Real time monitoring of DNA hybridization and replication using optical and acoustic biosensors

Während in den letzten Jahren zahlreiche Biosensoren zum spezifischen Nachweis von DNA entwickelt wurden, ist die Anwendung oberflächen-sensitiver Methoden auf enzymatische Reaktionen ein vergleichsweise neues Forschungsgebiet. Trotz der hohen Empfindlichkeit und der Möglichkeit zur Echtzeit-Beobachtung molekularer Prozesse, ist die Anwendung dieser Methoden nicht etabliert, da die Enzymaktivität durch die Nähe zur Oberfläche beeinträchtigt sein kann. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die enzymatische Verlängerung immobilisierter DNA durch eine DNA Polymerase mit Hilfe von Oberflächenplasmonen-Fluoreszenzspektroskopie (SPFS) und einer Quarzkristall-Mikrowaage (QCM) untersucht. Die Synthese von DNA wurde im Fall der QCM als Massenzuwachs detektiert, der sich im Abfall der Resonanzfrequenz des Schwingquarzes und einem Anstieg seiner Dissipationsenergie ausdrückte. Die viskoelastischen Eigenschaften der DNA-Schichten wurden bestimmt, indem die erhaltenen Daten mit einem auf Voigt basierenden Modell ausgewertet wurden. SPFS nutzt das evaneszente elektromagnetische Feld, das mit Oberflächenplasmonen einhergeht, zur oberflächen-sensitiven Anregung von Chromophoren. Auf diese Weise wurde der Einbau von Farbstoff-markierten Nukleotiden in die entstehende DNA-Sequenz als Indikator für das Voranschreiten der Reaktion ausgenutzt. Beide Meßtechniken konnten erfolgreich zum Nachweis der DNA-Synthese herangezogen werden, wobei die katalytische Aktivität des Enzyms vergleichbar zu der in Lösung gemessenen war.

Statistical mechanics of protein complexed and condensed DNA

In this thesis I treat various biophysical questions arising in the context of complexed / ”protein-packed” DNA and DNA in confined geometries (like in viruses or toroidal DNA condensates). Using diverse theoretical methods I consider the statistical mechanics as well as the dynamics of DNA under these conditions. In the first part of the thesis (chapter 2) I derive for the first time the single molecule ”equation of state”, i.e. the force-extension relation of a looped DNA (Eq. 2.94) by using the path integral formalism. Generalizing these results I show that the presence of elastic substructures like loops or deflections caused by anchoring boundary conditions (e.g. at the AFM tip or the mica substrate) gives rise to a significant renormalization of the apparent persistence length as extracted from single molecule experiments (Eqs. 2.39 and 2.98). As I show the experimentally observed apparent persistence length reduction by a factor of 10 or more is naturally explained by this theory. In chapter 3 I theoretically consider the thermal motion of nucleosomes along a DNA template. After an extensive analysis of available experimental data and theoretical modelling of two possible mechanisms I conclude that the ”corkscrew-motion” mechanism most consistently explains this biologically important process. In chapter 4 I demonstrate that DNA-spools (architectures in which DNA circumferentially winds on a cylindrical surface, or onto itself) show a remarkable ”kinetic inertness” that protects them from tension-induced disruption on experimentally and biologically relevant timescales (cf. Fig. 4.1 and Eq. 4.18). I show that the underlying model establishes a connection between the seemingly unrelated and previously unexplained force peaks in single molecule nucleosome and DNA-toroid stretching experiments. Finally in chapter 5 I show that toroidally confined DNA (found in viruses, DNAcondensates or sperm chromatin) undergoes a transition to a twisted, highly entangled state provided that the aspect ratio of the underlying torus crosses a certain critical value (cf. Eq. 5.6 and the phase diagram in Fig. 5.4). The presented mechanism could rationalize several experimental mysteries, ranging from entangled and supercoiled toroids released from virus capsids to the unexpectedly short cholesteric pitch in the (toroidaly wound) sperm chromatin. I propose that the ”topological encapsulation” resulting from our model may have some practical implications for the gene-therapeutic DNA delivery process.

Untersuchungen zur Reparatur und Mutagenität oxidativer DNA-Schäden in vivo und deren Bedeutung für die Kanzerogenese

