Real time monitoring of DNA hybridization and replication using optical and acoustic biosensors

Während in den letzten Jahren zahlreiche Biosensoren zum spezifischen Nachweis von DNA entwickelt wurden, ist die Anwendung oberflächen-sensitiver Methoden auf enzymatische Reaktionen ein vergleichsweise neues Forschungsgebiet. Trotz der hohen Empfindlichkeit und der Möglichkeit zur Echtzeit-Beobachtung molekularer Prozesse, ist die Anwendung dieser Methoden nicht etabliert, da die Enzymaktivität durch die Nähe zur Oberfläche beeinträchtigt sein kann. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die enzymatische Verlängerung immobilisierter DNA durch eine DNA Polymerase mit Hilfe von Oberflächenplasmonen-Fluoreszenzspektroskopie (SPFS) und einer Quarzkristall-Mikrowaage (QCM) untersucht. Die Synthese von DNA wurde im Fall der QCM als Massenzuwachs detektiert, der sich im Abfall der Resonanzfrequenz des Schwingquarzes und einem Anstieg seiner Dissipationsenergie ausdrückte. Die viskoelastischen Eigenschaften der DNA-Schichten wurden bestimmt, indem die erhaltenen Daten mit einem auf Voigt basierenden Modell ausgewertet wurden. SPFS nutzt das evaneszente elektromagnetische Feld, das mit Oberflächenplasmonen einhergeht, zur oberflächen-sensitiven Anregung von Chromophoren. Auf diese Weise wurde der Einbau von Farbstoff-markierten Nukleotiden in die entstehende DNA-Sequenz als Indikator für das Voranschreiten der Reaktion ausgenutzt. Beide Meßtechniken konnten erfolgreich zum Nachweis der DNA-Synthese herangezogen werden, wobei die katalytische Aktivität des Enzyms vergleichbar zu der in Lösung gemessenen war.

Whereas biosensors are widely used for the specific detection of DNA, surface analytical methods have been rarely used to study the activity of DNA-processing enzymes. Although these methods are extremely sensitive and allow for real-time monitoring of interfacial molecular processes, one has to exclude impairment of the enzyme activity to fully appreciate their versatility. The present thesis is focused on the enzymatic elongation of surface-tethered oligonucleotides by a DNA polymerase using surface plasmon fluorescence spectroscopy (SPFS) and the quartz crystal microbalance (QCM). Using the QCM, the mass increase due to DNA synthesis was observed in terms of a decrease of the resonance frequency of a quartz crystal and an increase in energy dissipation. The obtained data were analyzed on the basis of the Voigt viscoelastic model yielding insights into the material properties of the DNA layers. In the case of SPFS, one utilizes the evanescent electromagnetic field of a surface plasmon to excite chromophors in a surface-sensitive way. Making use of this excitation scheme, the synthesis of DNA was observed by incorporation of dye-labeled nucleotides into the nascent DNA strand. QCM and SPFS have been proven useful to monitor the polymerase reaction, which occurred with catalytic constants comparable to those derived from measurements in solution.