响了该产业的健康发展。扇贝病害的不断爆发以及病因的多样性迫切要求制定新的疾病防治措施和开发新型的抗菌物质。 从扇贝自身的免疫防御因子入手，筛选和克隆参与免疫防御的功能基因，一方面可以研究抗病功能基因在病原感染或环境胁迫条件下的表达规律，深入探讨扇贝的免疫防御机制，并可作为抗病良种选育的分子标记，指导扇贝的遗传改良和抗病品系的培育；另一方面，可对抗菌效应物实现重组表达，开发新型的病害预防治疗制剂，取代目前普遍使用的抗生素和化学药物。抗菌效应物是机体在免疫应答过程中产生的多肽类物质，对侵入生物体内的细菌、病毒具有很强的免疫杀灭作用，对抗菌效应物的研究有助于深入了解机体先天性免疫防御的机制。 本研究采用大规模EST测序方法，结合cDNA末端快速扩增（RACE）技术，从海湾扇贝血淋巴中克隆到了大防御素基因（big defensin, AiBD）的全长cDNA序列，该cDNA全长为531 bp，其中5' 非编码区（UTR）为24 bp，开放阅读框（Open Reading Frame, ORF）含有369 bp，编码122 个氨基酸残基；随后为138-bp 的3' UTR，包括一个多聚腺苷酸信号序列（AATAAA）和ploy A尾巴。分析表明，海湾扇贝大防御素是以前体的形式合成，前体分子包括信号肽、前域和成熟肽三部分。采用Northern blot方法，以DIG标记的DNA探针检测了 AiBD mRNA在不同组织中的表达。结果发现，AiBD 基因的转录本主要在血淋巴中表达，在鳃中也有微量的表达，而在外套膜、闭壳肌、性腺及肝胰腺中检测不到杂交信号。采用QRT-PCR（quantitative real time PCR）对鳗弧菌感染后海湾扇贝血淋巴中AiBD mRNA 的表达量进行了检测，结果发现在感染后8 h 内， AiBD mRNA 的相对表达量平缓升高；随着刺激时间的增长，AiBD基因的mRNA表达量急剧增加，在刺激后16 h 和32 h 分别达到了空白组的72.3 倍和131.1 倍。为了研究海湾扇贝大防御素的抗菌活性，将其成熟肽编码区克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K并实现了重组表达。抑菌实验表明，重组AiBD具有广谱的抗菌活性，其对供试的三株革兰氏阳性菌（藤黄微球菌、溶壁微球菌、金黄色葡萄球菌）都表现出显著的抗菌活性，而对革兰氏阴性菌（鳗弧菌、亮弧菌）的抑菌活性则相对较弱；此外，重组AiBD对表达宿主也表现出杀菌活性，证明其具有抗真菌活性。 根据栉孔扇贝G 型溶菌酶基因的cDNA序列，利用构建的Genome Walking 文库获得了栉孔扇贝G 型溶菌酶基因的全长序列，该基因序列全长为8131 bp，由六个外显子和五个内含子组成。六个外显子长度分别为55 bp，60 bp，90 bp，113 bp，145 bp 和140 bp；五个内含子的长度分别为1126 bp，2161 bp，2744 bp，750 bp和592 bp；内含子的两侧都具有RNA正确剪接所必需的识别位点（GT/AG）。利用TRANSFAC 软件对栉孔扇贝G 型溶菌酶基因的5' 侧翼序列分析发现，该基因的5' 侧翼具有 TATA box 和 CAAT box 的共有序列；此外，在该基因的5' 侧翼发现了C/EBP、NF-κB、OCT-1 和 NF-IL6 等参与免疫基因激活的转录因子潜在结合位点。采用Northern blot方法，以生物素标记的RNA 探针检测了栉孔扇贝G 型溶菌酶基因在不同组织中的表达。结果发现，该基因的转录本主要在鳃、性腺及肝胰腺中表达，在血细胞和外套膜中也有微量的的表达，而在闭壳肌中检测不到杂交信号，这表明栉孔扇贝G 型溶菌酶可能兼备参与机体免疫防御和消化的功能。为了研究栉孔扇贝G 型溶菌酶的抗菌活性，将其成熟肽编码区克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K并实现了重组表达。抑菌实验表明，重组产物具有显著的抗阳性菌活性，其对供试的藤黄微球菌、溶壁微球菌表现出明显的抑制作用，对金黄色葡萄球菌未检测到抑制活性；而对革兰氏阴性菌仅表现出微弱的抑菌活性（亮弧菌和鳗弧菌），对大肠杆菌则基本无抑制活性。

