海洋红藻多管藻和松节藻的化学成分及抗氧化活性研究

海洋生物具有产生丰富多样的次生代谢产物的能力，其中红藻门松节藻科海藻卤代次生代谢产物以其结构新颖、生物活性独特引起了天然产物化学家的重视。 本论文对海洋红藻多管藻和松节藻进行了化学成分研究，综合利用各种色谱学方法 (硅胶柱层析、反相硅胶柱层析、凝胶Sephadex LH-20柱层析、半制备高效液相色谱以及重结晶等) 和现代波谱学技术 (IR、UV、EI-MS、FAB-MS、HR-ESI-MS、CD、1H-NMR、13C-NMR、DEPT、1H-1H COSY、HSQC、HMBC等)，共分离鉴定了100个化合物，发现25个新化合物。 从多管藻中分离鉴定38个化合物 (24个溴酚化合物)，其中7个新化合物 (均为溴酚化合物)，包括1个菲并呋喃结构溴酚 (P1), 2个二氢菲结构溴酚 (P2, P3)，1个含 5,7-dihydrodibenzo[c,e]oxepine 结构溴酚 (P4)和3个简单溴酚 (P5, P6, P7)。P1 (urceolatin) 属首例报道的具有菲并呋喃结构的天然产物，从该种中分离的化合物P12 和 P13 可能是其生源合成的前体。P2和P3为第二例报道的具有二氢菲结构的溴酚化合物。 从松节藻中分离并鉴定了62 个化合物，其中18 个为溴酚类新化合物，44 个为已知化合物。化合物具有多变的取代基团，包括2 个脲基吡咯烷酮溴酚化合物 (R1, R2), 4 个γ-脲基丁酸溴酚化合物 (R3-R6)，5 个酰胺溴酚化合物 (R7, R8, R9, R13, R14)，1 个溴酚砜化合物 (R12), 1 个Xanthene 溴酚化合物 (R10)和5 个简单溴酚化合物 (R11, R15, R16, R17, R18)。R1、R2 是首例报道的含有脲基吡咯烷酮片段的天然产物，R10 为首次报道的溴代Xanthene 类天然产物。 对分离到的化合物进行了清除DPPH 和ABTS两种自由基活性的筛选。结果发现溴酚类天然产物具有显著的DPPH自由基清除活性，其中R3 的IC50 仅为3.3 μM, 其活性强度约为阳性对照BHT (IC50 为82.1 μM) 的24倍。另外，溴酚类天然产物对ABTS自由基有较强的清除活性，R2 的TEAC（Trolox efficency activity capacity）值为5.2 mM，约为阳性对照 (ascorbic acid, 1.02 mM) 的 5 倍。初步的构效关系研究发现，稠环分子、多羟基和邻位甲氧基等结构特点能有效增强DPPH 自由基清除活性；特殊取代基如脲基、吡咯烷酮等含有氮原子的基团，能有效增强ABTS 自由基清除活性，多羟基、溴代等结构特点也使其活性有所增强。 本研究结果丰富了海藻卤代化合物的结构类型，为多管藻和松节藻的合理利用提供了一定的科学依据。

两种真核微藻类胡萝卜素代谢工程的初步研究

类胡萝卜素在生物体内具有重要的生理功能，其中虾青素的抗氧化活性、提高动物的免疫能力，预防癌症等生理功能更为显著。类胡萝卜素的代谢工程在大肠杆菌、酵母和高等植物中已取得了较大的进展。本文对真核微藻类胡萝卜素代谢工程进行了初步的探索。 1．克隆雨生红球藻β-胡萝卜素羟化酶基因crtR-B，基因枪法转入衣藻叶绿体，经强光处理转化子，HPLC分析表明细胞的叶黄素库（V＋A＋Z）量较野生型增加，表明是外源的β-胡萝卜素羟化酶将β-胡萝卜素生成玉米黄素。 2．克隆雨生红球藻β-胡萝卜素酮化酶基因bkt，基因枪法转入衣藻叶绿体，RT-PCR及RT-PCR Southern blot分析表明外源基因具有转录活性，但未检测到转化子中积累虾青素。 3．根据盐生杜氏藻大量积累β-胡萝卜素的特点，对其遗传转化体系进行了研究。发现20 µg/ml草丁膦Basta，能够完全抑制1.0×106个/ml细胞生长；通过GUS报告基因在细胞内的瞬时表达，确立了轰击压力450 psi、距离6 cm为基因枪法转化盐生杜氏藻的最佳条件；将bar基因转入细胞，得到稳定的转化子，初步建立了盐生杜氏藻稳定遗传转化体系。克隆了盐生杜氏藻八氢番茄红素合成酶基因psy的cDNA序列、基因组序列及psy基因上游459 bp片段。 本文首次开展了衣藻类胡萝卜素代谢工程研究，发现在强光处理下，衣藻crtR-B转化子外源的羟化酶作用使叶黄素库量增加，实现了对衣藻类胡萝卜素代谢途径的修饰。确立了bar基因为选择标记、Basta为筛选试剂的基因枪转化盐生杜氏藻的遗传转化体系，并克隆了其内源的psy基因5’上游序列，为通过基因工程手段在盐生杜氏藻细胞内积累虾青素奠定了基础。