Gegenstand dieser Arbeit war die Untersuchung, welche Rolle endogen gebildete oxidative DNA-Modifikationen bei der Kanzerogenese spielen. Dazu wurden Cockayne Syndrom B-knockout-Mäuse (Csb-/-), 8-Hydroxyguanin-DNA-Glykosylase-knockout-Mäuse (Ogg1-/-) und Csb-/-/Ogg1-/- Mäuse generiert, die das bakterielle lacI-Gen (Big Blue®) tragen und somit für in vivo Mutationstests eingesetzt werden können. Die Ergebnisse zeigen, dass es in den Lebern der Ogg1-/- Mäuse zu einem 2,1-fachen und in Csb-/-/Ogg1-/- Mäusen zu einem statistisch signifikanten 3,3-fachen Anstieg der Mutationsfrequenz kommt. Die gefundene Erhöhung der Mutationsfrequenz war vor allem auf eine Erhöhung der G:C zu T:A Transversionen zurückzuführen, die typischerweise aus nicht repariertem 8 Hydroxyguanin (8-oxoG) entstehen. Aus mechanistischer Sicht verdeutlichen die Ergebnisse, dass OGG1 das primäre Abwehrsystem gegen oxidative DNA-Modifikationen darstellt und dass das CSB-Protein einen Ausfall von OGG1, selbst in nicht transkribierter DNA, teilweise kompensieren kann. Aus der Korrelation der gefundenen oxidativen DNA-Schäden - bestimmt mittels Alkalischer Elution und der bakteriellen Formamidopyrimidin-DNA-Glykosylase (Fpg-Protein) - mit der Mutationsfrequenz konnte abgeleitet werden, dass bereits weniger als 0,2 Fpg-sensitive DNA-Modifikationen pro 1 Million Basenpaare ausreichen, die spontane Mutationsfrequenz in vivo zu verdoppeln. Zur Untersuchung, welche Rolle die erhöhte Mutationsfrequenz bei der Krebsentstehung spielt, wurden Csb-/-/Ogg1-/- und Wildtyp-Mäuse mit dem Peroxisomenproliferator und spezifischem Leberpromotor WY-14,643 behandelt um spontan initiierte Hepatozyten zur Proliferation anzuregen. Als Endpunkt einer malignen Entartung wurde das Auftreten von Glucose-6-Phosphatase positiven und negativen Läsionen beobachtet. Es zeigte sich, dass Csb-/-/Ogg1-/- Mäuse signifikant mehr enzymveränderte Läsionen in ihren Lebern aufwiesen, als die Wildtyp-Kontrollen. Die Ergebnisse verdeutlichen, dass endogen gebildete oxidative DNA-Modifikationen und daraus resultierende Mutationen grundsätzlich einen erheblichen Anteil zur hohen spontanen Krebsinzidenz in der Bevölkerung leisten könnten.

Down Syndrome: Neuropsychological phenotype and mitochondrial DNA

Introduction. Down Syndrome (DS) is the most known autosomal trisomy, due to the presence in three copies of chromosome 21. Many studies were designed to identify phenotypic and clinical consequences related to the triple gene dosage. However, the general conclusion is a senescent phenotype; in particular, the most features of physiological aging, such as skin and hair changes, vision and hearing impairments, thyroid dysfunction, Alzheimer-like dementia, congenital heart defects, gastrointestinal malformations, immune system changes, appear in DS earlier than in normal age-matched subjects. The only established risk factor for the DS is advanced maternal age, responsible for changes in the meiosis of oocytes, in particular the meiotic nondisjunction of chromosome 21. In this process mitochondria play an important role since mitochondrial dysfunction, due to a variety of extrinsic and intrinsic influences, can profoundly influence the level of ATP generation in oocytes, required for a correct chromosomal segregation. Aim. The aim of this study is to investigate an integrated set of molecular genetic parameters (sequencing of complete mtDNA, heteroplasmy of the mtDNA control region, genotypes of APOE gene) in order to identify a possible association with the early neurocognitive decline observed in DS. Results. MtDNA point mutations do not accumulate with age in our study sample and do not correlate with early neurocognitive decline of DS subjects. It seems that D-loop heteroplasmy is largely not inherited and tends to accumulate somatically. Furthermore, in our study sample no association of cognitive impairment and ApoE genotype is found. Conclusions. Overall, our data cast some doubts on the involvement of these mutations in the decline of cognitive functions observed in DS.

Modulation der Genexpression und des neuronalen Zelltods durch das Amyloid-Vorläufer-Protein (APP)

