Involvement of the RNA-binding protein ARE/poly(U)-binding factor 1 (AUF1) in the cytotoxic effects of proinflammatory cytokines on pancreatic beta cells.

AIMS/HYPOTHESIS: Chronic exposure of pancreatic beta cells to proinflammatory cytokines leads to impaired insulin secretion and apoptosis. ARE/poly(U)-binding factor 1 (AUF1) belongs to a protein family that controls mRNA stability and translation by associating with adenosine- and uridine-rich regions of target messengers. We investigated the involvement of AUF1 in cytokine-induced beta cell dysfunction. METHODS: Production and subcellular distribution of AUF1 isoforms were analysed by western blotting. To test for their role in the control of beta cell functions, each isoform was overproduced individually in insulin-secreting cells. The contribution to cytokine-mediated beta cell dysfunction was evaluated by preventing the production of AUF1 isoforms by RNA interference. The effect of AUF1 on the production of potential targets was assessed by western blotting. RESULTS: MIN6 cells and human pancreatic islets were found to produce four AUF1 isoforms (p42>p45>p37>p40). AUF1 isoforms were mainly localised in the nucleus but were partially translocated to the cytoplasm upon exposure of beta cells to cytokines and activation of the ERK pathway. Overproduction of AUF1 did not affect glucose-induced insulin secretion but promoted apoptosis. This effect was associated with a decrease in the production of the anti-apoptotic proteins, B cell leukaemia/lymphoma 2 (BCL2) and myeloid cell leukaemia sequence 1 (MCL1). Silencing of AUF1 isoforms restored the levels of the anti-apoptotic proteins, attenuated the activation of the nuclear factor-κB (NFκB) pathway, and protected the beta cells from cytokine-induced apoptosis. CONCLUSIONS/INTERPRETATION: Our findings point to a contribution of AUF1 to the deleterious effects of cytokines on beta cell functions and suggest a role for this RNA-binding protein in the early phases of type 1 diabetes.

The Interleukin-1 receptor antagonist is a direct target gene of PPARalpha in liver.

BACKGROUND/AIMS: The Peroxisome Proliferator-Activated Receptor (PPAR) alpha belongs to the superfamily of Nuclear Receptors and plays an important role in numerous cellular processes, including lipid metabolism. It is known that PPARalpha also has an anti-inflammatory effect, which is mainly achieved by down-regulating pro-inflammatory genes. The objective of this study was to further characterize the role of PPARalpha in inflammatory gene regulation in liver. RESULTS: According to Affymetrix micro-array analysis, the expression of various inflammatory genes in liver was decreased by treatment of mice with the synthetic PPARalpha agonist Wy14643 in a PPARalpha-dependent manner. In contrast, expression of Interleukin-1 receptor antagonist (IL-1ra), which was acutely stimulated by LPS treatment, was induced by PPARalpha. Up-regulation of IL-1ra by LPS was lower in PPARalpha -/- mice compared to Wt mice. Transactivation and chromatin immunoprecipitation studies identified IL-1ra as a direct positive target gene of PPARalpha with a functional PPRE present in the promoter. Up-regulation of IL-1ra by PPARalpha was conserved in human HepG2 hepatoma cells and the human monocyte/macrophage THP-1 cell line. CONCLUSIONS: In addition to down-regulating expression of pro-inflammatory genes, PPARalpha suppresses the inflammatory response by direct up-regulation of genes with anti-inflammatory properties.

Transcriptional activation of the utrophin promoter B by a constitutively active Ets-transcription factor.

Duchenne muscular dystrophy is an X-linked genetic disease caused by the absence of functional dystrophin. Pharmacological upregulation of utrophin, the autosomal homologue of dystrophin, offers a potential therapeutic approach to treat Duchenne patients. Full-length utrophin mRNA is transcribed from two alternative promoters, called A and B. In contrast to the utrophin promoter A, little is known about the factors regulating the activity of the utrophin promoter B. Computer analysis of this second promoter revealed the presence of several conserved binding motives for Ets-transcription factors. Using electrotransfer of cDNA into mouse muscles, we demonstrate that a genetically modified beta-subunit of the Ets-transcription factor GA-binding protein potently activates a utrophin promoter B reporter construct in innervated muscle fibers in vivo. These results make the GA-binding protein and the signaling cascade regulating its activity in muscle cells, potential targets for the pharmacological modulation of utrophin expression in Duchenne patients.