甲壳质、壳聚糖生产废水中虾青素、蛋白质的回收及壳聚糖在水处理中的应用

近年来，甲壳质生产发展迅速，但是在生产过程中所产生的废水引发了一系列的环境污染问题，对于该废水的处理，目前尚未有行之有效的方法，大多数生产厂家仍处于无处理排放状态。本文在处理甲壳质、壳聚糖生产废水的同时回收得到了具有多种生物学功能的虾青素以及可以作为饲料添加剂的粗蛋白，这对于我国甲壳质、壳聚糖产业的发展以及保护我国近海环境具有重要的意义；另一方面，壳聚糖因其具有优良的吸附性能、螯合性能、可再生性及生物降解性，在水处理工艺中已经显示出广阔的应用前景，本研究中将壳聚糖应用于甲壳质、壳聚糖生产废水以及海藻工业水处理工艺中，这样既保护了环境又达到了资源综合利用的目的，并且节约了能源和资源。 首先研究了从甲壳质、壳聚糖生产废水中回收提取虾青素以及所得的虾青素对DPPH自由基的清除作用。分别采用单元有机溶剂、二元有机溶剂作为萃取剂从废水中回收虾青素，并确定了有机溶剂萃取的最佳条件，实验结果表明，二元有机溶剂萃取的效果优于单元有机溶剂萃取的效果；将得到的虾青素经HPLC分析，游离虾青素的含量达30.02%；最后，对所得的虾青素进行了有机自由基DPPH的清除作用的测定，结果表明，所得的虾青素具有很强的清除DPPH自由基的能力，IC50可以达到0.84mg/ml。 将得到的虾青素进行了深加工，合成了虾青素-β-环糊精的包合物。结果表明，当虾青素与β-环糊精形成包合物时，虾青素与β-环糊精以1：4的比例进行包合，包合物的水溶性稍好于虾青素（虾青素不溶于水）；在水相中，包合物很容易形成超分子结构；包合物中虾青素对温度和光的稳定性明显增强。 其次，研究了甲壳质、壳聚糖生产废水中蛋白质的回收技术，通过实验确定了蛋白质回收的最佳条件；并对所得的蛋白质沉淀进行了氨基酸分析，结果表明，该沉淀中含有丰富的氨基酸，其总量可以达到20.56%，这些结果表明该沉淀可以开发为饲料用蛋白质添加剂。 在回收虾青素和蛋白质的同时，对甲壳质、壳聚糖生产废水处理新工艺的开发，并且确定了最佳实验条件。经过处理后的废水由青岛市环境保护监测站监测结果表明，处理后的废水达到了国家二级排放标准。 利用壳聚糖对海藻工业水进行了处理，结果表明，壳聚糖絮凝海带工业水中“糖胶”的效果明显优于工业生产中通常使用的方法，在此基础上确定了壳聚糖作为絮凝剂对海带工业水进行处理的最佳实验条件。在本研究中还测定了I-浓度的变化，从I-的浓度变化来看，应用本方法处理海带工业水不影响碘的提取。

