La coordinación motriz en la Adolescencia y su relación con el IMC, hábitos de práctica y motivación en E.F: Estudio transversal y longitudinal

En las últimas décadas, ha aumentado el interés de la investigación sobre el desarrollo de la coordinación motriz en la adolescencia por ser una etapa sensible, crítica y crucial para la adquisición de hábitos y conductas saludables de vida. Estos estudios han mostrado que la adquisición de unos niveles óptimos de coordinación y competencia motriz van a ser determinantes para el bienestar del adolescente y van a estar relacionados e influidos por otras dimensiones del desarrollo de la persona. Recientes investigaciones han sacado a la luz datos alarmantes sobre el aumento de problemas de coordinación motriz en la población infantil y adolescente (Cantell, Smyth y Ahonen, 1994; Gómez, 2004; Ruiz, Graupera, Gutiérrez y Miyahara, 2003; Sudgen y Chambers, 2005) donde abrocharse los botones de una camisa o correr de forma armónica puede ser todo un mundo lleno de dificultades y consecuencias sobre otras dimensiones del desarrollo (Ramón-Otero y Ruiz, 2015). Estos problemas han sido tratados por investigadores como una “dificultad oculta” (Gómez, Ruiz y Mata, 2006), cuya manifestación está presente en las actividades de la vida cotidiana, en contextos deportivos, en juegos y/o en la clase de Educación Física (Ruiz, 2004). La preocupación por estas dificultades se ha extendido a nivel internacional, creando todo un campo de investigación que estudia el diagnóstico de éstos problemas, conocido bajo las siglas DCD (Developmental Coordination Disorder). El presente estudio se centra en la etapa adolescente, periodo de transición entre la etapa infantil y adulta, caracterizada por numerosos cambios biológicos, cognitivos y socioemocionales (Santrock, 2005), que van a determinar la adaptación con el entorno (Gallahue, Ozmun y Goodway, 2011; Gómez, Ruiz, y Mata, 2006). El propósito principal del estudio es analizar el desarrollo de la coordinación motriz en la etapa adolescente investigando las diferencias de género y de edad en relación con variables psicosociales, los hábitos de práctica y las variables antropométricas. El diseño de la investigación se estructura en dos estudios. El primero de ellos, de carácter transversal, analizó una muestra representativa de 1.966 adolescentes de 1º a 4º de la ESO. El segundo, de naturaleza longitudinal, utilizó un grupo de 89 adolescentes del estudio transversal los cuales fueron estudiados durante 4 años, desde los 12 a los 15 años. Los mismos instrumentos fueron utilizados en ambos estudios: el Test Sportcomp para la evaluación de la coordinación motriz, el test AMPET4 para valorar la motivación de logro para el aprendizaje en Educación Física, el inventario HBSC para conocer los hábitos saludables sobre la práctica de actividad física y, por ultimo, se utilizó un estadiómetro para obtener el peso y la altura y así calcular el índice de masa corporal (IMC). La toma de datos del Estudio Transversal se realizó en 2 cursos académicos (2011/12 - 2012/13), en la cual se requirieron 3 sesiones coincidiendo con la clase de Educación Física. En la primera sesión, se evaluó la coordinación motriz. En la segunda se aplicaron los cuestionarios (AMPET4 y HBSC) y, en la última sesión se midió el peso y la altura en un espacio reservado al estadiómetro. El análisis de datos fue descriptivo y diferencial de cada una de las variables estudiadas: motoras, psicosociales, de hábitos de práctica de actividad física y antropométricas. Asimismo, se llevaron a cabo pruebas de análisis univariante y multivariante, calculando el valor-p y las pruebas de efecto. Respecto al Estudio Longitudinal, la toma de datos se llevó cabo durante 4 años desde el 2011 al 2014. La evaluación de la coordinación motriz se realizó en cada uno de los 4 años. Sin embargo, los 2 cuestionarios y las medidas antropométricas fueron evaluadas en el primer y cuarto año. Los análisis de datos fueron descriptivos y comparativos entre las variables analizadas. En el caso de la coordinación motriz, se realizaron las pruebas de medidas repetidas y, en el caso de las demás variables analizadas, se realizaron Prueba T para muestras relacionadas. Los resultados globales mostraron que el índice motor en el Estudio Transversal fue progresivo en el conjunto de chicos. Sin embargo, en las chicas, el rendimiento se estabiliza a partir de los 13 años. En el caso del Estudio Longitudinal, este índice se estabiliza en los 3 primeros años y a la edad de los 14, es cuando comienzan a acusarse las diferencias de género. En el caso de los hombres el rendimiento mejora y, por el contrario, en las mujeres empeora. En el Estudio Transversal, el análisis de varianza mostraron diferencias en función de la edad [F(7, 1958) = 220.70, p < .001; η2 = .101], del género [F(7, 1958) = 29.76, p < .001; η2 = .044], así como en la interacción entre ambos [F(7, 1958)= 11.90, p < .001; η2 = .018]. Únicamente aparecieron diferencias significativas con la edad en todos los grupos de hombres, excepto entre 14 y 15 años. En el Longitudinal, los contrastes multivariados mostraron que no hubo diferencias sgnificativas en el tiempo [F(3,85) = .05, p = .987, η2= .002] mostrando un nivel de coordinación estable a lo largo de los años, aunque existieron diferencias entre chicos y chicas [F(3,85) = 4.64 p = .005] con un tamaño de efecto destacable (η2 = .141). En cuanto a la motivación de logro para prender en Educación Física, en ambos estudios, los chicos fueron los que obtuvieron puntuaciones más elevadas en todas las dimensiones positivas del test (compromiso de aprendizaje, competencia autopercibida y comparada). Sin embargo, en la dimensión negativa del test, la referida a la ansiedad y al agobio ante el fracaso, fueron