Extraction, purification et caractérisation d’isoformes d’hexokinase du tubercule de pomme de terre (Solanum tuberosum)

L’hexokinase (HK) est la première enzyme du métabolisme des hexoses et catalyse la réaction qui permet aux hexoses d’entrer dans le pool des hexoses phosphates et donc par le fait même la glycolyse. Bien que le glucose soit son principal substrat, cette enzyme peut aussi phosphoryler le mannose et le fructose. Malgré son importance dans le métabolisme primaire, l’HK n’a jamais été purifiée à homogénéité sous forme native. Le but de ce travail était donc de purifier une isoforme d’HK à partir de tubercule de Solanum tuberosum et par la suite de caractériser ses propriétés cinétiques. Bien avant que je commence mon travail, un groupe de recherche avait déjà séparé et partiellement purifié trois isoformes d’HK de S. tuberosum. Un protocole d’extraction était donc disponible, mais l’HK ainsi extraite était peu stable d’où le besoin d’y apporter certaines modifications. En y ajoutant certains inhibiteurs de protéases ainsi qu’en modifiant les concentrations de certains éléments, le tampon d’extraction ainsi modifié a permis d’obtenir un extrait dont l’activité HK était stable pendant au moins 72h après l’extraction, en empêchant la dégradation. À l’aide du tampon d’extraction optimisé et d’une chromatographie sur colonne de butyl sépharose, il a été possible de séparer 4 isoformes d’HKs. Par la suite, une isoforme d’HK (HK1) a été purifiée à l’homogénéité à l’aide de 5 étapes de chromatographie supplémentaires. En plus de caractériser les propriétés cinétiques de cette enzyme, l’analyse de séquençage par MS/MS a permis de l’associer au produit du gène StHK1 de Solanum tuberosum. Avec une activité spécifique de 10.2 U/mg de protéine, il s’agit de l’HK purifiée avec l’activité spécifique la plus élevée jamais rapportée d’un tissu végétal.L’ensemble des informations recueillies lors de la purification de HK1 a ensuite été utilisée pour commencer la purification d’une deuxième isoforme (HK3). Ce travail a permis de donner des lignes directrices pour la purification de cette isoforme et certains résultats préliminaires sur sa caractérisation enzymatique.

La responsabilité des intermédiaires techniques en droit pénal canadien, à la lumière des pratiques internationales

La question de la responsabilité pénale des intermédiaires techniques est un enjeu central et actuel dans la réglementation du cyberespace. Non seulement les implications économiques sont énormes mais c'est tout le cadre juridique de la responsabilité pénale des intermédiaires techniques qui est en cause. Or, l'environnement Internet comporte des spécificités qui rendent difficiles l'imputation de responsabilité à l'auteur de l'activité illicite qui peut alors se retrouver hors d'atteinte ou insolvable. La poursuite des intermédiaires techniques devient alors une solution envisageable aux autorités chargées de réprimer les délits, compte tenu de l'état de leur solvabilité et dans la mesure où ils sont plus facilement identifiables. Par le fait même, ces derniers se retrouvent alors pris dans l'engrenage judiciaire pour n'avoir que facilité la commission de l'activité en question, n'ayant aucunement pris part à la réalisation de celle-ci. L'absence dans le corpus législatif canadien d'un régime de responsabilité spécifiquement applicable aux intermédiaires techniques nous oblige à baliser les critères qui emportent leur responsabilité pénale, à partir de «principes directeurs» d'imputabilité se dégageant de plusieurs textes nationaux et internationaux. Dans ce contexte, le mémoire étudiera, dans un premier temps, les conditions d'ouverture de la responsabilité pénale des intermédiaires techniques en droit pénal canadien et, dans un deuxième temps, répondra à la question de savoir si le droit pénal canadien en matière d'imputabilité des intermédiaires techniques est conforme aux principes directeurs ressortant de normes et pratiques internationales.