Elections in 2009? Progress and obstacles in the construction of peace in the Ivory Coast

In 2002 in the Ivory Coast three months of armed conflict ended with the division of the country. Two regions were separated by an interposition line controlled by the French Forces Licorne. This significant peace process was maintained over time, but characterized for lack of mutual confidence and political immobility, which led to an impasse and the continuation of Laurent Gbagbo in the presidency. Moreover, the peace building process was less successful because the different political agreements failed to address some of the main national problems, such as land property and identity issues. The following paper aims first to analyze the main facts and causes that instigated the conflict since the coup d’état in 2002. Secondly, the paper will analyze the peace process and point out the key elements of the Ouagadougou Peace Agreement (2007): the creation of a new and unique armed forces structure, as well as the identification of the population and implementation of an electoral process. The main goal is to provide the International Catalan Institute for Peace (ICIP) a working tool in order to send an electoral observation mission to this African country by November 2009.

CHO expression of a novel human recombinant IgG1 anti-RhD antibody isolated by phage display.

Replacement of the hyperimmune anti-Rhesus (Rh) D immunoglobulin, currently used to prevent haemolytic disease of the newborn, by fully recombinant human anti-RhD antibodies would solve the current logistic problems associated with supply and demand. The combination of phage display repertoire cloning with precise selection procedures enables isolation of specific genes that can then be inserted into mammalian expression systems allowing production of large quantities of recombinant human proteins. With the aim of selecting high-affinity anti-RhD antibodies, two human Fab libraries were constructed from a hyperimmune donor. Use of a new phage panning procedure involving bromelin-treated red blood cells enabled the isolation of two high-affinity Fab-expressing phage clones. LD-6-3 and LD-6-33, specific for RhD. These showed a novel reaction pattern by recognizing the D variants D(III), D(IVa), D(IVb), D(Va), D(VI) types I and II. D(VII), Rh33 and DFR. Full-length immunoglobulin molecules were constructed by cloning the variable regions into expression vectors containing genomic DNA encoding the immunoglobulin constant regions. We describe the first, stable, suspension growth-adapted Chinese hamster ovary (CHO) cell line producing a high affinity recombinant human IgG1 anti-RhD antibody adapted to pilot-scale production. Evaluation of the Fc region of this recombinant antibody by either chemiluminescence or antibody-dependent cell cytotoxicity (ADCC) assays demonstrated macrophage activation and lysis of red blood cells by human lymphocytes. A consistent source of recombinant human anti-RhD immunoglobulin produced by CHO cells is expected to meet the stringent safety and regulatory requirements for prophylactic application.

Highly inducible synthesis of heterologous proteins in epithelial cells carrying a glucocorticoid-responsive vector.

A glucocorticoid-responsive vector is described which allows for the highly inducible expression of complementary DNAs (cDNAs) in stably transfected mammalian cell lines. This vector, pLK-neo, composed of a variant mouse mammary tumor virus long terminal repeat promoter, containing a hormone regulatory element, a Geneticin resistance-encoding gene in a simian virus 40 transcription unit, and a polylinker insertion site for heterologous cDNAs, was used to express the polymeric immunoglobulin (poly-Ig) receptor and the thymocyte marker, Thy-1, in Madin-Darby canine kidney (MDCK) cells and in murine fibroblast L cells. A high level of poly-Ig receptor or Thy-1 mRNA accumulation was observed in MDCK cells in response to dexamethasone with a parallel ten- to 200-fold increase in protein synthesis depending on the recombinant protein and the transfected cell clone.

Giardia survey in live-trapped small domestic and wild mammals in four regions in the southwest region of the State of São Paulo, Brazil

For the first time, a survey on Giardia in the live-trapped small domestic and wild mammals was perfomed in four regions of state of the São Paulo, Brazil, with special attention to the parasitism of Rattus rattus rattus by Giardia. This species was found infected in all studied sites: Botucatu (15.4%), Conchas (28.5%), Itaporanga (38.7%) and São Roque (100 %). Two new hosts and their frequency of infection were described for Giardia in Nectomys squamipes, an aquatic rodent and in Bolomys lasiurus, a forest rodent (100 % and 14.3 %, respectively). Both G. muris and G. duodenalis groups were found in scrapings of intestinal mucosa of those rodents. Mixed infection was observed in some animals. It is important to emphasize the infection by G. duodenalis in the black rat as this species lives as a comensal with man and in N. squamipes as it may contaminate small streams used for domestic consumption. Therefore, further investigation will be necessary to elucidate the potential of these rodents to act as reservoirs of Giardia for man.