las chicas las que puntuaron más alto. En el Estudio Transversal, los resultados mostraron diferencias significativas en todas las dimensiones del AMPET4 en función del nivel de coordinación motriz: compromiso con el aprendizaje [F(2, 1644) = 8.66, p < .001; η2 = .010], competencia autopercibida [F(2, 1644) = 50.94, p < .001; η2 = .048], competencia comparada [F(2, 1644) = 41.56, p < .001, η2 = .020] y ansiedad [F(2, 1644) = 16.67, p < .001, η2 = .058]. En este sentido, los grupos de mejor nivel de coordinación motriz, fueron los que mayor puntuación obtuvieron en las dimensiones positivas y los que menor, en la negativa. En el Estudio Longitudinal, también se encontraron diferencias entre el primer y cuarto año de estudio en todas las dimensiones, excepto en competencia motriz autopercibida. Estas diferencias se tradujeron en una disminución en las 3 variables significativas del primer al cuarto año. Respecto al inventario HBSC, en el Estudio Longitudinal, la prueba T mostró únicamente la existencia de diferencias significativas entre el primer y cuarto año en 2 de los 11 ítems: percepción de la forma física (p = .006) y percepción de la salud (p = .047), los cuales disminuyeron en el intervalo de tiempo del estudio. En el Transversal, las diferencias se observaron en función del género (p < .001) y de la edad (p < .001). Asimismo, se mostraron diferencias significativas en todos los ítems respecto al nivel de coordinación motriz, excepto en 2 de ellos: frecuencia tiempo libre con los amigos fuera del colegio (p = .580) y facilidad para hacer amigos en el centro escolar (p = .098). Por último, en las variables antropométricas, los resultados del Estudio Transversal y Longitudinal coinciden tanto en la estatura como en el peso, apuntando, que en ambos estudios, se produce un aumento progresivo tanto en chicos como en chicas a medida que se avanza en edad. Concretamente en el Transversal, estas diferencias en la edad se encuentran en todos los grupos en ambos géneros, excepto en el conjunto de chicas entre los 14 y los 15 años. Asimismo, ambos estudios coincidieron en que tanto las ganancias en cm y kg, como las puntuaciones medias, fueron mayores en los chicos que en las chicas. Respecto al IMC, los 2 estudios coincidieron en que la evolución es paralela, y tal y como apuntan los resultados del Transversal, no se encontraron diferencias ni en la edad (p = 792) ni en el género (p = 284). No obstante, el Longitudinal apuntó únicamente diferencias significativas entre el primer y cuarto año en el conjunto de los hombres [t(41) = -4.01, p < .001]. Finalmente, y en relación con los niveles de coordinación motriz, hubo diferencias significativas en relación con el IMC (p = .012), mostrando como el grupo de peso normal coincide con puntuaciones óptimas de coordinación motriz. A modo de conclusiones, el presente estudio revela cómo la adquisición de un nivel de coordinación óptimo va a ser fundamental para el desarrollo psicosocial, para el desarrollo de hábitos saludables de práctica y para mantener un IMC dentro de la normalidad para el género y la edad. De esta manera, el desarrollo de la coordinación motriz será un aspecto fundamental para lograr un estado de bienestar físico y mental, y unos hábitos favorables para la práctica de actividad física. ABSTRACT In the past couple of decades, adolescence stage in motor coordination gained significant interest in research especially due to its sensitive and critical importance to achieving a healthy life style. These studies observed how to acquire optimum levels of coordination and motor competence, which proved crucial to the quality of the adolescent stage in addition to being influenced by other dimensions of development for each individual. Recent research shed light to an alarming set of data, which showed increased motor coordination problems in children and adolescents (Cantell, Smyth & Ahonen, 1994; Gómez, 2004; Ruiz, Graupera, Gutierrez & Miyahara, 2003; Sugden & Chambers, 2005). For instance, even to the extent that buttoning a shirt or running in a harmonic form can lead to a whole set of consequences and difficulties on the development stage. Researchers have addressed such problems in various studies such as “dificultad oculta” (Gomez, Ruiz & Mata, 2006), which literally translates as “hidden trouble”. The studies are evidently present in the activities of daily life, sporting contexts, games and/or Physical Education (Ruiz, 2004). Concern about these difficulties spread internationally, creating a whole framework research studying the diagnosis of these problems, known under the acronym DCD (Developmental Coordination Disorder). The study focuses on the adolescent stage, transition period between childhood and adulthood characterized by numerous biological, cognitive and socio-emotional changes (Santrock, 2005), which interestingly determines an individual´s adaptation to the environment (Gallahue, Ozmun & Goodway, 2011; Gomez, Ruiz & Mata, 2006). The main purpose of the study is to analyse the development of motor coordination in the adolescent stage investigating gender differences and age in relation to psychological variables, physical activity habits and anthropometric variables. The research design is structured in two studies. The first (transversal nature), analyses a representative sample of 1,966 adolescents from 1st to 4th of Secondary Education School. The second (longitudinal nature) used a group of 89 teenagers from cross-sectional study, which were studied for four years, from 12 to 15 years. The same instruments were used in both studies, namely; “Sportcomp Test” used to evaluate of motor coordination; “AMPET4 Test” which assesses the motivational achievement of learning Physical Education; “HBSC Inventory” to find out the healthy