Localização de mRNA em Drosophila melanogaster: estudo da proteína Ypsilon Schachtel

Dissertação apresentada para a obtenção do Grau de Mestre em Genética Molecular e Biomedicina, pela Universidade Nova de Lisboa, Faculdade de Ciências e Tecnologia

Alergia às Fórmulas de Leite Extensamente Hidrolisadas - 3 Casos Clínicos

A alergia às proteínas do leite de vaca (APLV) é a alergia alimentar mais frequente em idade pediátrica. O tratamento consiste na evicção das proteínas do leite de vaca e seus derivados, sendo habitualmente utilizadas fórmulas lácteas extensamente hidrolisadas (FEH). No entanto, mesmo estas podem conter péptidos com potencial alergénico. Apresentam-se três casos clínicos de alergia às FEH incluindo a abordagem diagnóstica e terapêutica. Três crianças, do sexo masculino, com APLV IgE mediada (testes cutâneos por prick para leite e fracções e prova de provocação positiva) diagnosticada nos primeiros meses de vida. Todas as crianças foram tratadas numa fase inicial da doença com uma FEH. Um dos casos manteve sintomas e os restantes mantiveram um periodo variável de tolerância, de alguns dias até 4 meses, após o que reiniciaram sintomas de alergia. Duas crianças apresentavam testes cutâneos positivos para as FEH. Em 2 casos foi introduzido leite de soja, como leite alternativo, com intolerância. Finalmente, nos 3 casos, iniciou-se uma fórmula láctea de aminoácidos, obtendo-se uma boa evolução clínica. As FEH nem sempre são toleradas em crianças com APLV, justificando a necessidade de outras medidas terapêuticas; nestas situações, o leite de soja não parece constituir uma alternativa adequada. Desde há poucos anos estão disponíveis em Portugal fórmulas de aminoácidos, que se revelam alternativas seguras em caso de alergia às FEH. Não são, no entanto, indicadas como terapêutica de primeira linha na APLV, uma vez que na nossa prática os casos de alergia às FEH são raros e estas fórmulas constituem uma alternativa dietética extremamente dispendiosa.

Alergia a Perceves no Contexto da Síndrome Ácaros-Crustáceos-Moluscos-Baratas

Introdução: A tropomiosina dos invertebrados é o pan-alergénio que une crustáceos, moluscos, aracnídeos, insectos e parasitas, encontrando-se significativa homologia de sequência entre as proteínas dos vários grupos. Os perceves são um tipo de crustáceo particularmente apreciado e consumido no nosso país; no entanto, a alergia a este crustáceo é uma situação bastante rara da qual só existe um trabalho publicado na literatura. Caso clínico: Apresentamos o caso de uma criança do sexo masculino, de 9 anos de idade, com asma brônquica, rinoconjuntivite alérgica e eczema atópico, sensibilizada a ácaros e baratas. Aos 7 anos, 10 minutos após a primeira ingestão de perceves, refere síndrome de alergia oral, angioedema periorbitário e rinoconjuntivite. Aos 8 anos, ocorreram 4 episódios semelhantes após ingestão de caracol, camarão, lula e choco (referindo ingestão prévia destes alimentos sem queixas). Aos 9 anos, refere episódio de urticária da face e angioedema periorbitário com inalação de vapores de cozedura de camarão. Foram realizados testes cutâneos por prick que se revelaram positivos para perceves, camarão, caracol, lula, choco, polvo e amêijoa em natureza, e para gamba, caranguejo e mexilhão com extractos comerciais. Os doseamentos de IgE específica sérica revelaram-se positivos para camarão, caracol, lula, polvo e amêijoa, bem como para perceves e tropomiosina recombinante. Foi efectuado SDS-PAGE immunoblotting com extracto de perceves que revelou várias fracções alergénicas com grande variação de pesos moleculares (19-88 kDa); foi ainda efectuado estudo de inibição com D. pteronyssinus, que inibiu várias fracções fixadoras de IgE no extracto de perceves. Discussão: Apresenta-se um caso raro de uma criança, com quadro de alergia respiratória associada a sensibilização a ácaros e baratas, com alergia alimentar a crustáceos –incluindo a perceves – e moluscos gastrópodes, bivalves e cefalópodes. Foram caracterizados os alergénios implicados na alergia a perceves e demonstrada a presença da tropomiosina como alergénio implicado, bem como a reactividade cruzada entre estes crustáceos e os ácaros.