Análisis comparativo de tres técnicas de derivación de células madre

Las células madre embrionarias (Embryonic Stem Cells; ESC) son células pluripotentes que presentan la capacidad de dividirse indefinidamente a la vez que mantienen la habilidad para diferenciarse a cualquier tipo celular. Aunque de manera rutinaria se derivan a partir de la masa celular interna de embriones en estadio de blastocisto, también pueden derivarse a partir de embriones en estadios precompactacionales y de embriones reconstruidos por procesos de transferencia nuclear. Debido a que durante el desarrollo embrionario temprano, momento en el que se derivan las ESC, tienen lugar profundos cambios de metilación en el genoma, tanto la derivación como el cultivo se consagran como técnicas que pueden alterar los patrones de metilación en genes regulados por impronta genómica. Con el objetivo de analizar la estabilidad epigenética de embriones preimplantacionales y ESC murinas, en este trabajo se ha optimizado un protocolo de anàlisis de los niveles de metilación mediante pirosecuenciación. Para ello se han seleccionado tres genes regulados por impronta genómica (H19/Igf2, Snrpn and Peg3), dos genes relacionados con el mantenimiento de pluripotencia en ESC (Oct4, Nanog y Sox2) y dos genes marcadores de diferenciación temprana (Cdx2 y Gata6). Nuestros resultados muestran que algunos grupos de embriones preimplantacionales presentan una hipo e hipermetilación en las regiones diferencialmente metiladas (Differentially Methylated Regions, DMRs) de los genes Snrpn y Peg3. Además, la línea de ESC analizada presentó anomalías en los tres genes regulados por impronta genómica. No obstante, el hecho de que esta línea fuera inestable a nivel cariotípico no permite establecer una relación entre el cultivo in vitro o la técnica de derivación y la inestabilidad epigenética demostrada. Por todo esto, parece pertinente analizar tanto la integridad epigenética como la estabilidad cromosómica de ESC antes de proceder a realizar ensayos clínicos en humanos.

Widespread occurrence of non-canonical transcription termination by human RNA polymerase III.

Human RNA polymerase (Pol) III-transcribed genes are thought to share a simple termination signal constituted by four or more consecutive thymidine residues in the coding DNA strand, just downstream of the RNA 3'-end sequence. We found that a large set of human tRNA genes (tDNAs) do not display any T(≥4) stretch within 50 bp of 3'-flanking region. In vitro analysis of tDNAs with a distanced T(≥4) revealed the existence of non-canonical terminators resembling degenerate T(≥5) elements, which ensure significant termination but at the same time allow for the production of Pol III read-through pre-tRNAs with unusually long 3' trailers. A panel of such non-canonical signals was found to direct transcription termination of unusual Pol III-synthesized viral pre-miRNA transcripts in gammaherpesvirus 68-infected cells. Genome-wide location analysis revealed that human Pol III tends to trespass into the 3'-flanking regions of tDNAs, as expected from extensive terminator read-through. The widespread occurrence of partial termination suggests that the Pol III primary transcriptome in mammals is unexpectedly enriched in 3'-trailer sequences with the potential to contribute novel functional ncRNAs.

Detection of promoter activity by flow cytometric analysis of GFP reporter expression.

Low efficiency of transfection is often the limiting factor for acquiring conclusive data in reporter assays. It is especially difficult to efficiently transfect and characterize promoters in primary human cells. To overcome this problem we have developed a system in which reporter gene expression is quantified by flow cytometry. In this system, green fluorescent protein (GFP) reporter constructs are co-transfected with a reference plasmid that codes for the mouse cell surface antigen Thy-1.1 and serves to determine transfection efficiency. Comparison of mean GFP expression of the total transfected cell population with the activity of an analogous luciferase reporter showed that the sensitivity of the two reporter systems is similar. However, because GFP expression can be analyzed at the single-cell level and in the same cells the expression of the reference plasmid can be monitored by two-color fluorescence, the GFP reporter system is in fact more sensitive, particularly in cells which can only be transfected with a low efficiency.

A right to a national space of communication? : on Stateless nations, their right to a space of communication of their own

Hem establert les bases metodològiques i teòriques per investigar la pregunta “Tenen les nacions sense estat el dret de controlar el seu propi espai de comunicació?”. La investigació ajusta el concepte d’espai de comunicació a la teoria política, cercant els seus límits en els drets individuals i, des de la perspectiva del liberalisme 2, aportant la justificació del seu control en quant que plataforma que incideix en la conservació i supervivència d’una cultura nacional. El primer article i fase de la tesi és l’adaptació i definició del concepte espai de comunicació. Fins ara, la recerca ha proposat diferents models d’espai de comunicació entenent si es tracta d’una visió emfatitzant la distribució i la producció de material marcat amb els símbols de la identitat nacional de la societat emissora, o bé si emfatitza la idea d’un espai de circulació de fluxos comunicatiu ajustat a un territori tradicionalment vinculat a una identitat nacional o nació sense estat. Igualment, es distingeix la dimensió d’emissió –sortir del territori al món- i la de recepció –fluxos informatius rebuts des del món al territori, concretament, al ciutadà; el paper d’intervenció de les institucions democràtiques és diferent en una dimensió o una altra i, per tant, també són diferents els drets afectats i les teories o principis que neguen o justifiquen el control de l’espai de comunicació. També s’ha indagat en les teories sobre els efectes cognitius dels mitjans de comunicació per relacionar-los amb la construcció nacional com a cohesió simbòlica i cultural. Si bé els mitjans no poden fer canviar de pensament immediatament, sí que poden conformar a llarg termini una percepció nacional general. Una comunitat és imaginada, donada la distància física dels seus components, i la comunicació social és, juntament amb l’educació, el principal factor de construcció nacional, avui en dia.