habits gained from physical activities; And finally a “stadiometer” was used to obtain the weight and height and thus calculate the body mass index (BMI). The data collection of the cross-sectional Study was conducted in two academic years (2011/12 - 2012/13), in which 3 sessions coinciding with the Physical Education level are required. In the first session, motor coordination was evaluated; questionnaires were applied in the second session (AMPET4 and HBSC); and in the last session the weight and height were measured in a reserved space for the “stadiometer”. Notably, data analysis was descriptive and differential in each of the variable studies: motor, psychological, practical and anthropometric habits of physical activity. Thus the tests were conducted in a univariate and multivariate analysis, calculating the p-value and effect tests. Regarding the Longitudinal Study, data collection was carried out during four years from 2011 to 2014 inclusively. The assessment of motor coordination was performed on each of the four years, however, the 2 questionnaires and anthropometric measures were evaluated in the first and fourth year. Data analyses were also descriptive and comparative among the variables that were put to the test. In the case of motor coordination tests, they were done on repeated measures, whilst, in the case of other variables analysed, they were accomplished through T Tests under comparable samples. The overall results showed that the engine Motor Index in Study 1 was progressive in all male gender studies, however in the females the performance remained constant after reaching 13 years of age. For the Longitudinal Study, this index is stabilized in the first 3 years and at the age of 14 is when the gender differences take place. In the case of males, the performance improves, however, in females worsens. The cross-sectional Study, analysis of variance showed differences in terms of age [F(7, 1958) = 220.70, p < .001; η2 = .101], gender [F(7, 1958) = 29.76, p <.001; η2 = .044], as well as their interaction [F(7, 1958) = 11.90, p <.001; η2 = .018]. They only show significant differences in respect to age in the male set sample, in all groups except between 14 and 15 years old. In the Longitudinal, the multivariate contrasts showed no significant differences in time [F(3,85) = 0.05, p = 0.987, η2 = 0.002] showing a stable level of coordination over the years, but if there were differences between both genders [F(3,85) = 4.64, p = .005] it took place with a noteworthy effect size (η2 = .141). In regards, to the Motivational Achievement for learning Physical Education, in both studies the male sample administered obtained higher scores on all the positive dimensions of the test (commitment to learning, self-assessed competence, and comparable competence). However, on the negative assessment side, namely, anxiety and fear of failure, the female sample scored higher than the male one. In Study 1, the multivariate analysis showed significant differences between the psychosocial dimensions and levels of motor coordination with moderate to significant effect [Lambada de Wilks = .931, F(8, 3282) = 14.99; p = <0.001; η2 = .035]. By the same token, the groups with the best level of motor coordination were the highest scoring ones in the positive dimensions, whilst the lower performing ones, performed better in the negative dimension. In the longitudinal study, there is also differences were also found between the first and fourth years of study in all dimensions, except in self-perceived motor competition. These differences resulted in a significant decrease in the 3 variables from first to fourth year. Regarding, the “HBSC Inventory”, the T test in the longitudinal study showed uniquely the existence of significant differences between the first and fourth year in 2 of the 11 items: perception of physical fitness (p = .006) and perceived health (p = 047), which diminished in the interval time of the study. In the Cross-sectional study, the se differences were also observed in gender (p < .001) and age (p < .001). Similarly, they showed significant differences in all items in respect to the motor coordination level, except in 2 of them; frequency of free time with friends outside of school (p = .580) and the ease to make friends at the educational centre (p = 098). And last but not least, the anthropometric variables, both the results of the Transversal and Longitudinal Study matched both height and weight, pointing out that in both studies a gradual increase in both genders, as they grow older. Notably in the Cross-sectional, these differences in age are found in all groups in both genders, except for the set of girls between 14 and 15 years. Thus both studies concluded that both gains in cm and kg and the mean scores were higher amongst males compared to females. Regarding BMI, the 2 studies concluded that the evolution is parallel, and as pointed cross-sectional study there isn’t differences found in age (p = 792) or in gender (p = 284). However, the Longitudinal study uniquely shows significant difference between the first and fourth year for male set sample [t (41) = -4.01, p < .001]. Finally, in relation to levels of motor coordination, there were significant differences in relation to BMI (p = .012), showing how the “normal weight group” matches the optimal scores of motor coordination. In conclusion, this study reveals how the acquisition of an optimal level of coordination is vital for psychological development, to develop and practice healthy habits, and to maintain a BMI within the normal range for age and gender. Therefore, the development of motor coordination is fundamental to achieving a state of physical and mental wellbeing, and preferable habits to pursuing physical activity.