Deficiência de Factor C3 – Um Caso Clínico

O sistema do complemento é um componente essencial do sistema imunitário inato, pelo que as deficiências de proteínas da sua complexa cascata podem ter consequências mais ou menos graves, de acordo com a importância do factor afectado. As complicações mais usuais das deficiências do complemento são infecções recorrentes a bactérias encapsuladas e distúrbios autoimunes. Os autores apresentam um caso clínico de deficiência do factor C3, situação extremamente rara, discutindo a fisiopatologia, apresentação clínica, investigação laboratorial e abordagem terapêutica.

Valorização da Borra de Café: Otimização da Produção de Biodiesel por Catálise Enzimática

O decréscimo das reservas de petróleo e as consequências ambientais resultantes do recurso a combustíveis fósseis nos motores a diesel têm levado à procura de combustíveis alternativos. Esta pesquisa alicerçada nas fontes de energia renovável tornou-se essencial, face à crescente procura de energia e ao limitado fornecimento de combustíveis fósseis . Resíduos de óleo de cozinha, gordura animal, entre outros resíduos de origem biológica, tais como a borra de café, são exemplos de matérias-primas para a produção de biodiesel. A sua valorização tem interesse quer pela perspetiva ambiental, quer pela económica, pois aumenta não só a flexibilidade e diversificação das matérias-primas, mas também contribui para uma estabilidade de custos e alteração nas políticas agrícolas e de uso do solo. É neste contexto que se enquadra o biodiesel e a borra de café, pretendendo-se aqui efetuar o estudo da produção, à escala laboratorial, de biodiesel a partir da borra de café, por transesterificação enzimática, visando a procura das melhores condições reacionais. Iniciando-se com a caracterização da borra de café, foram avaliados antes e após a extração do óleo da borra de café, diversos parâmetros, de entre os quais se destacam: o teor de humidade (16,97% e 6,79%), teor de cinzas (1,91 e 1,57%), teor de azoto (1,71 e 2,30%), teor de proteínas (10,7 e 14,4%), teor de carbono (70,2 e 71,7%), teor de celulose bruta (14,77 e 18,48%), teor de lenhina (31,03% e 30,97%) e poder calorifico superior (19,5 MJ/kg e 19,9 MJ/kg). Sumariamente, constatou-se que os valores da maioria dos parâmetros não difere substancialmente dos valores encontrados na literatura, tendo sido evidenciado o potencial da utilização desta biomassa, como fonte calorifica para queima e geração de energia. Sendo a caracterização do óleo extraído da borra de café um dos objetivos antecedentes à produção do biodiesel, pretendeu-se avaliar os diferentes parâmetros mais significativos. No que diz respeito à caracterização do óleo extraído, distingue-se a sua viscosidade cinemática (38,04 mm2/s), densidade 0,9032 g/cm3, poder calorífico de 37,9 kcal/kg, índice de iodo igual a 63,0 gI2/ 100 g óleo, o teor de água do óleo foi de 0,15 %, o índice de acidez igual a 44,8 mg KOH/g óleo, ponto de inflamação superior a 120 ºC e teor em ácidos gordos de 82,8%. Inicialmente foram efetuados ensaios preliminares, a fim de selecionar a lipase (Lipase RMIM, TL 100L e CALB L) e álcool (metanol ou etanol puros) mais adequados à produção de biodiesel, pelo que o rendimento de 83,5% foi obtido através da transesterificação mediada pela lipase RMIM, utilizando como álcool o etanol. Sendo outro dos objetivos a otimização do processo de transesterificação enzimática, através de um desenho composto central a três variáveis (razão molar etanol: óleo, concentração de enzima e temperatura), recorrendo ao software JMP 8.0, determinou-se como melhores condições, uma razão molar etanol: óleo 5:1, adição de 4,5% (m/m) de enzima e uma temperatura de 45 ºC, que conduziram a um rendimento experimental equivalente a 96,7 % e teor de ésteres 87,6%. Nestas condições, o rendimento teórico foi de 99,98%. Procurou-se ainda estudar o efeito da adição de água ao etanol, isto é, o efeito da variação da concentração do etanol pela adição de água, para teores de etanol de 92%, 85% e 75%. Verificou-se que até 92% decorreu um aumento da transesterificação (97,2%) para um teor de ésteres de (92,2%), pelo que para teores superiores de água adicionada (75% e 85%) ocorreu um decréscimo no teor final em ésteres (77,2% e 89,9%) e no rendimento da reação (84,3% e 91,9%). Isto indica a ocorrência da reação de hidrólise em maior extensão, que leva ao desvio do equilíbrio no sentido contrário à reação de formação dos produtos, isto é, dos ésteres. Finalmente, relativamente aos custos associados ao processo de produção de biodiesel, foram estimados para o conjunto de 27 ensaios realizados neste trabalho, e que corresponderam a 767,4 g de biodiesel produzido, sendo o custo dos reagentes superior ao custo energético, de 156,16 € e 126,02 €, respetivamente. Naturalmente que não esperamos que, a nível industrial os custos sejam desta ordem de grandeza, tanto mais que há economia de escala e que as enzimas utilizadas no processo deveriam ser reutilizadas diversas vezes.