Sistema didàctic per millorar l'aprenetatge de la representació del espai arquitectònic amb ajuts "on line"

El projecte ha tingut com a finalitat cobrir un buit en la formació dels estudiants pel que respecta a les seves limitacions en l’aprenentatge de les diferents estratègies i metodologies de treball. Aquest buit ens ha fet pensar en l’elaboració d’un sistema didàctic que possibiliti una comunicació fluida amb l’alumne i que pugui anar més enllà de l’àmbit específic de les aules. Es per això que la nostra proposta té com a referent un aprofitament més racional del temps de treball de l’estudiant. Per tal d’arribar a aquesta finalitat ens hem plantejat un grup d’objectius concrets ordenats segons els dos nivells d’assoliment següents: Nivell 1: - Definir un material didàctic que pugui transmetre de la manera més objectiva possible les eines necessàries per tal que l’alumne resolgui un conjunt de problemes concrets. - Proporcionar a l’estudiant un procediment didàctic basat en un grup de tasques amb un material de suport on ha de posar a prova l’aplicabilitat dels conceptes donats a les classes teòriques. - Partir d’un sistema que permeti a l’alumne tenir una referència constant de recolzament teòric fora de les aules quan està resolent les pràctiques assignades en el curs. - Definir unes característiques funcionals del material utilitzat en l’activitat pràctica de tal manera que sigui un instrument efectiu per al control del propi estudiant sobre el seu procés d’avaluació. Nivell 2: - Fer servir una metodologia d’activitats pràctiques on es puguin accentuar les capacitats de resposta creativa individual de l’estudiant. - Plantejar l’intercanvi d’experiències i propostes d’estratègies per a la resolució dels temes pràctics mitjançant sessions de seminaris prèvies a les pràctiques. - Promoure unes relacions transversals amb altres àrees de coneixement de tal manera que l’alumne pugui vincular la seva resposta a les activitats pràctiques proposades per altres assignatures, amb els coneixements adquirits a la nostra assignatura.

Statmedia 3 : activitats on-line individualitzades d'estadística i matemàtiques als ensenyaments de Ciències Experimentals i Socials

El projecte Statmedia 3 ha consolidat definitivament la proposta de les assignatures Bioestadística de Biologia, Anàlisi de dades de Ciències Ambientals i d’Estadística Matemàtica de la Diplomatura renovant una part del material creat amb Statmedia 2. S’han inclòs a més Matemàtiques d’Ambientals i Introducció a la Probabilitat del Grau d’Estadística. L’anterior MQD abastava només pràctiques mentre que aquest projecte permet una oferta diversa d’activitats individualitzades. La individualització consisteix en que cada estudiant rep una proposta de cas personalitzada amb dades diferents. Les activitats poden ser programades presencialment o no, però la clau de l’èxit de l’activitat és que l’alumne obtingui reconeixement del seu treball en l’avaluació continuada. La valoració que fan als alumnes de Statmedia és molt bo, i observem que es produeix una millora en els resultats acadèmics. Statmedia 3 ha implicat un important esforç en la vessant informàtica del projecte, la barreja de tecnologies que utilitzem son punteres: Ajax, servlets i applets Java... Hem posat a punt un assistent on-line per dissenyar documents i planificar activitats que facilita la tasca dels professors. La nostre participació en primera línea del procés de convergència a l’EEES ens ha permès anticipar alguns canvis, i s’ha traduït en que el claustre del Departament d’Estadística assumís que Statmedia és una metodologia essencial dels seus plans docents. El projecte continua en un quart projecte MQD consecutiu, on desplegarem la nova tecnologia implementada. L’objectiu principal serà dotar a les assignatures dels 7 graus on participa el departament d’activitats individualitzades en forma de casos pràctics, problemes i proves diverses. La col·lecció de material emmagatzemada en la nostra biblioteca, forjada després de quasi deu anys de treball continuat, juntament amb l’experiència acumulada de com utilitzar Statmedia de la forma més eficient han començat a ser explotades en els nous graus aquest mateix curs 2009-2010.