A COMUNICAÇÃO NAS ORGANIZAÇÕES DESPORTIVAS NO BRASIL: profissionais e instrumentos

Este trabalho busca aprofundar o estudo sobre a comunicação nas organizações desportivas no Brasil, ampliando nossa contribuição para a socialização de informações referentes às organizações, instrumentos e profissionais. O objeto de estudo são as 49 organizações desportivas situadas no estado de São Paulo e reconhecidas pelo Ministério do Esporte. A metodologia adotada foi de estudo descritivo, a partir da observação participante, pesquisa documental e bibliográfica. Integram o estudo a pesquisa quantitativa e a análise de conteúdo dos sites das organizações e um resgate histórico desportivo e legislativo, no período que compreende o final do século XVII até o início do século XXI. O estudo aborda a formação do profissional que comanda a comunicação e os instrumentos de comunicação utilizados. Tem como objetivos específicos contribuir para superar uma lacuna na historiografia brasileira das organizações desportivas; conhecer quantas e quais são as organizações desportivas no Brasil e quais são as modalidades reconhecidas oficialmente pelo Ministério do Esporte; averiguar quantas organizações desportivas mantêm profissionais de comunicação ou departamentos de comunicação próprios ou terceirizados; investigar qual é a formação profissional da pessoa responsável pela comunicação nas organizações desportivas e averiguar quais são os instrumentos de comunicação utilizados pelas organizações. Conclui- se que há um campo inexplorado de mercado de trabalho para os profissionais de comunicação, recém-formados ou não, nas organizações desportivas, e são oferecidos um modelo de planejamento e um quadro de instrumentos de comunicação comumente utilizáveis. (AU)

A COMUNICAÇÃO NAS ORGANIZAÇÕES DESPORTIVAS NO BRASIL: profissionais e instrumentos

Este trabalho busca aprofundar o estudo sobre a comunicação nas organizações desportivas no Brasil, ampliando nossa contribuição para a socialização de informações referentes às organizações, instrumentos e profissionais. O objeto de estudo são as 49 organizações desportivas situadas no estado de São Paulo e reconhecidas pelo Ministério do Esporte. A metodologia adotada foi de estudo descritivo, a partir da observação participante, pesquisa documental e bibliográfica. Integram o estudo a pesquisa quantitativa e a análise de conteúdo dos sites das organizações e um resgate histórico desportivo e legislativo, no período que compreende o final do século XVII até o início do século XXI. O estudo aborda a formação do profissional que comanda a comunicação e os instrumentos de comunicação utilizados. Tem como objetivos específicos contribuir para superar uma lacuna na historiografia brasileira das organizações desportivas; conhecer quantas e quais são as organizações desportivas no Brasil e quais são as modalidades reconhecidas oficialmente pelo Ministério do Esporte; averiguar quantas organizações desportivas mantêm profissionais de comunicação ou departamentos de comunicação próprios ou terceirizados; investigar qual é a formação profissional da pessoa responsável pela comunicação nas organizações desportivas e averiguar quais são os instrumentos de comunicação utilizados pelas organizações. Conclui- se que há um campo inexplorado de mercado de trabalho para os profissionais de comunicação, recém-formados ou não, nas organizações desportivas, e são oferecidos um modelo de planejamento e um quadro de instrumentos de comunicação comumente utilizáveis. (AU)

Identification of a proline-binding motif regulating CD2-triggered T lymphocyte activation

An intracellular protein termed CD2 binding protein 2 (CD2BP2), which binds to a site containing two PPPGHR segments within the cytoplasmic region of CD2, was identified. Mutagenesis and NMR analysis demonstrated that the CD2 binding region of CD2BP2 includes a 17-aa motif (GPY[orF]xxxxM[orV]xxWxxx GYF), also found in several yeast and Caenorhabditis elegans proteins of unknown function. In Jurkat T cells, over-expression of the isolated CD2BP2 domain binding to CD2 enhances the production of interleukin 2 on crosslinking of CD2 but not the T cell receptor. Hence, a proline-binding module distinct from SH3 and WW domains regulates protein–protein interactions.