栉孔扇贝核心组蛋白的基因结构及H2A抗菌活性的研究

栉孔扇贝是我国传统的海水养殖品种，但自1997 年以来，养殖扇贝陆续爆发的大规模死亡，不但造成了巨大的经济损失，而且严重影响了该产业的健康发展。目前，虽然针对扇贝养殖环境、病原以及养殖技术等方面开展了大量的研究工作，提出了许多防病治病的措施，并取得了一定的成效。但由于引起养殖扇贝病害的病原和发病原因的多样性，大量使用抗菌素和农药后造成病原微生物抗药性的提高以及对环境造成的严重破坏，贝类养殖业要摆脱病害的困扰，必须开辟新的疾病防治途径。 从扇贝自身的免疫防御因子入手，筛选和克隆参与免疫防御的功能基因，尤其是一些新颖的具有抗菌活性的分子，对于深入探讨扇贝的免疫防御机制，指导扇贝的遗传改良和抗病品系的培育具有重要的意义；另一方面，可对抗菌效应物实现重组表达，开发新型的病害预防治疗制剂，取代目前普遍使用的抗生素和化学药物。抗菌效应物是机体在免疫应答过程中产生的多肽类物质，对侵入生物体内的细菌、病毒具有很强的免疫杀灭作用，对抗菌效应物的研究有助于深入了解机体先天性免疫防御的机制。 本研究在同源克隆策略的基础上，从利用构建的Genome Walking 文库中克隆到了栉孔扇贝核心组蛋白群的全长序列，该串联重复序列全长5671bp，包括各一个拷贝的组蛋白H4, H2B, H2A 和 H3。所有的核心组蛋白在3’侧翼序列均具有与其在细胞周期进化模式相关的特征结构，即两个不同的终止信号：发卡结构和至少一个多聚腺苷酸信号序列（AATAAA）。在5’区域的起始密码子上游37–45 bp处的保守的CAP位点（5’-PyCATTCPu-3’）存在于除H2B外的每一个基因中；规则的TATA 和CAAT元件也在核心组蛋白群中的个别的基因中找到。在H2B 和H2A基因的启动子区域，对于定位转录起始位点非常重要的元件（5’-GATCC-3’）也相对保守； 在H2B启动子区域存在着与其特征序列（5’-GGAATAAACGTATTC-3’）相似性很高的序列结构5’-GGATCGAAACGTTC-3’。增强子序列只发现存在于H4 和 H3基因中，其序列结构与组蛋白增强子序列(5’-TGATATATG-3’)基本匹配。在组蛋白基因群中存在着一些保守的序列和重复结构表明组蛋白基因的进化是采取“生与死的进化模 式”并伴随着强的纯化选择压力，使得该基因群变异较少以保持其基本功能。同时，利用18S rRNA做参照，探讨了H2A 和H2B作为分子系统进化分析的潜在分子标记，表明组蛋白H2A 和H2B可以作为分子系统进化分析得候选分子，它们在区分近缘种的分辨率上表现出了更高的灵敏度。该研究结果为进一步定性软体动物组蛋白重复单位提供了基础。 在脊椎动物中，组蛋白H2A通过特异性剪切其N末端产生新颖的抗菌肽的形式来参与宿主的免疫应答反应，在软体动物中是否存在同样的机制还未有研究报道。本研究利用上述克隆的H2A基因研究了其在病原胁迫下的表达变化规律并对其N末端39aa进行了重组表达和抗菌活性分析，以期为开发和利用软体动物的新颖的抗菌肽提供理论依据。半定量RT-PCR发现血细胞中H2A 的mRNA 在微生物感染前后的表达量没有任何显著的变化，表明H2A本身并不直接参与对病原的清除过程或者说病原微生物并不能诱导H2A的表达。因此，我们推测该基因可能象脊椎动物一样以前体形式存在，经剪切后参与宿主的免疫应答过程，为此我们研究了H2A的N末端的抗菌活性。通过将与脊椎动物buforin I同源的H2A的N末端39aa克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K实现了该基因N末端的重组表达。抑菌实验表明，重组产物具有广谱的抗菌活性，其对供试的革兰氏阳性菌藤黄微球菌表现出显著的抗菌活性，而对革兰氏阴性菌（鳗弧菌、亮弧菌）的抑菌活性则相对较弱；此外，重组产物对毕赤酵母GS115也表现出一定的杀菌活性，证明其具有抗真菌活性。上述研究结果证明组蛋白H2A的N末端是一种潜在的抗菌肽，但该抗菌肽是否参与机体的免疫应答过程需要进一步的深入研究。

迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda) LuxS/AI-2群体感应系统研究

从患病牙鲆中分离出迟缓爱德华氏菌株TX1，经报告菌株检测发现TX1有AI-2活性。用梯度PCR和Genome walking的方法克隆了TX1 luxS基因，将luxS基因在大肠杆菌DH5α中表达，证明其具有功能活性。在TX1中，luxS的表达与AI-2的活性基本是一致的，二者均受生长时期和生长条件的调节，即在glucose存在的条件下luxS表达和AI-2活性升高，而在高温条件下luxS表达和AI-2活性降低。glucose对AI-2活性以及luxS表达的影响经过荧光定量PCR，启动子活性检测，AI-2活性检测以及凝胶滞缓等一系列的实验证实是由cAMP-CRP复合物介导的，该复合物可以通过与luxS启动子相互作用而抑制luxS的表达。RNA干扰表明，TX1中luxS表达被干扰以后，对细菌产生了多方面的影响，包括：(1) 降低AI-2水平；(2) 降低细菌的生长能力；(3) 降低Ⅲ型分泌系统相关基因的表达水平以及生物膜的形成能力；(4) 减弱细菌毒力。外源AI-2的添加可以回复Ⅲ型分泌系统相关基因的表达水平以及生物膜的形成，但是并不能修复生长状况，表明LuxS在TX1中具有双重功能，即参与细胞代谢以及群体感应信号传导。基于LuxS/AI-2群体感应系统对细菌毒力的重要性，设计并筛选了一个该系统的阻遏因子5411。Pull-down实验证明5411可以和LuxS特异性结合。研究表明5411在TX1中表达导致细菌毒力显著下降。将5411克隆至牙鲆共生菌FP3中，发现5411可以被分泌到胞外并能被TX1吸收。将表达5411的共生菌导入牙鲆，发现其能够有效阻遏TX1对牙鲆的侵染。 这些结果表明：(1) TX1中AI-2的活性受控于LuxS，而后者则受生长时期和生长条件的调控；(2) luxS的正常表达对于细菌的正常生长和侵染是必需的；(3) LuxS/AI-2群体感应系统调控Ⅲ型分泌系统相关毒力因子的表达；(4) 通过阻遏LuxS/AI-2群体感应系统来抑制病原菌侵染是一种具有潜力的新型病害防控方法。