Das Amyloid-Vorläufer-Protein (APP) spielt eine zentrale Rolle in der Entstehung und Entwicklung von Morbus Alzheimer. Hierbei ist die proteolytische Prozessierung von APP von entscheidender Bedeutung. Das Verhältnis von neurotoxischen und neuroprotektiven Spaltprodukten, die über den amyloidogenen und nicht-amyloidogenen Weg der APP-Prozessierung gebildeten werden, ist für das Überleben von Neuronen und deren Resistenz gegen zytotoxische Stress-Stimuli von hoher Relevanz. Störungen der Calcium-Homöostase sind ein bekanntes Phänomen bei Morbus Alzheimer. Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurde die Rolle von überexprimiertem APP in der Regulation des neuronalen Zelltods nach Calcium Freisetzung untersucht. Die Calcium Freisetzung aus dem endoplasmatischen Retikulum wurde durch die Inhibition der sarko- und endoplasmatischen Calcium-ATPasen (SERCA) ausgelöst. Dies führt zur Induktion der sogenannten „unfolded protein response“ (UPR) und zu einer Aktivierung von Effektor-Caspasen. Für APP-überexprimierende PC12 Zellen konnte bereits zuvor eine im Vergleich zur Kontrolle nach der durch Calcium Freisetzung-induzierten Apoptose eine erhöhte intrazelluläre Calcium Konzentration nachgewiesen werden. Über die Messung der Aktivierung von Effektor-Caspasen konnte zudem ein gesteigerter Zelltod in den APP-überexprimierenden Zellen gemessen werden. Zudem konnte gezeigt werden, dass der pro-apoptotische Transkriptionsfaktor CHOP, nicht aber die klassischen UPR-Zielgene spezifisch hochreguliert wurden. Die APP-modulierte gesteigerte Induktion von Apoptose nach Calcium Freisezung konnte durch Komplexierung der intrazellulären Calcium Ionen und durch Knockdown von CHOP im Vergleich zur Kontrolle gänzlich unterdrückt werden. Ferner bewirkte die Inhibition der Speicher-aktivierten Calcium-Kanälen (SOCC) eine signifikante Unterdrückung der beobachteten erhöhten intrazellulären Calcium Konzentration und der gesteigerten Apoptose in den APP-überexprimierenden PC12 Zellen. In diesem Teil der Arbeit konnte eindeutig gezeigt werden, dass APP in der Lage ist den durch Calcium-Freisetzung-induzierten Zelltod zu potenzieren. Diese Modulation durch APP verläuft in einer UPR-unabhängigen Reaktion über die Aktivierung von SOCC’s, einer erhöhten Aufnahme von extrazellulärem Calcium und durch erhöhte Induktion des pro-apoptotischen Transkriptionsfaktors CHOP. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die sAPPα-vermittelte Neuroprotektion untersucht. Dabei handelt es sich um die N-terminale Ektodomäne von APP, die über die Aktivität der α-Sekretase prozessiert wird und anschließend extrazellulär abgegeben wird. Ziel dieser Versuchsreihe war die neuroprotektive physiologische Funktion von APP im Hinblick auf den Schutz von neuronalen Zellen vor diversen für Morbus Alzheimer relevanten Stress-Stimuli bzw. Apoptose-Stimuli zu untersuchen. Durch die Analyse der Effektor-Caspasen konnte gezeigt werden, dass sAPPα in der Lage ist PC12 Zellen potent vor oxidativem Stress, DNA-Schäden, Hypoxie, proteasomalem Stress und Calcium-Freisetzung zu schützen. Außerdem konnte gezeigt werden, dass sAPPα in der Lage ist den pro-apoptotischen Stress-induzierten JNK/Akt-Signalweg zu inhibieren. Eine Beteiligung des anti-apoptotischen PI3K/Akt-Signalwegs bei der sAPPα-vermittelten Protektion konnte über die Inhibition der PI3-Kinase ebenfalls demonstriert werden, die eine Aufhebung der sAPPα-vermittelten Neuroprotektion bewirkte. Diese Daten zeigen neue molekulare Mechanismen auf, die dem sAPPα-vermittelten Schutz vor pathophysiologisch relevanten Stress-Stimuli in neuronalen Zellen zugrunde liegen. Im letzten Teil der Arbeit wurden verschieden Gruppen von pharmakologischen Substanzen im Hinblick auf ihre neuroprotektive Wirkung untersucht und mit ihren Effekten auf den APP-Metabolismus korreliert. Die Untersuchungen ergaben, dass Galantamin, ein schwacher Acetycholinesterase Inhibitor und allosterisch potenzierender Ligand von nikotinischen Acetylcholin-Rezeptoren in der Lage war, naive, und mit noch höherer Effizienz APP-überexprimierende Zelllinien vor dem Stress-induzierten Zelltod zu schützen. Zudem bewirkte Galantamin in APP-überexprimierenden HEK293 Zellen eine rasche Erhöhung der sAPPα Sekretion, so dass hier von einer Rezeptor-vermittelten Modulation des APP Metabolismus ausgegangen werden kann. Omega-3 Fettsäuren wirken sich positiv auf die Membranfluidität von Zellen aus und es konnte bereits gezeigt werden, dass die Bildung des toxischen Aβ Peptids hierdurch vermindert wird. In Analogie zu Galantamin schützte die Omega-3 Fettsäure Docosahexaensäure (DHA) neuronale Zellen vor dem Stress-induzierten Zelltod, wobei der Schutz in APP-überexprimierenden Zellen besonders effizient war. Diese Daten legen nahe, dass die Aktivierung des antiamyloidogenen Wegs der APP-Prozessierung ein viel versprechender Ansatz für die Entwicklung neuer Therapien gegen Morbus Alzheimer sein könnte.