A nicked duplex decamer DNA with a PEG6 tether

A dumbbell double-stranded DNA decamer tethered with a hexaethylene glycol linker moiety (DDSDPEG), with a nick in the centre of one strand, has been synthesised. The standard NMR methods, E.COSY, TOCSY, NOESY and HMQC, were used to measure 1H, 31P and T1 spectral parameters. Molecular modelling using rMD-simulated annealing was used to compute the structure. Scalar couplings and dipolar contacts show that the molecule adopts a right-handed B-DNA helix in 38 mM phosphate buffer at pH 7. Its high melting temperature confirms the good base stacking and stability of the duplex. This is partly attributed to the presence of the PEG6 linker at both ends of the duplex that restricts the dynamics of the stem pentamers and thus stabilises the oligonucleotide. The inspection of the global parameters shows that the linker does not distort the B-DNA geometry. The computed structure suggests that the presence of the nick is not disturbing the overall tertiary structure, base pair geometry or duplex base pairing to a substantial extent. The nick has, however, a noticeable impact on the local geometry at the nick site, indicated clearly by NMR analysis and reflected in the conformational parameters of the computed structure. The 1H spectra also show much sharper resonances in the presence of K+ indicating that conformational heterogeneity of DDSDPEG is reduced in the presence of potassium as compared to sodium or caesium ions. At the same time the 1H resonances have longer T1 times. This parameter is suggested as a sensitive gauge of stabilisation.

Dynamics and orientation of N+(CD3)3-bromoacetylcholine bound to its binding site on the nicotinic acetylcholine receptor

Dynamic and structural information has been obtained for an analogue of acetylcholine while bound to the agonist binding site on the nicotinic acetylcholine receptor (nAcChoR), using wide-line deuterium solid-state NMR. Analysis of the deuterium lineshape obtained at various temperatures from unoriented nAcChoR membranes labeled with deuterated bromoacetylcholine (BAC) showed that the quaternary ammonium group of the ligand is well constrained within the agonist binding site when compared with the dynamics observed in the crystalline solids. This motional restriction would suggest that a high degree of complementarity exists between the quaternary ammonium group of the ligand and the protein within the agonist binding site. nAcChoR membranes were uniaxially oriented by isopotential centrifugation as determined by phosphorous NMR of the membrane phospholipids. Analysis of the deuterium NMR lineshape of these oriented membranes enriched with the nAcChoR labeled with N+(CD3)3-BAC has enabled us to determine that the angle formed between the quaternary ammonium group of the BAC and the membrane normal is 42° in the desensitized form of the receptor. This measurement allows us to orient in part the bound ligand within the proposed receptor binding site.

Multiple four-stranded conformations of human telomere sequence d(CCCTAA) in solution

By detailed NMR analysis of a human telomere repeating unit, d(CCCTAA), we have found that three distinct tetramers, each of which consists of four symmetric single-strands, slowly exchange in a slightly acidic solution. Our new finding is a novel i-motif topology (T-form) where T4 is intercalated between C1 and C2 of the other duplex. The other two tetramers have a topology where C1 is intercalated between C2 and C3 of the other parallel duplex, resulting in the non-stacking T4 residues (R-form), and a topology where C1 is stacked between C3 and T4 of the other duplex (S-form). From the NMR denaturation profile, the R-form is the most stable of the three structures in the temperature range of 15–50°C, the S-form the second and the T-form the least stable. The thermodynamic parameters indicate that the T-form is the most enthalpically driven and entropically opposed, and its population is increased with decreasing temperature. The T-form structure determined by restrained molecular dynamics calculation suggests that inter-strand van der Waals contacts in the narrow grooves should contribute to the enthalpic stabilization of the T-form.

Characterization of Chlamydomonas reinhardtii Zygote-Specific cDNAs That Encode Novel Proteins Containing Ankyrin Repeats and WW Domains1

Genes that are expressed only in the young zygote are considered to be of great importance in the development of an isogamous green alga, Chlamydomonas reinhardtii. Clones representing the Zys3 gene were isolated from a cDNA library prepared using zygotes at 10 min after fertilization. Sequencing of Zys3 cDNA clones resulted in the isolation of two related molecular species. One of them encoded a protein that contained two kinds of protein-to-protein interaction motifs known as ankyrin repeats and WW domains. The other clone lacked the ankyrin repeats but was otherwise identical. These mRNA species began to accumulate simultaneously in cells beginning 10 min after fertilization, and reached maximum levels at about 4 h, after which time levels decreased markedly. Genomic DNA gel-blot analysis indicated that Zys3 was a single-copy gene. The Zys3 proteins exhibited parallel expression to the Zys3 mRNAs at first, appearing 2 h after mating, and reached maximum levels at more than 6 h, but persisted to at least 1 d. Immunocytochemical analysis revealed their localization in the endoplasmic reticulum, which suggests a role in the morphological changes of the endoplasmic reticulum or in the synthesis and transport of proteins to the Golgi apparatus or related vesicles.

Visualization of intermediate and transition-state structures in protein-tyrosine phosphatase catalysis.