三种红藻活性物质的发现及松节藻醇提物抗糖尿病药理研究

海藻是海洋生物中的一大类群，由于其特殊的生活环境，能够代谢产生大量结构独特多变和活性特殊多样的代谢产物，是化学和生物活性多样性研究的重要对象之一。我国海域辽阔，海藻资源丰富，为寻找结构新颖、生理活性独特的先导化合物，加强对海藻资源的开发利用，本论文对中国沿海的三种海洋红藻进行了化学成分和生物活性研究，同时对山东青岛海域生物量丰富的一种海洋红藻松节藻进行了动物体内抗糖尿病活性研究。 利用正相硅胶柱色谱、Sephadex LH-20柱色谱以及反相HPLC和重结晶等现代分离手段，对山东青岛沿海的红藻扇形叉枝藻（Gymnogongrus flabelliformis）进行了系统的化学成分研究，从中得到单体化合物26个，通过波谱学方法（IR、MS、NMR等）鉴定了他们的结构，分别为(3R,6R,7E)-(+)-3-O-phenylacetyl- 4,7-megastigmadiene-9-one（1），(3R,7E)-(-)-3-O-phenylacetyl-5,7-megastigmadiene -9-one（2），(3S,6R,7E)-(+)-3-hydroxyl-4,7-megastigmadien-9-one（3），(3S,5R,6S,7E)- (-)-3-hydroxy-5,6-epoxy-7-megastigmene-9-one（4），(3S,5S,6R,7E)-(+)-3-hydroxy- 5,6-epoxy-7-megastigmene-9-one（5），Dehydrovomifoliol（6），(3R)-(-)-4-[(2R,4S)-4- acetoxy-2-hydroxy-2,6,6-trimethylcyclohexylidene]-3-buten-2-one（7），2,3,3′-三溴-4,4′,5,5′-四羟基-1′-乙氧甲基双苯基甲烷（8），2,2′,3,3′-四溴-4,4′,5,5′-四羟基双苯基甲烷（9），3-溴-4,5-二羟基苯甲醛（10），2,3-二溴-4,5-二羟基苯甲基甲醚（11），2,3-二溴-4,5-二羟基苯甲醇（12），N, N-二甲基酪胺（13），4-羟基苯甲酸乙酯（14），4-羟基苯甲基乙醚（15），4-羟基苯乙基乙酯（16），4-羟基苯乙酸甲酯（17），4-羟基苯甲醛（18），豆甾-4-烯-3-酮（19），胆甾-4-烯-3-酮（20），胆甾醇（21），尿嘧啶（22），尿嘧啶核苷（23），腺嘌呤核苷（24），丁二酸（25），5-羟基-4-甲基-5-戊基-2,5-二氢呋喃-2-酮（26）。其中化合物1、2为新化合物，化合物3为新天然产物，所有化合物均为首次从该属海藻中分离得到。通过 MTT 法对部分单体化合物进行了肿瘤细胞毒活性筛选, 结果表明，化合物8、9、10、12对筛选的所有细胞株均有较强细胞毒活性，化合物11对人肺癌细胞株（A549）、人肝癌细胞株（Bel 7402）、人结肠癌细胞株（HCT-8）有一定细胞毒活性。通过研究单体化合物对小鼠腹腔巨噬细胞TNF-分泌的影响，对其进行抗炎活性筛选，结果表明，化合物8、9、11、13、17、23、24、25对小鼠腹腔巨噬细胞TNF-分泌表现出明显的抑制作用。 从采自山东荣成镆铘岛的红藻小珊瑚藻（Corallina pilulifera）的乙酸乙酯萃取物中分离得到16个单体化合物，通过波谱学方法鉴定化合物结构14个（另外2个正在鉴定中），分别为2α-乙氧酰基-2β-羟基-A-降胆甾-5-烯-4-酮（27），胆甾-4-烯-3-酮（28），胆甾醇（29），3β-羟基-胆甾-5,24(28)-二烯-7-酮（30），2α-羟基-胆甾-4-烯-3-酮（31），6α-羟基-胆甾-4-烯-3-酮（32），3β-羟基-胆甾-5-烯-7-酮（33），(E)-phytol epoxide（34），Phytenal（35），3,7,11,15- tetramethyl-hexadec-2-en-1-oll（Phytol）（36），Loloilide（37），(3S,5R,6S,7E)-(-)-3-hydroxy-5,6-epoxy-7- megastigmene-9-one（38），Dehydrovomifoliol（39），4-羟基苯甲醛（40）。其中，化合物 31为新天然产物，化合物27为首次从植物中分离得到，所有化合物均为首次从该种海藻中分离得到。通过 MTT 法对分离得到的单体化合物进行了肿瘤细胞毒活性筛选,化合物27和化合物32对筛选的所有肿瘤细胞株均有细胞毒活性，且化合物27对人胃癌细胞株（BGC-823）、人结肠癌细胞株（HCT-8）和人卵巢癌细胞株（A2780）具有中等强度抑制活性。化合物28、化合物31和化合物33对人肝癌细胞株（Bel 7402）、人结肠癌细胞株（HCT-8）和人卵巢癌细胞株（A2780）有一定细胞毒活性。 从采自广西北海涠洲岛的多管藻Polysiphonia sp.的乙酸乙酯萃取物中分离得到6个单体化合物，通过波谱学方法鉴定化合物结构5个（另外1个仍在鉴定），分别为胆甾醇（41），3,7,11,15-tetramethyl-hexadec-2-en-1-ol（Phytol）（42），3-吲哚甲醛（43），4-羟基苯甲醛（44），4-羟基苯甲酸（45）。 对山东青岛沿海的松节藻 (Rhodomela confervoides) 乙醇提取物进行了初步的体内抗糖尿病活性研究，采用链脲佐菌素诱导的2型糖尿病（STZ-DM）大鼠模型对其进行体内降糖实验，结果发现，松节藻乙醇提取物在糖尿病大鼠体内不仅具有显著的降血糖作用，且呈现良好的量–效关系，而且能够纠正糖尿病引发的物质代谢紊乱，增加体重，提高试验动物的成活率，因此具有良好的应用开发前景。