Untersuchung der DNA-bindenden Eigenschaften neuer Nukleobasen-gekoppelter Pyrrolcarboxamide, Combilexine und Hetaren[a]carbazol-Derivate: Validierung und Etablierung von in-vitro- und in-silico-Methoden

Da maligne Neoplasien durch Mutationen in Proto-Onko- und/oder Tumorsuppressorgenen ausgelöst werden, stellt die DNA eines der wichtigsten Targets für die Entwicklung neuer Zytostatika dar. Auch bei den im Arbeitskreis Pindur designten und synthetisier-ten Verbindungen der Nukleobasen-gekoppelten Pyrrolcarboxamid-, der Hetaren[a]carbazol- und der Combilexin-Reihe handelt es sich um DNA-Liganden mit potentiell antitumoraktiven Eigenschaf-ten. Die einen dualen Bindemodus aufweisenden Combilexine bestehen aus einem Interkalator (u. a. Naphthalimid, Acridon), der über einen Linker variabler Kettenlänge mit einer rinnenbin-denden, von Netropsin abgeleiteten Bispyrrol-, oder einer bioisosteren Imidazol-, Thiazol- oder Thiophen-pyrrolcarboxamid-struktur verknüpft ist. Das N-terminale Ende der Combilexine wird von einer N,N-Dimethylaminopropyl- oder -ethyl-Seitenkette gebildet. Die DNA-Affinitäten der Liganden wurden mittels Tm-Wert-Messung-en bestimmt. Diese Denaturierungsexperimente wurden sowohl mit poly(dAdT)2- als auch mit Thymus-DNA (~42% GC-Anteil) durchge-führt, um Aussagen zur Stärke und zur Sequenzselektivität der DNA-Bindung machen zu können. Des Weiteren wurden die Bindekon-stanten einiger ausgewählter Vertreter mit Hilfe des Ethidium-bromid-Verdrängungsassays ermittelt; einige Testverbindungen wurden zudem auf potentiell vorhandene, TOPO I-inhibierende Eigenschaften untersucht. Diese biochemischen und biophysika-lischen Tests wurden durch Molecular Modelling-Studien ergänzt, die die Berechnung von molekularen Eigenschaften, die Durch-führung von Konformerenanalysen und die Simulation von DNA-Ligand-Komplexen (Docking) umfassten. Durch Korrelation der in vitro-Befunde mit den in silico-Daten gelang es, vor allem für die Substanzklasse der Combilexine einige richtungweisende Struktur-Wirkungsbeziehungen aufzustellen. So konnte gezeigt werden, dass die Einführung eines Imidazol-Rings in die rinnen-bindende Hetaren-pyrrolcarboxamid-Struktur der Combilexine aufgrund der H-Brücken-Akzeptor-Funktion des sp2-hybridisierten N-Atoms eine Verschiebung der Sequenzselektivität der DNA-Bindung von AT- zu GC-reichen Arealen der DNA bedingt. Zudem erwies sich ein C3-Linker für die Verknüpfung des Naphthalimids mit dem rinnenbindenden Strukturelement als am besten geeignet, während bei den Acridon-Derivaten die Verbindungen mit einem N-terminalen Buttersäure-Linker die höchste DNA-Affinität aufwiesen. Dies ist sehr wahrscheinlich auf die im Vergleich zum Naphthalimid-Molekül geringere y-Achsen-Ausdehnung (bzgl. eines x/y-Koordinatensystems) des Acridons zurückzuführen. Die ermittelten Struktur-Wirkungsbeziehungen können dazu herangezogen werden, das rationale Design neuer DNA-Liganden mit potentiell stärkerer DNA-Bindung zu optimieren.

Alkylantien induzierte Zytotoxizität, DNA-schadensinduzierte Reparaturkapazität und Apoptoseinduktion von Immunzellen

Monozyten und Monozyten-abgeleitete Dendritische Zellen (DCs) spielen eine bedeutende Rolle im Immunsystem. Da DCs bei der Tumorabwehr mitwirken, ist es wichtig, dass Monozyten als auch DCs sich gegenüber zytotoxischen Agenzien aus der Chemotherapie wehren können. Chemotherapeutika reagieren mit der DNA, jedoch die DNA-Reparaturkapazität von Monozyten und DCs wurde noch nicht untersucht. Dazu wurde die Sensitivität in Monozyten und DCs gegenüber verschiedene genotoxische Agenzien untersucht. Dabei wurde herausgefunden, dass Monozyten sensitiv auf methylierende Agenzien (MNNG, MMS und Temozolomid) reagieren und ein verstärktes Zellsterben und Apoptoseinduktion zeigen. Im Vergleich zu weiteren Zytostatika wie Fotemustin, Mafosfamid und Cisplatin reagierten Monozyten und DCs gleich sensitiv. Diese Ergebnisse weisen auf einen Defekt in der Reparatur von DNA-Methylierungsschäden in Monozyten hin. Da die Expression des Reparaturproteins O6-Methylguanin-DNA Methyltransferase (MGMT) in Monozyten höher war als in DCs und deren Inhibierung durch O6-Benzylguanin keinen Effekt auf die Sensitivität von Monozyten hatte, wurde der Reparaturweg der Basenexzisionsreparatur untersucht. Im Vergleich zu DCs waren die Monozyten unfähig die BER durchzuführen, welche durch Einzelzellgelelektrophorese gemessen wurde. Expressionsuntersuchungen ergaben, dass in Monozyten XRCC1 und Ligase IIIα fehlen im Vergleich zu DCs, Makrophagen, hämatopoetische Stammzellen und Lymphozyten, welche diese Proteine exprimieren. Diese Ergebnisse zeigen einen spezifischen DNA-Reparaturdefekt in einer bestimmten Blutzellpopulation. Durch den BER Defekt in Monozyten kann es durch methylierende Tumorwirkstoffe während einer Chemotherapie zur Depletion und zu einer abgeschwächten Immunantwort kommen.