Engineering site-specific amino acid substitutions into the protein-tyrosine phosphatase (PTPase) PTP1 and the dual-specific vaccinia H1-related phosphatase (VHR), has kinetically isolated the two chemical steps of the reaction and provided a rare opportunity for examining transition states and directly observing the phosphoenzyme intermediate. Changing serine to alanine in the active-site sequence motif HCXXGXXRS shifted the rate-limiting step from intermediate formation to intermediate hydrolysis. Using phosphorus 31P NMR, the covalent thiol-phosphate intermediate was directly observed during catalytic turnover. The importance of the conserved aspartic acid (D92 in VHR and D181 in PTP1) in both chemical steps was established. Kinetic analysis of D92N and D181N mutants indicated that aspartic acid acts as a general acid by protonating the leaving-group phenolic oxygen. Structure-reactivity experiments with native and aspartate mutant enzymes established that proton transfer is concomitant with P-O cleavage, such that no charge develops on the phenolic oxygen. Steady- and presteady-state kinetics, as well as NMR analysis of the double mutant D92N/S131A (VHR), suggested that the conserved aspartic acid functions as a general base during intermediate hydrolysis. As a general base, aspartate would activate a water molecule to facilitate nucleophilic attack. The amino acids involved in transition-state stabilization for cysteinylphosphate hydrolysis were confirmed by the x-ray structure of the Yersinia PTPase complexed with vanadate, a transition-state mimic that binds covalently to the active-site cysteine. Consistent with the NMR, x-ray, biochemical, and kinetic data, a unifying mechanism for catalysis is proposed.

Induction of a Cryphonectria parasitica cellobiohydrolase I gene is suppressed by hypovirus infection and regulated by a GTP-binding-protein-linked signaling pathway involved in fungal pathogenesis.

Extracellular cellulase activity is readily induced when the chestnut blight fungus Cryphonectria parasitica is grown on cellulose substrate as the sole carbon source. However, an isogenic C. parasitica strain rendered hypovirulent due to hypovirus infection failed to secrete detectable cellulase activity when grown under parallel conditions. Efforts to identify C. parasitica cellulase-encoding genes resulted in the cloning of a cellobiohydrolase (exoglucanase, EC 3.2.1.91) gene designated chb-1. Northern blot analysis revealed an increase in cbh-1 transcript accumulation in a virus-free virulent C. parasitica strain concomitant with the induction of extracellular cellulase activity. In contrast, induction of cbh-1 transcript accumulation was suppressed in an isogenic hypovirus-infected strain. Significantly, virus-free C. parasitica strains rendered hypovirulent by transgenic cosuppression of a GTP-binding protein alpha subunit were also found to be deficient in the induction of cbh-1 transcript accumulation.

The product of the ataxia-telangiectasia group D complementing gene, ATDC, interacts with a protein kinase C substrate and inhibitor.

Ataxia-telangiectasia (AT) is an autosomal recessive human genetic disease characterized by immunological, neurological, and developmental defects and an increased risk of cancer. Cells from individuals with AT show sensitivity to ionizing radiation, elevated recombination, cell cycle abnormalities, and aberrant cytoskeletal organization. The molecular basis of the defect is unknown. A candidate AT gene (ATDC) was isolated on the basis of its ability to complement the ionizing radiation sensitivity of AT group D fibroblasts. Whether ATDC is mutated in any AT patients is not known. We have found that the ATDC protein physically interacts with the intermediate-filament protein vimentin, which is a protein kinase C substrate and colocalizing protein, and with an inhibitor of protein kinase C, hPKCI-1. Indirect immunofluorescence analysis of cultured cells transfected with a plasmid encoding an epitope-tagged ATDC protein localizes the protein to vimentin filaments. We suggest that the ATDC and hPKCI-1 proteins may be components of a signal transduction pathway that is induced by ionizing radiation and mediated by protein kinase C.

Scorpion toxins as natural scaffolds for protein engineering.

A compact, well-organized, and natural motif, stabilized by three disulfide bonds, is proposed as a basic scaffold for protein engineering. This motif contains 37 amino acids only and is formed by a short helix on one face and an antiparallel triple-stranded beta-sheet on the opposite face. It has been adopted by scorpions as a unique scaffold to express a wide variety of powerful toxic ligands with tuned specificity for different ion channels. We further tested the potential of this fold by engineering a metal binding site on it, taking the carbonic anhydrase site as a model. By chemical synthesis we introduced nine residues, including three histidines, as compared to the original amino acid sequence of the natural charybdotoxin and found that the new protein maintains the original fold, as revealed by CD and 1H NMR analysis. Cu2+ ions are bound with Kd = 4.2 x 10(-8) M and other metals are bound with affinities in an order mirroring that observed in carbonic anhydrase. The alpha/beta scorpion motif, small in size, easily amenable to chemical synthesis, highly stable, and tolerant for sequence mutations represents, therefore, an appropriate scaffold onto which polypeptide sequences may be introduced in a predetermined conformation, providing an additional means for design and engineering of small proteins.

Two helices plus a linker: a small model substrate for eukaryotic RNase P.

Using precursor tRNA molecules to study RNA-protein interactions, we have identified an RNA motif recognized by eukaryotic RNase P (EC 3.1.26.5). Analysis of circularly permuted precursors indicates that interruptions in the sugar-phosphate backbone are not tolerated in the acceptor stem, in the T stem-loop, or between residues A-9 and G-10. Prokaryotic RNase P will function with a minihelix consisting of the acceptor stem connected directly to the T stem-loop. Eukaryotic RNase P cannot use such a minimal substrate unless a linker sequence is added in the gap where the D stem and anticodon stem-loop were deleted.