Étude empirique des commentaires et application des techniques de résumé par extraction pour la redocumentation

La documentation des programmes aide les développeurs à mieux comprendre le code source pendant les tâches de maintenance. Toutefois, la documentation n’est pas toujours disponible ou elle peut être de mauvaise qualité. Le recours à la redocumentation s’avère ainsi nécessaire. Dans ce contexte, nous proposons de faire la redocumentation en générant des commentaires par application de techniques de résumé par extraction. Pour mener à bien cette tâche, nous avons commencé par faire une étude empirique pour étudier les aspects quantitatifs et qualitatifs des commentaires. En particulier, nous nous sommes intéressés à l’étude de la distribution des commentaires par rapport aux différents types d’instructions et à la fréquence de documentation de chaque type. Aussi, nous avons proposé une taxonomie de commentaires pour classer les commentaires selon leur contenu et leur qualité. Suite aux résultats de l’étude empirique, nous avons décidé de résumer les classes Java par extraction des commentaires des méthodes/constructeurs. Nous avons défini plusieurs heuristiques pour déterminer les commentaires les plus pertinents à l’extraction. Ensuite, nous avons appliqué ces heuristiques sur les classes Java de trois projets pour en générer les résumés. Enfin, nous avons comparé les résumés produits (les commentaires produits) à des résumés références (les commentaires originaux) en utilisant la métrique ROUGE.

Synthèse et caractérisation physicochimique de peptides de polyglutamines

Neuf maladies neurodégénératives sont le produit de l’expression de gènes mutés, dans lesquels le codon CAG est répété au-delà d’un seuil pathologique. Ceci produit des protéines mutantes dans lesquelles sont insérés des segments de polyglutamines (polyGln), qui perdent leur activité et acquièrent une nouvelle fonction, ce qui est toxique pour le neurone. Ces altérations sont attribuables aux propriétés particulières de la polyGln. En effet, ces dernières possèdent la capacité de s’assembler pour former des corps d’inclusion intracellulaires. Cette propension à l’agrégation de la polyGln rend difficile l’étude de ces pathologies. C’est ainsi que l’utilisation de peptides peut s’avérer une approche avantageuse. Toutefois, la synthèse de polyGln est associée à de nombreuses délétions et nécessite l’ajout de groupements chargés afin de permettre leur purification. Cependant, ce prérequis donne lieu à des interactions électrostatiques qui biaisent la structure et la cinétique d’agrégation de ces peptides, en plus d’interférer avec l’évaluation d’éventuels agents thérapeutiques. L’objectif du projet est de développer un système permettant l’étude de la polyGln en s’affranchissant des effets de charges. Pour ce faire, deux approches ont été explorées, la première utilise la polyGln non chargée et la seconde utilise une structure polyGln-morpholine ayant des charges labiles en fonction du pH. Ces peptides ont été produits en utilisant une approche linéaire de synthèse peptidique sur support solide avec protection maximale des chaînes latérales. La purification a été effectuée par chromatographie de haute performance en phase inverse en milieu acide. Ces stratégies ont permis de produire des peptides de polyGln de grande pureté avec des rendements acceptables. Une procédure de solubilisation des peptides alliant sonication et lyophilisation a été développée afin d’étudier chacun de ces peptides à l’aide de diverses techniques physicochimiques, telles que la diffusion de la lumière, la spectroscopie de résonance magnétique nucléaire, Raman et UV-visible, le dichroïsme circulaire et la microscopie optique polarisée. La polyGln non chargée solubilisée dans le trifluoroéthanol-eau a montré que la taille des particules et la vitesse d’agrégation sont proportionnelles à la fraction volumique en eau. De plus, la structure secondaire en solution est à prédominance alpha et semble être peu sensible à la fraction d’eau jusqu’à un certain seuil (25%) après lequel la structure aléatoire prédomine. L’analyse des agrégats à l’état solide montre des structures hélicoïdales > aléatoires et ont les caractéristiques des fibrilles amyloïdes. Le peptide de polyGln-morpholines a un pKa de 7,3 en milieu aqueux. Il demeure en solution lorsque le pH < pKa et à faible force ionique, alors qu’il s’autoassemble lorsque ces conditions ne sont pas respectées. Ceci suggère que la répulsion électrostatique est responsable de la stabilisation du peptide en solution. La dimension fractale nous indique que le peptide forme des agrégats compacts dont les constituants ont une taille de 2,5 nm, compatibles avec une conformation aléatoire compacte, en coude bêta ou hélicoïdale. Ceci est en accord avec l’étude structurale des peptides en solution qui a montré des espèces aléatoires > bêta > alpha. De plus, en RMN, l’élargissement des signaux du 1Hγ en cours d’agrégation suggère une interaction via les chaînes latérales. Les analyses en phase solide ont plutôt montré une prédominance de structures bêta et alpha. L’inhibition de l’agrégation à pH 8 varie selon rouge de Congo > tréhalose, alors que le peptide liant la polyGln 1 et la thioflavine T ne semble pas avoir d’effet. Ces approches ont donc permis pour la première fois de s’affranchir des effets de charges auparavant inhérents à l’étude de la polyGln en solution et par conséquent d’obtenir des informations inédites quant à la solubilité, la structure et la cinétique d’agrégation. Enfin, le dispositif à charges labiles permet d’évaluer l’efficacité d’éventuels agents thérapeutiques à pH quasi physiologique.