Virus oncogeni a dna in tumori umani: studio delle infezioni da papillomavirus e poliomavirus in neoplasie di diversa origine.

I virus tumorali inducono oncogenesi nel loro ospite naturale o in sistemi animali sperimentali, manipolando diverse vie cellulari. Ad oggi, sono stati identificati sette virus capaci di causare specifici tumori umani. Inoltre HPV, JCV ed SV40, sono stati associati con un grande numero di tumori umani in sedi corporee non convenzionali, ma, nonostante molti anni di ricerca, nessuna eziologia virale è stata ancora confermata. Lo scopo di questo studio è stato di valutare la presenza ed il significato sia di JCV ed SV40 in tumori ossei umani, e di HPV nel carcinoma della mammella (BC), galattoforectomie (GF), secrezioni mammarie patologiche (ND) e glioblastoma multiforme (GBM). Tecniche di biologia molecolare sono state impiegate per esaminare campioni di tessuto tumorale di 70 tumori ossei (20 osteosarcomi [OS], 20 tumori a cellule giganti [TCG], 30 condrosarcomi [CS]), 168 BCs , 30 GFs, 59 GBM e 30 campioni di ND. Il genoma di SV40 e JCV è stato trovato nel 70% dei CS + 20% degli OS, e nel 13% dei CS +10% dei TCG, rispettivamente. Il DNA di HPV è stato rilevato nel 30% dei pazienti con BC, nel 27% dei campioni GF e nel 13% dei NDs. HPV16 è stato il genotipo maggiormente osservato in tutti questi campioni, seguito da HPV18 e HPV35. Inoltre, il DNA di HPV è stato trovato nel 22% dei pazienti con GBM, in questo tumore HPV6 era il tipo più frequentemente rilevato, seguito da HPV16. L’ ISH ha mostrato che il DNA di HPV è situato all’interno di cellule tumorali mammarie e di GBM. I nostri risultati suggeriscono un possibile ruolo di JCV, SV40 e HPV in questi tumori, se non come induttori come promotori del processo neoplastico, tuttavia diversi criteri devono ancora essere soddisfatti prima di chiarirne il ruolo.

Forensisch relevante SNP-Genotypisierung mittels elektronischer Microarray-Technologie

Die vorliegende Dissertation entstand im Rahmen eines multizentrischen EU-geförderten Projektes, das die Anwendungsmöglichkeiten von Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNPs) zur Individualisierung von Personen im Kontext der Zuordnung von biologischen Tatortspuren oder auch bei der Identifizierung unbekannter Toter behandelt. Die übergeordnete Zielsetzung des Projektes bestand darin, hochauflösende Genotypisierungsmethoden zu etablieren und zu validieren, die mit hoher Genauigkeit aber geringen Aufwand SNPs im Multiplexformat simultan analysieren können. Zunächst wurden 29 Y-chromosomale und 52 autosomale SNPs unter der Anforderung ausgewählt, dass sie als Multiplex eine möglichst hohe Individualisierungschance aufweisen. Anschließend folgten die Validierungen beider Multiplex-Systeme und der SNaPshot™-Minisequenzierungsmethode in systematischen Studien unter Beteiligung aller Arbeitsgruppen des Projektes. Die validierte Referenzmethode auf der Basis einer Minisequenzierung diente einerseits für die kontrollierte Zusammenarbeit unterschiedlicher Laboratorien und andererseits als Grundlage für die Entwicklung eines Assays zur SNP-Genotypisierung mittels der elektronischen Microarray-Technologie in dieser Arbeit. Der eigenständige Hauptteil dieser Dissertation beschreibt unter Verwendung der zuvor validierten autosomalen SNPs die Neuentwicklung und Validierung eines Hybridisierungsassays für die elektronische Microarray-Plattform der Firma Nanogen Dazu wurden im Vorfeld drei verschiedene Assays etabliert, die sich im Funktionsprinzip auf dem Microarray unterscheiden. Davon wurde leistungsorientiert das Capture down-Assay zur Weiterentwicklung ausgewählt. Nach zahlreichen Optimierungsmaßnahmen hinsichtlich PCR-Produktbehandlung, gerätespezifischer Abläufe und analysespezifischer Oligonukleotiddesigns stand das Capture down-Assay zur simultanen Typisierung von drei Individuen mit je 32 SNPs auf einem Microarray bereit. Anschließend wurde dieses Verfahren anhand von 40 DNA-Proben mit bekannten Genotypen für die 32 SNPs validiert und durch parallele SNaPshot™-Typisierung die Genauigkeit bestimmt. Das Ergebnis beweist nicht nur die Eignung des validierten Analyseassays und der elektronischen Microarray-Technologie für bestimmte Fragestellungen, sondern zeigt auch deren Vorteile in Bezug auf Schnelligkeit, Flexibilität und Effizienz. Die Automatisierung, welche die räumliche Anordnung der zu untersuchenden Fragmente unmittelbar vor der Analyse ermöglicht, reduziert unnötige Arbeitsschritte und damit die Fehlerhäufigkeit und Kontaminationsgefahr bei verbesserter Zeiteffizienz. Mit einer maximal erreichten Genauigkeit von 94% kann die Zuverlässigkeit der in der forensischen Genetik aktuell eingesetzten STR-Systeme jedoch noch nicht erreicht werden. Die Rolle des neuen Verfahrens wird damit nicht in einer Ablösung der etablierten Methoden, sondern in einer Ergänzung zur Lösung spezieller Probleme wie z.B. der Untersuchung stark degradierter DNA-Spuren zu finden sein.