Tratamento da Co-Infecção do Vírus da Hepatite B e C. Resposta Excedida

Os vírus da hepatite B (VHB) e da hepatite C (VHC) constituem a causa mais frequente de doença hepática crónica. A partilha de vias de transmissão contribui para o risco de coinfecção VHB-VHC. Nos doentes co-infectados com o VHB e VHC verifica-se uma progressão mais rápida para a cirrose hepática e existe um risco aumentado para o carcinoma hepatocelular. A terapêutica da co-infecção VHB/VHC é empírica, consistindo na indicada para a infecção exclusiva pelo VHC, o qual, na maioria dos casos, é o vírus dominante. A utilização do tratamento padrão para a hepatite C, nomeadamente interferão alfa peguilado e ribavirina, não mostra diferenças significativas na resposta virológica sustentada ao VHC comparativamente com a dos monoinfectados pelo VHC. É incerto o benefício da associação de análogos dos nucleós(t)idos. A acção terapêutica pode modificar a interacção entre os dois vírus e, designadamente, exacerbar a doença por reactivação do VHB. Os autores apresentam o caso clínico de uma doente com co-infecção VHB-VHC, sem reconhecimento de vírus dominante, em que a resposta à terapêutica instituída superou a expectativa da evidência científica disponível.

Produção de DNases extracelulares em estirpes de Streptococcus agalactiae de origem humana e bovina

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Genética Molecular e Biomedicina

Caracterização do perfil de expressão de microRNAs na miocardiopatia hipertrófica

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Genética Molecular e Biomedicina

Expressão em Escherichia coli de antigénios do Cell fusing agent virus (Flaviviridae: Flavivirus) como proteína de fusão