Desenvolvimento e avaliação de métodos de extração e separação cromatográfica em colunas monolíticas e superficialmente porosas para determinação de herbicidas triazínicos em solos e águas

O uso de pesticidas levou ao aumento da produtividade e qualidade dos produtos agrícolas, porém o seu uso acarreta na intoxicação dos seres vivos pela ingestão gradativa de seus resíduos que contaminam o solo, a água e os alimentos. Dessa forma, há a necessidade do monitoramento constante de suas concentrações nos compartimentos ambientais. Para isto, busca-se o desenvolvimento de métodos de extração e enriquecimento de forma rápida, com baixo custo, gerando um baixo volume de resíduos, contribuindo com a química verde. Dentre estes métodos destacam-se a extração por banho de ultrassom e a extração por ponto nuvem. Após o procedimento de extração, o extrato obtido pode ser analisado por técnicas de Cromatografia a Líquido de Alta Eficiência (HPLC) e a Cromatografia por Injeção Sequencial (SIC), empregando fases estacionárias modernas, tais como as monolíticas e as partículas superficialmente porosas. O emprego de SIC com coluna monolítica (C18, 50 x 4,6 mm) e empacotada com partículas superficialmente porosas (C18, 30 x 4,6 mm, tamanho de partícula 2,7 µm) foi estudado para separação de simazina (SIM) e atrazina (ATR), e seus metabólitos, desetilatrazina (DEA), desisopropilatrazina (DIA) e hidroxiatrazina (HAT). A separação foi obtida por eluição passo-a-passo, com fases móveis compostas de acetonitrila (ACN) e tampão Acetato de Amônio/Ácido acético (NH4Ac/HAc) 2,5 mM pH 4,2. A separação na coluna monolítica foi realizada com duas fases móveis: MP1= 15:85 (v v-1) ACN:NH4Ac/HAc e MP2= 35:65 (v v-1) ACN:NH4Ac/HAc a uma vazão de 35 µL s-1. A separação na coluna com partículas superficialmente porosas foi efetivada com as fases móveis MP1= 13:87 (v v-1) ACN: NH4Ac/HAc e MP2= 35:65 (v v-1) ACN:NH4Ac/HAc à vazão de 8 µL s-1. A extração por banho de ultrassom em solo fortificado com os herbicidas (100 e 1000 µg kg-1) resultou em recuperações entre 42 e 160%. A separação de DEA, DIA, HAT, SIM e ATR empregando HPLC foi obtida por um gradiente linear de 13 a 35% para a coluna monolítica e de 10 a 35% ACN na coluna com partículas superficialmente porosas, sendo a fase aquosa constituída por tampão NH4Ac/HAc 2,5 mM pH 4,2. Em ambas as colunas a vazão foi de 1,5 mL min-1 e o tempo de análise 15 min. A extração por banho de ultrassom das amostras de solo com presença de ATR, fortificadas com concentrações de 250 a 1000 µg kg-1, proporcionou recuperações entre 40 e 86%. A presença de ATR foi confirmada por espectrometria de massas. Foram realizados estudos de fortificação com ATR e SIM em amostras de água empregando a extração por ponto nuvem com o surfactante Triton-X114. A separação empregando HPLC foi obtida por um gradiente linear de 13 a 90% de ACN para a coluna monolítica e de 10 a 90% de ACN para a coluna empacotada, sempre em tampão NH4Ac/HAc 2,5 mM pH 4,2. Em ambas as colunas a vazão foi de 1,5 mL min-1 e o tempo de análise 16 min. Fortificações entre 1 e 50 µg L-1 resultaram em recuperações entre 65 e 132%.

Investigação de mecanismos genéticos e epigenéticos em distúrbios do crescimento humano