Genetic and morphological variation and differentiation of Raja clavata populations in the European seas: marker development and preliminary data

In this study the population structure and connectivity of the Mediterranean and Atlantic Raja clavata (L., 1758) were investigated by analyzing the genetic variation of six population samples (N = 144) at seven nuclear microsatellite loci. The genetic dataset was generated by selecting population samples available in the tissue databases of the GenoDREAM laboratory (University of Bologna) and of the Department of Life Sciences and Environment (University of Cagliari), all collected during past scientific surveys (MEDITS, GRUND) from different geographical locations in the Mediterranean basin and North-east Atlantic sea, as North Sea, Sardinian coasts, Tuscany coasts and Cyprus Island. This thesis deals with to estimate the genetic diversity and differentiation among 6 geographical samples, in particular, to assess the presence of any barrier (geographic, hydrogeological or biological) to gene flow evaluating both the genetic diversity (nucleotide diversity, observed and expected heterozygosity, Hardy- Weinberg equilibrium analysis) and population differentiation (Fst estimates, population structure analysis). In addition to molecular analysis, quantitative representation and statistical analysis of morphological individuals shape are performed using geometric morphometrics methods and statistical tests. Geometric coordinates call landmarks are fixed in 158 individuals belonging to two population samples of Raja clavata and in population samples of closely related species, Raja straeleni (cryptic sibling) and Raja asterias, to assess significant morphological differences at multiple taxonomic levels. The results obtained from the analysis of the microsatellite dataset suggested a geographic and genetic separation between populations from Central-Western and Eastern Mediterranean basins. Furthermore, the analysis also showed that there was no separation between geographic samples from North Atlantic Ocean and central-Western Mediterranean, grouping them to a panmictic population. The Landmark-based geometric morphometry method results showed significant differences of body shape able to discriminate taxa at tested levels (from species to populations).

The constitutive activation of the DNA damage response pathway is a novel therapeutic target in aggressive B-cell lymphoma

The recent finding that MYC-driven cancers are sensitive to inhibition of the DNA damage response (DDR) pathway, prompted us to investigate the role of DDR pathway as therapeutic target in diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL), which frequently overexpresses the MYC oncogene. In a preliminary immunohistochemical study conducted on 99 consecutive DLBCL patients, we found that about half of DLBCLs showed constitutive expression of the phosphorylated forms of checkpoint kinases (CHK) and CDC25c, markers of DDR activation, and of phosphorylated histone H2AX (γH2AX), marker of DNA damage and genomic instability. Constitutive γH2AX expression correlated with c-MYC levels and DDR activation, and defined a subset of tumors characterised by poor outcome. Next, we used the CHK inhibitor PF-0477736 as a tool to investigate whether the inhibition of the DDR pathway might represent a novel therapeutic approach in DLBCL. Submicromolar concentrations of PF-0477736 hindered proliferation in DLBCL cell lines with activated DDR pathway. These results were fully recapitulated with a different CHK inhibitor (AZD-7762). Inhibition of checkpoint kinases induced rapid DNA damage accumulation and apoptosis in DLBCL cell lines and primary cells. These data suggest that pharmacologic inhibition of DDR through targeting of CHK kinases may represent a novel therapeutic strategy in DLBCL. The second part of this work is the clinical, molecular and functional description of a paradigmatic case of primary refractory Burkitt lymphoma characterized by spatial intratumor heterogeneity for the TP53 mutational status, high expression levels of genomic instability and DDR activation markers, primary resistance to chemotherapy and exquisite sensitivity to DDR inhibitors.