RESUMO: O Cell Fusing Agent Vírus (CFAV), considerado como o primeiro “flavivírus específicos de insectos” (ISF), parece estar exclusivamente adaptado aos seus hospedeiros, não replicando em células de vertebrados. Apesar de ter sido identificado há mais de três décadas (1975), a verdade é que muito pouco se conhece sobre a sua biologia. Dado o seu parentesco filogenético com alguns outros flavivírus encontrados naturalmente em mosquitos de diferentes géneros colhidos em diferentes regiões do globo, este vírus poderá ser usado como modelo para o estudo de ISF. No entanto, necessitam do desenvolvimento de ferramentas básicas, tais como clones moleculares ou baterias de soros contendo anticorpos que reconheçam uma ou mais proteínas codificadas pelo genoma viral, produzidas, por exemplo, a partir de antigénios virais produzidos de forma recombinante. Com este trabalho pretendeu-se a optimização de protocolos que permitiram a expressão e purificação parcial de quatro proteínas [duas proteínas estruturais (C e E) e duas não estruturais (NS3hel e NS5B)] do CFAV em E. coli, todas elas produzidas como proteínas de fusão com “caudas” (tags) de hexahistidina nos seus extremos carboxilo. Para a expansão do CFAV foram utilizadas células Aedes albopictus (C6/36). Após a realização da extracção do RNA viral e a obtenção de cDNA, procedeu-se amplificação, por RT-PCR, das regiões codificantes das proteínas C, E, NS3hel e NS5B, utilizando primers específicos. Os quatro fragmentos de DNA foram independentemente inseridos no vector pJTE1.2/blunt usando E. coli NovaBlue como hospedeira de clonagem e, posteriormente, inseridos em vectores de expressão pET-28b e pET-29b usando E. coli BL21(DE3)pLysS e Rosetta(DE3)pLysS como hospedeiras de expressão. Após da indução, expressão e purificação das proteínas recombinantes C, E, NS3hel e NS5B, foi confirmada a autenticidade destas proteínas produzidas através do método Western Blot com um anticorpo anti-histidina. --------- ABSTRACT: The Cell Fusing Agent virus (CFAV) considered as the first "insect- specific flavivirus" (ISF) and seems to be uniquely adapted to their hosts, not replicating in vertebrate cells. Although it has been known for more than three decades (1975), the truth is very little is known about its biology. Given its close phylogenetic relationship with other flavivirus naturally circulating in various genera of mosquitoes collected from different regions of the globe, this virus could be used as a model for the study of ISF. However, such studies require the development of experimental basic tools, such as molecular clones or serum batteries containing antibodies that recognize one or more proteins encoded by the viral genome, produced, for example, from viral antigens recombinant produced. In this work, we carried out the optimization of protocols that allowed the expression and partial purification of four proteins [two structural proteins (C and E) and two nonstructural proteins (NS3hel and NS5B)] CFAV in E. coli as fusion protein for c-terminal hexahistidine tags. For the expansion of the CFAV we used Aedes albopictus (C6/36) cells. After completion of the viral RNA extraction and cDNA obtained, amplification of the coding regions of the C, E, NS5B and NS3hel proteins was carried out by RT-PCR using specific primers. The four DNA fragments were independently inserted into the vector pJTE1.2/blunt using E. coli NovaBlue as cloning host and then inserted into expression vectors pET-28b and pET-29b using E. coli BL21(DE3)pLysS and Rosetta(DE3)pLysS as expression host. After induction, expression and purification of recombinant C, E, NS3hel and NS5B proteins Western Blot analyses with an anti-histidine antibody confirmed the authenticity of these proteins produced.

Evidence for Nevirapine Bioactivation in Man: Searching for the First Step in the Mechanism of Nevirapine Toxicity

Despite its efficacy, including in the prevention of vertical transmission, the antiretroviral nevirapine is associated with severe idiosyncratic hepatotoxicity and skin rash. The mechanisms underlying nevirapine toxicity are not fully understood, but drug bioactivation to reactive metabolites capable of forming stable protein adducts is thought to be involved. This hypothesis is based on the paradigm that drug reactive metabolites have the potential to bind to self-proteins, which results in drug-modified proteins being perceived as foreign by the immune system. The aim of the present work was to identify hemoglobin adducts in HIV patients as biomarkers of nevirapine haptenation upon bioactivation. The ultimate goal is to develop diagnostic methods for predicting the onset of nevirapine-induced toxic reactions. All included subjects were adults on nevirapine-containing antiretroviral therapy for at least 1month. The protocol received prior approval from the Hospital Ethics Committees and patients gave their written informed consent. Nevirapine-derived adducts with the N-terminal valine of hemoglobin were analyzed by an established liquid chromatography-electrospray ionization-tandem mass spectrometry method and characterized on the basis of retention time and mass spectrometric fragmentation pattern by comparison with adduct standards prepared synthetically. The nevirapine adducts were detected in 12/13 patient samples, and quantified in 11/12 samples (2.58±0.8 fmol/g of hemoglobin). This work represents the first evidence of nevirapine-protein adduct formation in man and confirms the ability of nevirapine to modify self-proteins, thus providing clues to the molecular mechanisms underlying nevirapine toxicity. Moreover, the possibility of assessing nevirapine-protein adduct levels has the potential to become useful for predicting the onset of nevirapine-induced adverse reactions.