红树林植物海榄雌化学成分研究

本论文对红树林植物海榄雌的化学成分进行了研究，对其中分离得到的部分化合物进行了初步的生物活性筛选。 海榄雌采自海南东寨港，样品干燥后用氯仿甲醇（1：1）浸泡提取，合并提取物，先后用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取。得到石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相和水相。 各部分采用常规的硅胶柱层析、制备薄层层析、凝胶Sephadex LH-20柱层析、反相硅胶柱层析、半制备HPLC以及重结晶等手段分离得到28个化合物。利用各种现代波谱技术(IR、UV、ESI-MS、FAB-MS、HR-FAB-MS、1D-NMR、2D-NMR等)，确定了其中20个化合物的结构，其中包括2个新化合物：化合物A1 2′-O-(5-phenyl-2E, 4E-pentadienoyl)mussaenosidic acid和化合物A2 2′-O-(p-methoxycinnamoyl)mussaenosidic acid，以及13个首次从海榄雌中报道的化合物。 对得到的20个化合物A1－A20进行了DPPH自由基清除活性筛选，化合物A4、A5、A6和A16表现出较好的活性，其IC50分别为9.61 μg/mL、8.55 μg/mL、11.72 μg/mL和7.73 μg/mL；化合物A13和A15表现出中等强度的DPPH自由基清除活性，其IC50分别为34.80 μg/mL和44.90 μg/mL；其他化合物只表现出微弱活性，其IC50均大于100 μg/mL；阳性对照BHT的IC50为18.00 μg/mL。 对分离得到的部分样品进行了抑菌活性测试，各样品在测试浓度下对测试菌均未表现出明显的抑菌活性。

红树林植物木榄和一株海藻内生真菌的化学成分研究

本论文对民间药用红树植物木榄（Bruguiera gymnorrhiza）中的次生代谢产物进行了研究，同时还对分离自似瘤凹顶藻（Laurencia similis Namet Saito）的内生真菌EN21（Exophiala oligosperma）进行了化学成分研究。对分离得到的部分化合物进行了初步的DPPH自由基清除活性和抗菌活性筛选。 采用常规的硅胶柱层析、反相硅胶柱层析、制备薄层层析、凝胶Sephadex LH-20 柱层析、半制备型高效液相色谱（HPLC）以及重结晶等手段，从木榄（Bruguiera gymnorrhiza）中分离得到23个化合物；从EN21（Exophiala oligosperma）中分离得到23个化合物。利用一维、二维核磁、质谱、元素分析等各种现代波谱技术及化学反应方法，确定了木榄中20个化合物的结构，包括黄酮单体化合物5个，三萜类化合物11个，甾体化合物2个，长链烷烃2个，其中4个化合物为首次从木榄中报道的黄酮；确定了EN-21中20个化合物的结构，其中脑苷脂1个，甾体化合物7个，芳环化合物3个，三萜类化合物2个，包括1个新天然产物。本文系首次报道Exophiala oligosperma 的化学成分。 对从木榄中分离得到的部分化合物进行了DPPH自由基清除活性筛选， 发现黄酮类化合物BRG-1、BRG-2、BRG-3 、BRG-4显示了较强的DPPH自由基清除活性，而三萜类化合物则未表现出DPPH自由基清除活性。抗菌筛选实验中所有测试样品未显示出活性。 研究结果充实了红树林植物和海藻内生真菌代谢产物的内容，为其有效利用提供了一定的科学依据。

两种海洋生物次生代谢产物的研究

本论文对多指软珊瑚（Sinularia numerosa）和鼠尾藻（Sargassum thunbergii）两种海洋生物的化学成分进行了研究，对从其中分离得到的大部分化合物进行了初步的生物活性筛选。 多指软珊瑚采自海南三亚，样品经冷冻干燥并粉碎后用丙酮浸泡提取得到提取物；鼠尾藻采自山东青岛沿岸，样品干燥后用乙醇提取，将提取物先后用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，得到石油醚相、乙酸乙酯相和正丁醇相提取物。 采用常规的硅胶柱层析、反相硅胶柱层析、凝胶Sephadex LH-20柱层析、制备薄层层析、重结晶以及半制备HPLC等手段分离得到38个化合物。利用各种现代波谱技术（IR、UV、MS、HR-MS、1D-NMR、2D-NMR等），确定了其中27个化合物的结构。其中，从多指软珊瑚中得到30个化合物，鉴定了其中得19个化合物，包括2个新的西松烷二萜类化合物（化合物SN1，命名为Numerolides A；化合物SN2，命名为Numerolides B）、1个新的甾醇类化合物（化合物SN3，命名为Gorgost-3β, 7β-diol）以及15个首次从该种中报道的化合物。从鼠尾藻中分离鉴定了8个化合物，包括植醇、岩藻甾醇、2个单萜类化合物、1个环戊烯酮类化合物及3个不饱和长链化合物，这些化合物皆为首次从该种中报道。对大部分化合物作了针对人肝癌细胞株SMMC-7721体外细胞毒活性和抗菌活性筛选，所测样品均未显示针对SMMC-7721的细胞毒活性，而化合物SN15具有中等强度的抑制金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的活性，化合物SN19有促进金黄色葡萄球菌生长的活性。