Regulatory networks of Neisseria meningitidis and their implications for pathogenesis

Neisseria meningitidis, the leading cause of bacterial meningitis, can adapt to different host niches during human infection. Both transcriptional and post-transcriptional regulatory networks have been identified as playing a crucial role for bacterial stress responses and virulence. We investigated the N. meningitidis transcriptional landscape both by microarray and by RNA sequencing (RNAseq). Microarray analysis of N. meningitidis grown in the presence or absence of glucose allowed us to identify genes regulated by carbon source availability. In particular, we identified a glucose-responsive hexR-like transcriptional regulator in N. meningitidis. Deletion analysis showed that the hexR gene is accountable for a subset of the glucose-responsive regulation, and in vitro assays with the purified protein showed that HexR binds to the promoters of the central metabolic operons of meningococcus, by targeting a DNA region overlapping putative regulatory sequences. Our results indicate that HexR coordinates the central metabolism of meningococcus in response to the availability of glucose, and N. meningitidis strains lacking the hexR gene are also deficient in establishing successful bacteremia in a mouse model of infection. In parallel, RNAseq analysis of N. meningitidis cultured under standard or iron-limiting in vitro growth conditions allowed us to identify novel small non-coding RNAs (sRNAs) potentially involved in N. meningitidis regulatory networks. Manual curation of the RNAseq data generated a list of 51 sRNAs, 8 of which were validated by Northern blotting. Deletion of selected sRNAs caused attenuation of N. meningitidis infection in a murine model, leading to the identification of the first sRNAs influencing meningococcal bacteraemia. Furthermore, we describe the identification and initial characterization of a novel sRNA unique to meningococcus, closely associated to genes relevant for the intracellular survival of pathogenic Neisseriae. Taken together, our findings could help unravel the regulation of N. meningitidis adaptation to the host environment and its implications for pathogenesis.

Consequences of DNA damage for gene transcription : direct effects of modified nucleobases and the role of base excision repair = Folgen von DNA-Schäden für die Gentranskription

The presence of damaged nucleobases in DNA can negatively influence transcription of genes. One of the mechanisms by which DNA damage interferes with reading of genetic information is a direct blockage of the elongating RNA polymerase complexes – an effect well described for bulky adducts induced by several chemical substances and UV-irradiation. However, other mechanisms must exist as well because many of the endogenously occurring non-bulky DNA base modifications have transcription-inhibitory properties in cells, whilstrnnot constituting a roadblock for RNA polymerases under cell free conditions. The inhibition of transcription by non-blocking DNA damage was investigated in this work by employing the reporter gene-based assays. Comparison between various types of DNA damage (UV-induced pyrimidine photoproducts, oxidative purine modifications induced by photosensitisation, defined synthetic modified bases such as 8-oxoguanine and uracil, and sequence-specific single-strand breaks) showed that distinct mechanisms of inhibition of transcription can be engaged, and that DNA repair can influence transcription of the affectedrngenes in several different ways.rnQuantitative expression analyses of reporter genes damaged either by the exposure of cells to UV or delivered into cells by transient transfection supported the earlier evidence that transcription arrest at the damage sites is the major mechanism for the inhibition of transcription by this kind of DNA lesions and that recovery of transcription requires a functional nucleotide excision repair gene Csb (ERCC6) in mouse cells. In contrast, oxidisedrnpurines generated by photosensitisation do not cause transcriptional blockage by a direct mechanism, but rather lead to transcriptional repression of the damaged gene which is associated with altered histone acetylation in the promoter region. The whole chain of events leading to transcriptional silencing in response to DNA damage remains to be uncovered. Yet, the data presented here identify repair-induced single-strand breaks – which arise from excision of damaged bases by the DNA repair glycosylases or endonucleases – as arnputative initiatory factor in this process. Such an indirect mechanism was supported by requirement of the 8-oxoguanine DNA glycosylase (OGG1) for the inhibition of transcription by synthetic 8-oxodG incorporated into a reporter gene and by the delays observed for the inhibition of transcription caused by structurally unrelated base modifications (8-oxoguanine and uracil). It is thereby hypothesized that excision of the modified bases could be a generalrnmechanism for inhibition of transcription by DNA damage which is processed by the base excision repair (BER) pathway. Further gene expression analyses of plasmids containing single-strand breaks or abasic sites in the transcribed sequences revealed strong transcription inhibitory potentials of these lesions, in agreement with the presumption that BER intermediates are largely responsible for the observed effects. Experiments with synthetic base modifications positioned within the defined DNA sequences showed thatrninhibition of transcription did not require the localisation of the lesion in the transcribed DNA strand; therefore the damage sensing mechanism has to be different from the direct encounters of transcribing RNA polymerase complexes with DNA damage.rnAltogether, this work provides new evidence that processing of various DNA basernmodifications by BER can perturb transcription of damaged genes by triggering a gene silencing mechanism. As gene expression can be influenced even by a single DNA damage event, this mechanism could have relevance for the endogenous DNA damage induced in cells under normal physiological conditions, with a possible link to gene silencing in general.