Monitoring Abacavir Bioactivation in Humans: Screening for an Aldehyde Metabolite

The anti-HIV drug abacavir is associated with idiosyncratic hypersensitivity reactions and cardiotoxicity. Although the mechanism underlying abacavir-toxicity is not fully understood, drug bioactivation to reactive metabolites may be involved. This work was aimed at identifying abacavir-protein adducts in the hemoglobin of HIV patients as biomarkers of abacavir bioactivation and protein modification. The protocol received prior approval from the Hospital Ethics Committee, patients gave their written informed consent and adherence was controlled through a questionnaire. Abacavir-derived Edman adducts with the N-terminal valine of hemoglobin were analyzed by an established liquid chromatography-electrospray ionization-tandem mass spectrometry method. Abacavir-valine adducts were detected in three out of ten patients. This work represents the first evidence of abacavir-protein adduct formation in humans. The data confirm the ability of abacavir to modify self-proteins and suggest that the molecular mechanism(s) of some abacavir-induced adverse reactions may require bioactivation.

Desenvolvimento de um bio-sensor baseado num polímero piezoeléctrico

Dissertação apresentada na Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa para obtenção do grau de Mestre em Instrumentação, Manutenção Industrial e Qualidade

Mecanismo de ação dos sulfamídicos de ação retardada

O autor apresenta uma revisão sôbre o mecanismo de ação dos sulfamídicos de ação prolongada, tecendo considerações sôbre a sua distribuição no organismo e sua atividade antibacteriana. Aprecia principalmente as características farmacodinâmicas da sulfametoxipirazina considerando-a superior aos demais sulfamídicos ensaiados, devido à sua lenta eliminação e à sua reduzida ligação às proteínas plasmáticas, características que, aliadas à sua pequena toxicidade e atividade bacteriana elevada, permitem o seu emprego terapêutico em doses baixas.

Rendimento dos meios seletivos para bactérias do gênero Fusobacterium

Meios seletivos para Fusobacterium foram, comparados no aspecto de sua eficiência no isolamento dos microrganismos fusiformes e quanto à inibição da flora concomitante. Material não calcificado do sulco gengival foi homogeneizado e diluído em tampão de fosfato (0,067 M - pH 7,2); 0,1 ml foi semeado em agar sangue, no meio de Omata & Disraely, meio de Omata & Disraely sem sôro, meio de McMarthy & Snyder, agar sangue com vancomicina, meio de Onisi, meio de Onisi com sôro de cavalo e meio de Onisi com pH 7,0. Em todos os casos a incubação foi realizada em anaerobiose, em jarra tipo Brewer, com 95% nitrogênio e 5% gás carbônico, durante 4 dias. O meio de McCarthy & Snyder mostrou-se tão eficiente quanto o agar sangue em relação ao isolamento de Fusobacterium, ainda inibindo a flora concomitante, o meio de Omata & Disraely, com cristal violeta e estreptomicina, foi de certo modo inibidor também para Fusobacterium. O meio de Onisi, sugerido, sem sôro, possibilitou o isolamento de pequeno número de fusobactérias, provàvelmente as amostras não exigentes de proteínas naturais.

Efeito do glicerol e do telurito de potássio sôbre os grânulos metacromáticos e a morfologia do bacilo diftérico

Após ter-se salientado a importância da preservação da morfologia convencional do bacilo diftérico, para os propósitos do diagnóstico presuntivo de difteria, faz-se um estudo comparativo dos aspectos morfológicos de 10 amostras de Corynebacterium em quatro meios de uso mais comum para o isolamento dêsses germes, modificando êsses mesmos meios, em cada caso, pela inclusão de glicerol, de teluríto de potássio e de glicerol e telurito, em comparação com a fórmula original. Descreve-se uma técnica simples para a incorporação do telurito de potássio nos meios preparados por coagulação de proteínas animais (Loeffler e Pai). A apreciação da morfologia e da evidenciação de grânulos de volutina destacam o meio de Pai, com cêrca de 7 porcento de glicerol, entre 16 variações de meios de cultura estudadas, como o mais favorável para a demonstração da morfologia considerada típica no diagnóstico do bacilo diftérico.