海洋红藻鸭毛藻化学成分及抗氧化活性的研究

本论文采用DPPH（αα-二苯基-β-苦味酰自由基）自由基清除法和β-胡萝卜素-亚油酸氧化法对采自青岛沿海的28种海藻的粗提物进行了抗氧化活性筛选，以2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)、没食子酸(GA)和抗坏血酸(AscA)作为阳性对照。结果发现大多数海藻都表现了不同程度的抗氧化活性。其中，鸭毛藻Symphyocladia latiuscula的抗氧化活性最强。 鸭毛藻粗提物的乙酸乙酯相在两种方法中都表现了最强的抗氧化活性，乙酸乙酯相通过VLC被进一步分为7个组分(F1–F7)。其中F1对DPPH自由基的清除率最强，而在β-胡萝卜素-亚油酸实验中F4的抗氧化活性最强。 另外，还测定了粗提物、各相和各组分的总酚含量和还原能力。其中28种海藻粗提物的总酚含量变化范围为0.10到8.00 mg没食子酸/g海藻干重，还原能力变化范围为0.07到11.60mg抗坏血酸/g海藻干重。统计分析发现，对于粗提物和各相，抗氧化活性和总酚含量以及和还原能力都存在很强的正相关。这些结果将有助于进一步分析抗氧化活性强的海藻，从而确定活性原理。 由于鸭毛藻的抗氧化活性最强，所以对它的化学成分做进一步的调查。采用硅胶柱层析、制备薄层层析、凝胶Sephadex LH-20柱层析、反相硅胶柱层析、半制备HPLC及重结晶等手段分离得到19个化合物。运用各种现代波谱技术（IR、UV、ESI-MS、EI-MS、FAB-MS、HR-FAB-MS、1D-NMR、2D-NMR等）鉴定了它们的结构，其中包括4个新化合物：化合物S1 1-(2,3,6-三溴-4,5-二羟基苄基)-四氢吡咯-2-酮、化合物S2 1,2-双(2,3,6-三溴-4,5-二羟基苯基)乙烷、化合物S3 6-(2,3,6-三溴-4,5-二羟基苄基)-2,5-二溴-3,4-二羟基苄甲醚和化合物S4 2,3,6-三溴-4,5-二羟基苄甲砜，以及5个已知化合物和10个首次从鸭毛藻中报道的化合物。 分离到的溴酚化合物S1-S10具有显著的DPPH自由基清除活性，其IC50值在8.1-24.7 µM之间，且它们的活性是BHT（IC50 = 81.8 µM）的3.3到10倍左右。初步的构-效关系研究发现，分子中的羟基数目与活性有直接关系。

两种海洋生物内生真菌的化学成分及其生物活性研究

海洋微生物次生代谢产物是海洋天然产物研究的重要组成部分。其中海洋真菌因其代谢可以产生大量结构新颖活性独特的化合物，已经成为天然药物的重要来源。近来已经有许多关于海洋生物内生真菌的生理活性次生代谢的报道，为寻找发现新的药物先导化合物提供了可能。本论文对一株毛壳霉属海藻内生真菌Chaetomium sp和一株红树林内生真菌的次生代谢产物的化学成分进行了研究，对其中分离得到的化合物进行了初步的生物活性筛选。 毛壳霉属海藻内生真菌Chaetomium sp.系从青岛近海采集的红藻多管藻Polysiphonia urceolate Grev中分离得到。红树林内生真菌Fs系从采自中国南海红树林植物海桑Sonneratia caseolaris中分离得到。对这两株真菌分别进行了发酵培养，对真菌培养物的菌丝体和发酵液分别用甲醇和乙酸乙脂进行提取。将提取液经减压蒸干后经HPLC检测，两部分基本相同，合并进行化学分离。 对发酵提取物采用常规的硅胶柱层析、制备薄层层析、凝胶Sephadex LH-20柱层析、反相硅胶柱层析，重结晶以及半制备高效液相色谱等分离手段，得到单体化合物。利用各种现代波谱技术(IR、UV、EI-MS、FAB-MS、HR-ESI-MS、1H-NMR、13C-NMR、DEPT、1H-1H COSY、HMQC、HMBC等)，结合甲醇解等化学转化方法鉴定了其中45个化合物的结构。其中，从Chaetomium sp分离鉴定了35个化合物，其中2个为新化合物，分别为化合物EN1 （命名为Chaetopyranin）、EN2 （命名为Chaetofuranin）。从Fs中分离鉴定了10个化合物的结构，其中1个为新化合物Fs1。 对大部分分离到的单体化合物进行了细胞毒活性测试，结果显示新化合物EN1对3株细胞系SMMC-7721, HMEC和A-549具有中等细胞毒活性，IC50分别为28.5, 15.4, 39.1 μg/mL。同时一些已知化合物特别是苯甲醛类衍生物对A-549显示了较强的细胞毒活性，这些在以前文献中未见报道。