Caractérisation de la migration du virus Herpès simplex de type 1 (HSV-1) par protéomique

Le virus Herpès simplex de type 1 (HSV-1), agent étiologique des feux sauvages, possède une structure multicouche comprenant une capside icosaédrale qui protège le génome viral d’ADN, une couche protéique très structurée appelée tégument et une enveloppe lipidique dérivant de la cellule hôte et parsemée de glycoprotéines virales. Tous ces constituants sont acquis séquentiellement à partir du noyau, du cytoplasme et du réseau trans-golgien. Cette structure multicouche confère à HSV-1 un potentiel considérable pour incorporer des protéines virales et cellulaires. Toutefois, l’ensemble des protéines qui composent ce virus n’a pas encore été élucidé. De plus, malgré son rôle critique à différentes étapes de l’infection, le tégument demeure encore mal défini et ce, tant dans sa composition que dans la séquence d’addition des protéines qui le composent. Toutes ces incertitudes quant aux mécanismes impliqués dans la morphogenèse du virus nous amènent à l’objectif de ce projet, soit la caractérisation du processus de maturation d’HSV-1. Le premier article présenté dans cette thèse et publié dans Journal of Virology s’attarde à la caractérisation protéique des virus extracellulaires matures. Grâce à l’élaboration d’un protocole d’isolation et de purification de ces virions, une étude protéomique a pu être effectuée. Celle-ci nous a permis de réaliser une cartographie de la composition globale en protéines virales des virus matures (8 protéines de la capside, 23 protéines du tégument et 13 glycoprotéines) qui a fait la page couverture de Journal of Virology. De plus, l’incorporation potentielle de 49 protéines cellulaires différentes a été révélée. Lors de cette étude protéomique, nous avons aussi relevé la présence de nouveaux composants du virion dont UL7, UL23, ICP0 et ICP4. Le deuxième article publié dans Journal of General Virology focalise sur ces protéines via une analyse biochimique afin de mieux comprendre les interactions et la dynamique du tégument. Ces résultats nous révèlent que, contrairement aux protéines ICP0 et ICP4, UL7 et UL23 peuvent être relâchées de la capside en présence de sels et que les cystéines libres jouent un rôle dans cette relâche. De plus, cet article met en évidence la présence d’ICP0 et d’ICP4 sur les capsides nucléaires suggérant une acquisition possible du tégument au noyau. La complexité du processus de morphogenèse du virus ainsi que la mise en évidence d’acquisition de protéines du tégument au noyau nous ont incités à poursuivre nos recherches sur la composition du virus à un stade précoce de son cycle viral. Les capsides C matures, prémisses des virus extracellulaires, ont donc été isolées et purifiées grâce à un protocole innovateur basé sur le tri par cytométrie en flux. L’analyse préliminaire de ces capsides par protéomique a permis d’identifier 28 protéines virales et 39 protéines cellulaires. Les données recueilles, comparées à celles obtenues avec les virus extracellulaires, suggèrent clairement un processus séquentiel d’acquisition des protéines du tégument débutant dans le noyau, site d’assemblage des capsides. Finalement, tous ces résultats contribuent à une meilleure compréhension du processus complexe de maturation d’HSV-1 via l’utilisation de techniques variées et innovatrices, telles que la protéomique et la cytométrie en flux, pouvant être appliquées à d’autres virus mais aussi permettre le développement de meilleurs traitements pour vaincre l’HSV-1.