海湾扇贝超氧化物歧化酶家族基因结构、表达和多态性分析

海湾扇贝Argopecten irradian Lamarck于1982年从美国引种到中国，由于具有较快的生长速度和很高的经济效益，海湾扇贝成为中国最主要的养殖贝类之一。近年来海湾扇贝养殖遇到了死亡率高等问题，深入开展海湾扇贝功能基因的研究，尤其是免疫相关基因及其机制研究并在此基础上寻找扇贝疾病防治的有效方法对海湾扇贝的健康养殖十分重要。 对于贝类免疫系统来说，其血细胞在先天性免疫防御中起着重要的作用。当受到外界病原侵染时，贝类血细胞的一个重要免疫反应就是吞噬作用。在吞噬病原过程中，受到病原侵染的贝类还会产生其他多种免疫反应，这些免疫反应将消耗大量的能量（ATP），产能的呼吸链会加速运转，由此也会引发与呼吸链相耦联的活性氧（ROS）的大量产生。这些活性氧具有极强的反应特性，能破坏病原微生物的结构和功能分子，实现对入侵病原的杀灭。利用活性氧对被吞噬的病原进行杀灭，这是吞噬作用消除病原抵御侵染的重要机制。但由于活性氧分子反应的非特异性，它们也会破坏宿主机体细胞内的功能蛋白分子、不饱和脂肪酸分子和核酸等，对细胞造成严重的伤害，进而导致机体生理机能的损伤和免疫系统的破坏。所以，及时消除病原感染机体内过量产生的ROS，维持相关细胞的正常代谢，对提高机体抵抗力和免疫力具有重要的作用。O2-是生物体内产生的第一种活性氧分子，其他的活性氧分子也是由它衍生而来，消除过量O2-是消除过量活性氧危害的第一步也是关键一步。生物体内，超氧化物歧化酶（SOD）是催化O2-发生歧化反应，消除O2-的关键酶。 首先，本文通过RACE方法获得了海湾扇贝SOD家族全部三种基因的cDNA全长并对其进行了序列的生物信息学分析，海湾扇贝AiCuZnSOD全长cDNA为1047个碱基，其中开放阅读框为459个碱基，编码152个氨基酸，与栉孔扇贝Chlamys farreri的CuZnSOD相似度为77.5%，与长牡蛎Crassostrea gigas的相似度为75%，与人的相似度为74.7%。AiMnSOD全长cDNA为1207个碱基，其中开放阅读框为678个碱基，编码226个氨基酸，序列比对结果发现AiMnSOD的氨基酸序列与虾夷扇贝Mizuhopecten yessoensis和皱纹盘鲍Haliotis discus hannai的相似度分别为85%和78.4%，与哺乳动物相似度也在68%~72%之间。AiECSOD全长cDNA为893个碱基，其中开放阅读框为657个碱基，编码218个氨基酸。AiECSOD与其它物种ECSOD相似度比较低。与线虫Brugia pahangi的相似度为27.9%，与疟蚊Anopheles gambiae的相似度为31.4%，与斑马鱼Danio rerio的相似度为27.8%，与人的相似度也只有28.6%，与同是贝类的长牡蛎ECSOD也只有28.1%的相似性。主要原因是AiECSOD的信号肽和肝磷脂结合区域在各物种中无同源性。 其次，采用qRT-PCR（quantitative real time PCR）方法分析三种SOD基因在不同组织中的表达情况，结果表明三种SOD基因的组织表达有所差异。AiCuZnSOD基因在鳃中表达水平最高，其次是血细胞和性腺，在外套膜、闭壳肌和肝胰脏表达水平较低。AiMnSOD基因在鳃中表达水平最高，其次是外套膜，在血细胞、性腺，而在肝胰脏和闭壳肌表达较弱。AiECSOD基因在血细胞中表达水平最高，其次是肝胰脏，在鳃、闭壳肌表达水平较低，而性腺和外套膜没有检测到。同时，采用qRT-PCR对鳗弧菌Vibrio angullarum感染后海湾扇贝血细胞中三种SOD基因mRNA表达变化进行了检测。AiCuZnSOD表达量在各个时间段没有显著差异(P > 0.05)。AiMnSOD的表达量在1.5 h时略有下降，在3 h时达到最高表达量，是空白组（0h）的3倍(P < 0.01)，从6 h到24 h表达量逐渐下降，24 h时表达量是空白组的1.6倍，24 h到48 h又稍有升高。AiECSOD的表达量在1.5 h时有所下降，是空白组的0.3倍（P < 0.05)，随后逐渐升高，在12 h时达到最高表达量，是空白组（0h）的4.5倍（P < 0.01），从24 h到48 h表达量逐渐下降并恢复到空白组的水平。在对照组，各个时间点没有显著差异（P > 0.05）。在鳗弧菌感染后，海湾扇贝三种SOD的表达并不一致，且差异比较显著。AiCuZnSOD被认为是构成性表达基因，其受外界刺激的影响最小，AiMnSOD和AiECSOD受刺激后表达上调比较明显。 第三，采用Genome-walking的方法得到了海湾扇贝三种SOD基因的基因组全长和近端启动子序列并对其进行了相关分析。AiCuZnSOD的基因组序列全长为4279bp，包含有4个外显子和3个内含子。AiMnSOD的基因组序列全长为10692bp，包含有4个外显子和3个内含子。AiECSOD的基因组序列全长为5276bp，包含有5个外显子和4个内含子。三种基因外显子和内含子的结合处序列遵循-AT/GT-原则。我们把海湾扇贝SOD家族的三个基因的近端启动子进行了比较分析。发现三种SOD在靠近起始密码子的位置都有Oct-1结合位点。三种SOD共有的转录位点有：Oct-1、C/EBPalp、Oct2.1、Sp-1和GATA-1。AiCuZnSOD和AiMnSOD共有的转录位点有：ICSBP、Ftz、TATA-box、C/EBPbeta和Antp。AiCuZnSOD和AiECSOD共有的转录位点有：AP-1和NFκB。AiMnSOD和AiECSOD共有的转录位点有：GR和ER。AiCuZnSOD独有的位点有：SRF、YY-1和NF-1。AiMnSOD独有的位点有：HNF-1、Hb、MEB、NF-muE1、Pit-1a和Eve。AiECSOD独有的位点有：CREB、RATA-alph、Kruppel-like和AP-3。 此外，通过构建原核表达载体，本研究对AiCuZnSOD和AiECSOD基因进行了体外重组表达，并对纯化的重组蛋白进行了酶活分析。酶活分析表明，重组AiCuZnSOD蛋白有较高的酶活和稳定性。 最后，我们对海湾扇贝三种SOD基因的部分区域，包括启动子、编码区，部分内含子区域进行了SNP检测，并对SOD基因部分SNP位点多态性和鳗弧菌敏感性进行了相关分析。三种SOD基因中，我们共发现了59个SNP位点，其中AiECSOD的SNP位点最多，特别是在启动子区，AiCuZnSOD和AiMnSOD多态性较低。其中AiCuZnSOD启动子区的-1739 T-C 位点的基因型和等位基因，AiECSOD启动子区的-498 A-T和-267 G-A等位基因频率，AiECSOD的第一个外显子38 Thr-Lys的多态性在敏感和抗菌群体中存在显著差异（P < 0.05）。