治疗慢性肾功能衰竭的海洋复方新药初步研究

本论文在FPS研究的基础上，结合中医配伍理论，研究将FPS与几味传统中药－大黄、黄芪、泽泻、益母草的提取物组合成治疗慢性肾功能衰竭的海洋复方新药物。由于FPS研究相对成熟，故对复方药物中FPS外其它组分（以下简称复方）的提取、分离工艺以及制定复方质量的标准和检测方法等药学内容进行研究，为下一步新药的开发打下基础。 1. 对复方的醇提与水提进行了比较，确定了复方最佳提取方法－醇提。采用正交实验设计方法对醇提工艺进行优化，以复方中主要有效成分的含量为指标进行综合评价，得到了复方提取的最佳工艺：8倍量95％乙醇回流提取两次，1.5h/次，并对该提取工艺进行了验证实验，结果表明本工艺提取物中各主要有效成分的含量均较高，是可靠可行的。 2. 采用微波水提法，对复方中的单味药－黄芪的主要有效成分黄芪皂苷的提取进行了研究，通过正交实验设计方法优选出了最佳提取工艺为20倍量水、微波功率800 W、对60目黄芪提取两次、15 min/次。将该工艺与传统乙醇回流提取方法进行了对比，结果表明该工艺快速、经济、有较好的皂苷提取率，是黄芪皂苷提取的很好的方法。 3. 进行缺FPS的褐藻糖含量测定阴性对照实验，结果阴性无干扰，褐藻糖含量测定可以作为控制复方质量的一个指标。分别做缺大黄和缺黄芪阴性对照实验，结果总蒽醌和总皂苷含量测定阴性干扰较大，大黄素含量测定阴性无干扰，确定大黄素含量测定为控制复方质量的另一指标。 4. 进行复方提取物质量控制指标之一－大黄素含量测定的分析方法学研究，找到了一稳定可行的方法－HPLC方法，该方法测定条件为：流动相甲醇与0.1%磷酸比例为85：15，柱温40℃，通过ODS柱分离，用二极管阵列检测器在436 nm下测定含量。该方法测定复方提取物中大黄素含量精密度高、专一性好、干扰小，可用来控制复方的质量。