Parcela considerável de pacientes com distúrbios de crescimento não têm a causa de seus quadros clínicos estabelecida, incluindo aproximadamente 50% dos pacientes com diagnóstico clínico de síndrome de Silver−Russell (SRS) e 10-20% dos pacientes com síndrome de Beckwith-Wiedemann (BWS). O objetivo deste estudo foi investigar as causas genéticas e epigenéticas de distúrbios de crescimento, de etiologia desconhecida, numa contribuição para o entendimento de mecanismos que regulam o crescimento. O estudo compreendeu: (1) a investigação de microdesequilíbrios cromossômicos, por aCGH; (2) a análise do perfil de expressão alelo-específica de genes sujeitos a imprinting (IG), por pirossequenciamento (PSQ) ou sequenciamento de Sanger; (3) a investigação do padrão de metilação global em pacientes com restrição de crescimento, utilizando microarray de metilação. A casuística constituiu-se de 41 pacientes não aparentados, com distúrbios de crescimento, de etiologia desconhecida: (1) 25, com hipótese diagnóstica de SRS; (2) seis, com restrição de crescimento intrauterino e peso ao nascimento abaixo do 10º percentil, associados a outros sinais clínicos; (3) sete, com hipótese diagnóstica de BWS; e (4) três, com macrossomia pré-natal ou pós-natal, associada a outros sinais. A investigação de microdesequilíbrios cromossômicos foi realizada em 40 pacientes. Foram detectadas 58 variantes raras em 30/40 pacientes (75%): 40 foram consideradas provavelmente benignas (18 pacientes, 45%), 12, com efeito patogênico desconhecido (11 pacientes, 27,5%), duas, provavelmente patogênicas (um paciente, 2,5%) e quatro, patogênicas (três pacientes, 7,5%). Essas frequências são comparáveis àquelas descritas em estudos que investigaram CNV em grupos de pacientes com distúrbios de crescimento e outras alterações congênitas, incluindo SRS, e mostram a importância da investigação de microdesequilíbrios cromossômicos nesses pacientes. A diversidade dos microdesequilíbrios cromossômicos identificados é reflexo da heterogeneidade clínica das casuísticas. Neste estudo, muitos dos pacientes com hipótese diagnóstica de SRS e BWS apresentavam sinais clínicos atípicos, explicando a ausência neles das alterações (epi)genéticas que causam essas síndromes. A identificação de CNV características de outras síndromes reflete a sobreposição de sinais clínicos com BWS e SRS. A análise do perfil de expressão alelo-específica de IG foi realizada em um subgrupo de 18 pacientes com restrição de crescimento. Trinta IG com função em proliferação celular, crescimento fetal ou neurodesenvolvimento foram inicialmente selecionados. Após seleção de SNP transcritos com alta frequência na população, genotipagem de pacientes, genitores e indivíduos controle, determinação da expressão dos IG em sangue periférico e seu padrão de expressão (mono ou bialélico), 13 IG, expressos no sangue, tiveram a expressão alelo-específica avaliada, sete deles por PSQ e seis por sequenciamento de Sanger. Alterações no perfil de expressão de dois genes, de expressão normalmente paterna, foram detectadas em 4/18 pacientes (22%). Este estudo é o primeiro a utilizar pirossequenciamento e sequenciamento de Sanger na avaliação do perfil de expressão alelo-específica de IG, em pacientes com restrição de crescimento. Apesar de terem limitações, ambas as técnicas mostraram-se robustas e revelaram alterações de expressão alélica interessantes; entretanto, a relação dessas alterações com o quadro clínico dos pacientes permanece por esclarecer. A investigação da metilação global do DNA foi realizada em subgrupo de 21 pacientes com restrição de crescimento e em 24 indivíduos controle. Dois tipos de análise foram realizados: (1) análise diferencial de grupo e (2) análise diferencial individual. Na primeira análise, em que foi comparado o padrão de metilação do grupo de pacientes com quadro clínico sugestivo de SRS (n=16) com o do grupo controle (n=24), não houve indicação de hipo ou hipermetilação global no grupo SRS. Na segunda análise, foi comparado o padrão de metilação de cada um dos 21 pacientes com restrição de crescimento e dos 24 indivíduos controle, com o padrão de metilação do grupo controle. O número médio de CpG hipermetilados e de segmentos diferencialmente metilados (SDM) foi significativamente maior nos pacientes. Foram identificados 82 SDM hipermetilados, estando 57 associados a gene(s) (69,5%), em 16 pacientes, e 51 SDM hipometilados, 41 deles associados a gene(s) (80,4%), em 10 pacientes. A análise de ontologia genética dos 61 genes associados aos SDM hipo ou hipermetilados nos pacientes destacou genes que atuam no desenvolvimento e na morfogênese do sistema esquelético e de órgãos fetais, e na regulação da transcrição gênica e de processos metabólicos. Alterações de metilação em genes que atuam em processos de proliferação e diferenciação celulares e crescimento foram identificadas em 9/20 dos pacientes (45%), sugerindo implicação clínica. Não foi detectada alteração epigenética comum aos pacientes com diagnóstico clínico de SRS, explicável provavelmente pela heterogeneidade clínica. A investigação de metilação global, utilizando microarray, produziu novos dados que podem contribuir para a compreensão de mecanismos moleculares que influenciam o crescimento pré- e pós-natal. Na translocação aparentemente equilibrada - t(5;6)(q35.2;p22.3)dn, detectada em paciente com suspeita clínica de SRS, a interrupção de um gene, pela quebra no cromossomo 6, pode ser a causa do quadro clínico; alternativamente, a translocação pode ter impactado a regulação de genes de desenvolvimento localizados próximos aos pontos de quebra. A análise de expressão em sangue periférico mostrou que os níveis de cDNA do gene, interrompido pelo ponto de quebra da translocação, estavam reduzidos à metade. Além de sinais típicos da SRS, a paciente apresentava algumas características clínicas sugestivas de displasia cleidocraniana. Assim, a translocação t(5;6) pode ter alterado a interação de genes de desenvolvimento e seus elementos reguladores, levando à desregulação de sua expressão espaço-temporal, e resultando num fenótipo atípico, com características sobrepostas de mais de uma síndrome genética