除草机器人机械臂的逆向求解与控制

设计了一种基于机器视觉导航和杂草识别的除草机器人模型,该机器人能沿作物行间自主行走并能准确地识别和"清除"杂草。设计了除草机器人的机械臂除草执行系统,求取了机械臂运动学逆解,用VC++开发了控制程序。试验显示,图像处理算法所需时间少,能够适应户外自然光线在一定范围的变化,机械臂能够平稳动作并精确定位杂草目标。

轮-腿-履带复合移动机器人的研究

中国科学院沈阳自动化研究所自行研制的灵豹复合移动机器人,采用轮-腿-履带复合移动机构,构建了嵌入式控制系统,设计了模糊控制器控制机器人行走,实现了机械臂的自主联动控制。机器人运动控制更加简便,系统具备良好的适应性和运动稳定性。

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在机器人越障过程中,由于重力的影响使得机器人车体水平姿态发生变化,从而机器人自主越障变得十分困难。分析了超高压输电线路障碍物的类型,提出了一种新的双臂自主越障巡检机器人构型,该构型能够跨越输电线路上的障碍物。针对这种新构型,阐述了机器人行走夹持机构的工作原理和实现形式,着重分析研究了偏心夹持机构对保持车体水平姿态的机理。最后,通过越障实验验证了行走夹持机构的可行性。

履带腿式非结构环境移动机器人特性分析

针对非结构环境的特点 ,提出一种适用于非结构环境的新型履带腿移动机器人 .这种移动机器人结构简洁 ,实用 ,具有很好的环境适应能力 .本文主要分析该移动机器人在非结构环境下的斜坡行走、越障、跨沟、阶梯地形行走、自动复位等功能 .

仿人机器人发展现状及其腰关节的作用

仿人机器人是研究人类智能的高级平台,是综合多种学科的复杂智能机械,其研制和开发涉及到各学科、多方面问题,目前已成为机器人领域的研究热点问题之一.本文对仿人机器人目前的发展现状进行了综述,分析了多种仿人机器人的自由度分布,介绍了具有不同结构特点的腰机构,分析了腰关节在仿人机器人的稳定动态步行、全身协调运动及有情感步行等方面的重要作用.本文还指出了仿人机器人目前的主要研究方向.

智能人工腿步速测量数字电路的设计与分析

智能人工腿是一个精密的机电一体化装置，其关键部件之一是步速测量电路。作者提出一种新的步速测量方法，即测量人工腿在摆动相的持续时间，用该时间的长短来间接反映步速的快慢，设计电路时，采用自顶向下（Top-Down）的设计方法，其核心内容是将测量系统按不同功能分割成几个模块，然后分别设计每一个模块电路，最后，用1片ispLSI1016高密度可编程芯片并采用ISP（In System Program）编程方法调离同步速测量电路。ISP编程方法的优点是可以现场修改，调速测量系统电路，并且不需要仿真器装置，实验结果表明：设计的这种步速测量电路结构合理，可有效地实现对智能人工腿步速的测量。

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