两种海藻提取物的化学成分和生物活性的研究及其应用

本论文的研究工作由两部分组成，第一部分研究了海带（Laminaria japonica）水提取物中的活性物质，并研究了提取物对蔬菜促生长的影响及其作用机制。第二部分对三列凹顶藻(Laurencia tristicha)乙醇提取物的乙酸乙酯相进行了活性筛选和化学成分研究，并对其中分离得到的单体化合物进行了生物活性筛选。 第一部分主要以中国人工养殖的海带为原料，使用与海藻多糖生产相结合的提取技术并浓缩其中的有效成分。对浓缩提取物进行了蔬菜的农田效果实验，并对作物抗旱性能的增加、作物硝酸盐积累的减少、作物品质的改善、以及作物抵抗病毒病的能力等影响进行了作用机制方面的研究。海藻浓缩提取物进行的农田效果实验表明：作物抗旱型相对含水量RWC值在92%~94%之间；病毒病的防治效果最高可达到91%；作物的品质有明显的改善，最重要的是首次发现海藻提取物有降低蔬菜中硝酸盐的含量（硝酸盐的含量是与有机蔬菜区别的重要指标之一）的作用。该部分研究工作的创新性主要体现在：（1）首次在国内外提出和采用与海藻多糖生产相结合的提取技术。该技术的应用不但减少了提取成本，使工业化生产成为可能,更重要的是使我国的海藻工业生产可能实现高值化和开辟综合利用的新途径。（2）首次发现海藻中的小分子海藻多糖具有和细胞激动素、甜菜碱、植物生长素等活性物质同样的生物活性。 第二部分的研究是在查阅了大量的近20年来国内外有关红藻凹顶藻中化学成分研究的相关文献的基础上，对凹顶藻中的次生代谢产物进行了综述。该论文主要是通过对红藻三列凹顶藻的95%乙醇提取物的乙酸乙酯相进行化学成分分析和生物活性筛选以期能够发现具有药用前景的活性先导化合物。 为了寻找具有生物活性的化合物，我们对采自我国南海硇洲岛海域的红藻三列凹顶藻的95%乙醇提取物的乙酸乙酯相进行了活性筛选。采用MTT法对其在KB细胞株、Bel-7402细胞株、PC-3M细胞株、MCF-7细胞株、Ketr-3细胞株模型上进行了细胞毒活性测试；采用酶模型对其进行了Na+,K+-ATPase的抑制活性测试；采用MTT法对其在犬主动脉血管模型上进行了血管平滑肌细胞增殖抑制活性测试；结果表明，三列凹顶藻的95%乙醇提取物的乙酸乙酯相对Na+,K+-ATPase和犬血管平滑肌细胞增殖具有一定的抑制活性。 利用正相和反相色谱、Sephadex LH-20色谱以及反相HPLC等手段进行分离纯化，从我国南海海域的红藻三列凹顶藻中分离得到33种化学成分，通过波谱学方法（IR、MS、NMR）以及X-ray单晶衍射试验对其化学结构进行了确证，其中化合物L1~L8为新结构化合物，化合物L5为具有新骨架的全新结构化合物，化合物L9~L13为新天然产物，化合物L18和L22系首次从海洋生物中获得，所有化合物均为首次从该属海藻中得到。新化合物L1~L8均为倍半萜类化合物，命名分别为：(1R,3R)-(-)-3-(3-hydroxy-4-methylphenyl)- 1,3-dimethyl–2-methylidene cyclopentanol (L1), (1R,3R)-(-)-3-(4-methylphenyl)-1,3-dimethyl-2-methylidenecyclopentanol (L2)， (1R, 3R)-(-)-3-(2-hydroxy-4-methylphenyl)-1,3-dimethyl–2–methylidenecyclopentanol (L3)，(+)-(1S,2R)–2-(3–hydroxy–4–methylphenyl)-1,2-[3.1.0]bicy-clohexane (L4)，()-(1S,2R) -5-hydroxy–6–methyl-spiro-dihydrobenzofuran-2(3H),2-{1-methyl-[3.1.0]bicyclohexane} (L5), (+)-6-methyl-2-(p-tolyl)hept-4-en-2,6-diol (L6)，(3R,3aS,8bS)-(-)-2,3,3a,8b–tetrahydro–7-bromo – 3 a– hydroxymethyl - 3, 6, 8b - trimethyl-1H- cyclopenta[b] benzofuran (L7 )，(3R, 3aS, 8bS) - (-) - 2,3,3a,8b–tetrahydro–3 a–hydroxymethyl-3,6,8b -trimethyl -1H – cyclopenta [b] benzofuran (L8)。25个已知结构化合物确定为：(+)-(1R,2R)-4-bromo-1,5, 9–trimethyl–12– methylidene–8–oxa-tricyclo[7.2.1.02]dodeca-2,4,6-triene (L9)，(3S,3aR,8bS)-(-)-2,3,3a, 8b– tetra -hydro–7-bromo–3–hydroxy-3,3a,6,8b-tetramethyl-1H-cyclopenta[b]benzofu- ran (L10 )，(3R, 3aR, 8bS) - (-) - 2, 3, 3a, 8b – tetrahydro – 7 - bromo – 3 – hydroxy - 3,3a,6,8b - tetramethyl - 1H - cyclopenta [b] benzofuran (L11 )，(3S,3aR,8bS) - (-) - 2, 3, 3a, 8b – tetrahydro –3–hydroxy -3, 3a, 6, 8b - tetramethyl-1H-cyclopenta[b]benzofuran (L12 )， ( 3aR, 8bS) - (-) - 3a,8b –dihydro–7 - bromo – 3, 3a, 6, 8b - tetramethyl - 1H - cyclopenta[b]benzofuran (L13 )，aplysinol (L14 ) ，aplysin (L15)，laurebiphenyl (L16)，johnstonol (L17)，gossonorol (L18)，7,10-epoxy-ar- bisabol-11-ol (L19)，10-epi-7,10-epoxyarbisabol-11-ol (L20) 3β-hydroxy- 5α, 6α-epoxy- β- ionone (L21 )，3β-hydroxy-5β,6β-epoxy-β-ionone (L22 )，胆甾醇 (L23 )，胆甾-5-烯-3β,7α二醇胆甾-5-烯-3β,7α二醇 (L24)，β-谷甾醇 (L25)，叶绿醇 (L26 )，玉米黄素 (L27 )，对羟基苯甲醛 (L28 )，3-吲哚甲醛 (L29 )，1-O-十六烷酰基-3-O-β-D-吡喃半乳糖基-丙三醇(L30 )，1-O-十八烷酰基-3-O-β-D-吡喃半乳糖基-丙三醇 (L31 )，丙三醇-1-软脂酸单酯 (L32 )，正十六碳酸 (L33 )。 采用MTT法对其中23个单体化合物在Bel-7402细胞株、BGC-823细胞株、A549细胞株、A2780细胞株、HCT-8细胞株和HELL细胞株模型上进行了细胞毒活性测试；采用MTT法对其中13个单体化合物在犬主动脉血管模型上进行了血管平滑肌细胞增殖抑制活性测试；结果表明，部分单体化合物显示出一定的生物活性。