Nouvelles techniques d'investigation de la latéralisation du langage à l'aide de l'électrophysiologie et de l'imagerie optique

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Étude de techniques d'apprentissage non-supervisé pour l'amélioration de l'entraînement supervisé de modèles connexionnistes

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Optimisation quadratique en variables binaires : quelques résultats et techniques

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Analyse critique de la validité des études scientifiques infirmières sur l'efficacité des techniques de relaxation : une revue intégrative

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Optimisation de l'utilisation des techniques de modélisation dans le passage de l'étape pré-clinique à clinique du développement d'un médicament

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Inférence exacte simulée et techniques d'estimation dans les modèles VAR et VARMA avec applications macroéconomiques

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Purification and identification of specific RNA-binding protein that binds to the 3'UTR region of cytochrome P450aromatase mRNA in bovine granulosa cells

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Analyse, à l'aide d'oculomètres, de techniques de visualisation UML de patrons de conception pour la compréhension de programmes

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Detection and quantification of staphylococcus aureus enterotoxin B in food product using isotopic dilution techniques and mass spectrometry

L’entérotoxine B staphylococcique (SEB) est une toxine entérique hautement résistante à la chaleur et est responsable de plus de 50 % des cas d’intoxication d’origine alimentaire par une entérotoxine. L’objectif principal de ce projet de maîtrise est de développer et valider une méthode basée sur des nouvelles stratégies analytiques permettant la détection et la quantification de SEB dans les matrices alimentaires. Une carte de peptides tryptiques a été produite et 3 peptides tryptiques spécifiques ont été sélectionnés pour servir de peptides témoins à partir des 9 fragments protéolytiques identifiés (couverture de 35 % de la séquence). L’anhydride acétique et la forme deutérée furent utilisés afin de synthétiser des peptides standards marqués avec un isotope léger et lourd. La combinaison de mélanges des deux isotopes à des concentrations molaires différentes fut utilisée afin d’établir la linéarité et les résultats ont démontré que les mesures faites par dilution isotopique combinée au CL-SM/SM respectaient les critères généralement reconnus d’épreuves biologiques avec des valeurs de pente près de 1, des valeurs de R2 supérieure à 0,98 et des coefficients de variation (CV%) inférieurs à 8 %. La précision et l’exactitude de la méthode ont été évaluées à l’aide d’échantillons d’homogénat de viande de poulet dans lesquels SEB a été introduite. SEB a été enrichie à 0,2, 1 et 2 pmol/g. Les résultats analytiques révèlent que la méthode procure une plage d’exactitude de 84,9 à 91,1 %. Dans l’ensemble, les résultats présentés dans ce mémoire démontrent que les méthodes protéomiques peuvent être utilisées efficacement pour détecter et quantifier SEB dans les matrices alimentaires. Mots clés : spectrométrie de masse; marquage isotopique; protéomique quantitative; entérotoxines

Validation in-vivo des techniques d’élastographie ultrasonore, invasive et non-invasive, à l’aide d’un modèle porcin

Il est maintenant admis que la composition de la plaque athérosclérotique est un déterminant majeur de sa vulnérabilité à se rompre. Vu que la composition de la plaque affecte ses propriétés mécaniques, l'évaluation locale des propriétés mécaniques de la plaque d'athérome peut nous informer sur sa vulnérabilité. L'objectif est de comparer les techniques d’élastographie ultrasonores endovasculaire (EVE) et non-invasive (NIVE) en fonction de leur potentiel à identifier les composantes calcifiées et lipidiques de la plaque. Les acquisitions intravasculaire et extravasculaire ont été effectuées sur les artères carotidiennes de neuf porcs hypercholestérolémiques à l’aide d’un cathéter de 20 MHz et d'une sonde linéaire de 7.5 MHz, respectivement. Les valeurs de déformation radiale et axiale, rapportés par EVE et NIVE, ont été corrélées avec le pourcentage des zones histologiques calcifiées et lipidiques pour cinq plaques. Nos résultats démontrent une bonne corrélation positive entre les déformations et les composantes calcifiées (r2 = 0.82, P = 0.034 valeur par EVE et r2 = 0.80, P = 0.041 valeur par NIVE). Une forte corrélation entre les déformations axiales et les contenus lipidiques par NIVE (r2 = 0.92, P-value = 0.010) a été obtenue. En conclusion, NIVE et EVE sont des techniques potentielles pour identifier les composants de la plaque et aider les médecins à diagnostiquer précocement les plaques vulnérables.