Untersuchung der Rolle reaktiver Sauerstoffspezies und DNA-Schäden bei Hypertonie und Arteriosklerose

Angiotensin II induziert intrazellulär die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies, welche DNA-Schäden erzeugen können. Um die Hypothese zu prüfen, dass durch Angiotensin II induzierte DNA-Schäden für die erhöhte Krebsinzidenz hypertensiver Menschen verantwortlich sind, wurde eine vierwöchige Behandlung von Mäusen mit Angiotensin II (0,6 μg/kg/min) durchgeführt. Mit der Alkalischen Elution wurden in Zellen aus verschiedenen Organen der Mäuse die Menge an DNA-Einzelstrangbrüchen und oxidativen DNA-Modifikationen bestimmt. In der Niere wurde außerdem mit dem BigBlue® Mutations-Assay die Entstehung von Mutationen analysiert. In keinem der analysierten Organe konnte eine Erhöhung der DNA-Schäden oder eine Erhöhung der Mutationsfrequenzen durch die Angiotensin II-Behandlung nachgewiesen werden. Die durchgeführten Untersuchungen geben somit keinen Hinweis auf eine DNA-schädigende und mutagene Wirkung von Angiotensin II.rnBei der Entstehung und dem Krankheitsverlauf von Arteriosklerose spielen reaktive Sauerstoffspezies ebenfalls eine noch nicht genau geklärte Rolle. Um zu ermitteln, ob oxidative DNA-Schäden die Entstehung der Arteriosklerose begünstigen, wurde die Endothelfunktion von Wildtyp- und reparaturdefizienten Ogg1-/--Mäusen verglichen. Entgegen der Vermutung, dass oxidative DNA-Modifikationen die Endothelfunktion verschlechtern, zeigen die Untersuchungen, dass Ogg1-/--Mäuse, die höhere Spiegel an oxidativen DNA-Modifikationen in ihrem Genom haben, eine signifikant bessere Endothelfunktion besitzen als Wildtyptiere. Dieser Befund weist auf eine neuartige, von der DNA-Reparatur unabhängige Funktion von OGG1 hin.rn

Veränderungen der DNA-Methylierung in Patienten mit AHCY-Defizienz

Die S-adenosyl-L-Homocysteinhydrolase (AHCY)-Defizienz ist eine seltene autosomal rezessive Erbkrankheit, bei der Mutationen im AHCY-Gen die Funktionsfähigkeit des kodierten Enzyms beeinträchtigen. Diese Krankheit führt zu Symptomen wie Entwicklungsverzögerungen, mentaler Retardierung und Myopathie. In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss der AHCY-Defizienz auf die Methylierung der DNA in Blutproben und Fibroblasten von Patienten mit AHCY-Defizienz, sowie in HEK293- und HepG2-Zelllinien mit AHCY-Knockdown untersucht. Der gesamtgenomische Methylierungsstatus wurde mit Hilfe des MethylFlash ™ Methylated DNA Quantification Kit (Epigentek) bei drei Patienten-Blutproben festgestellt. In den Blutproben von sieben Patienten und Fibroblasten von einem Patienten wurde die Methylierung von DMRs sieben geprägter Gene (GTL2, H19, LIT1, MEST, NESPAS, PEG3, SNRPN) und zwei repetitiver Elemente (Alu, LINE1) mittels Bisulfit-Pyrosequenzierung quantifiziert und durch High Resolution Melting-Analyse bestätigt. Zusätzlich wurde eine genomweite Methylierungsanalyse mit dem Infinium® HumanMethylation450 BeadChip (Illumina) für vier Patientenproben durchgeführt und die Expression von AHCY in Fibroblasten mittels Expressions-qPCR und QUASEP-Analyse untersucht. Die Methylierungsanalysen ergaben eine Hypermethylierung der gesamtgenomischen DNA und stochastische Hypermethylierungen von DMRs geprägter Gene bei einigen Patienten. Die HEK293- und HepG2-Zelllinien wiesen dagegen hauptsächlich stochastische Hypomethylierungen an einigen DMRs geprägter Gene und LINE1-Elementen auf. Die genomweite Methylierungsarray-Analyse konnte die Ergebnisse der Bisulfit-Pyrosequenzierung nicht bestätigen. Die Expressionsanalysen der AHCY-defizienten Fibroblasten zeigten eine verminderte Expression von AHCY, wobei beide Allele etwa gleich stark transkribiert wurden. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die AHCY-Defizienz eine gute Modellerkrankung für die Untersuchung biologischer Konsequenzen von Methylierungsstörungen im Rahmen der Epigenetik-Forschung sein könnte. Sie ist unseres Wissens die erste monogene Erkrankung mit symptomaler DNA-Hypermethylierung beim Menschen.