钠离子通道类毒素的细胞毒性和检测方法的研究

赤潮毒素广泛存在于各种赤潮藻和各类海洋生物中，不仅对渔业、养殖业危害甚大，而且还直接威胁着人类的生存健康。其中，离子通道类毒素是一类毒性较高的毒素。除一些赤潮藻可以产生此类毒素之外，海洋中还存在某些生物也能够产生离子通道类毒素。为进一步阐明钠离子通道类毒素对细胞的毒性效应机制，本文选取一株小鼠神经母细胞瘤（Neuro-2a）作为受试对象，研究了四种钠离子通道类毒素STX、GTX1,4、GTX2,3、TTX对Neuro-2a细胞的毒性影响机制，并利用STX和TTX，建立了钠离子通道类毒素的细胞毒性检测方法，且应用此方法检测了贝体内、藻体内的毒素含量，进一步与小鼠法和HPLC法进行了比较。 研究表明：STX、GTX1,4、GTX2,3、TTX四种钠离子通道类毒素在长时间内均会对Neuro-2a细胞的增殖产生不利影响。在短时间（24h）内，以上各毒素均没有抑制Neuro-2a细胞的增殖，但是48h后，以上各毒素对Neuro-2a细胞的增殖均产生了抑制作用，且随着各毒素剂量的增加，细胞增殖受抑制程度也表现出一定程度的增高，二者呈剂量-反应关系。STX、GTX1,4、GTX2,3、TTX对Neuro-2a细胞的48h半数抑制浓度（IC50）分别为：250ng/ml、1000ng/ml、1300ng/ml、700ng/ml。本论文还首次研究了STX、GTX1,4、GTX2,3、TTX四种钠离子通道类毒素对Neuro-2a细胞内酶活性的影响。研究发现，STX、GTX1,4、GTX2,3、TTX四种钠离子通道阻断剂类毒素均能够影响Neuro-2a细胞内Na+-K+-ATP酶和乙酰胆碱酯酶TChE的活性。当各毒素作用24h后，Neuro-2a细胞内Na+-K+-ATP酶和乙酰胆碱酯酶TChE的活力均会受到抑制，并且随着各毒素剂量的增加，两种酶的活性也逐渐降低。可见，钠离子通道阻断剂类毒素能对细胞内酶的功能产生一定的影响，此影响连同阻断细胞膜钠离子通道，造成离子流的失衡作用，进一步对细胞产生毒性效应。在对细胞膜通透性的研究中发现，上述四种钠离子通道阻断剂类毒素各剂量组细胞培养液乳酸脱氢酶LDH的漏出率与对照组相比均无显著差异，它们均未引起Neuro-2a细胞膜内LDH的改变，看来钠离子通道阻断剂类毒素不会通过影响细胞膜的通透性而对细胞引起毒性效应。 本研究还利用STX和TTX两种钠离子通道标准毒素以及乌苯苷、藜芦定两种生物毒素，参照Jellett（1992）方法，建立了STX和TTX两种钠离子通道类毒素的细胞毒性检测的标准曲线，分别为：Y=0.266X+51.184和 Y=1.6068X+47.186。检出限分别为5ng/ml和0.8ng/ml。并且利用已建立的细胞毒性检测方法检测了来自浙江舟山和连云港赣榆市的19个织纹螺样品和5株实验室培养的亚历山大藻，得到的实验结果与小鼠生物测试和HPLC检测的结果存在较好的相关关系。鉴于该方法具有高通量、省时、检出限低等优点，因此更具有在沿海环境检测中推广应用的潜力。

中国沿海典型区域织纹螺毒性及毒素成分研究

织纹螺（Nassarius spp.）味道鲜美，是中国及其它一些亚洲国家沿海地区居民习惯食用的一种水产品。但是，近几十年来，中国沿海频繁发生食用织纹螺中毒事件，严重威胁着人们的身体健康和生命安全。加之人们对织纹螺体内的毒素成分、来源及其毒性变化规律还没有清晰的认识，因此难以有效预防和控制食用织纹螺引起的中毒事件。本文根据文献报道，在中国沿海食用织纹螺中毒事件多发的典型区域，包括江苏省的连云港市和盐城市、浙江省的舟山市和宁波市、福建省的宁德市、厦门市和莆田市设立了监测点，于2006年和2007年间进行了连续采样，应用小鼠生物测试法调查了织纹螺毒性的消长情况，并利用高效液相色谱-质谱联用（Liquid Chromatography-Mass Spectrometry，LC-MS）和高效液相色谱技术（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）对织纹螺体内的毒素成分进行了分析。 实验结果表明，2006年于江苏省盐城市射阳海域采集的织纹螺样品中，阳性样品检出率为56%，毒性在2-5 MU/g组织（湿重）之间变化，在2007年于同地采集的8个样品中，除一个样品毒性为3.14 MU/g组织（湿重）以外，其余样品均表现为阴性；而2007年采集自连云港市赣榆海域的织纹螺样品，在采样期间则呈现出极高的毒性，最高达到846.52 MU/g 组织（湿重），毒性在监测期间呈“M”状波动，在5月和7月下旬出现两个毒性高峰。2006年于浙江省宁波市象山港采集的织纹螺样品中，阳性样品检出率为25%，毒性均在2.5 MU/g组织（湿重）左右；而同年采集自舟山市定海的织纹螺样品中，阳性样品检出率为100%，最高毒性达18.40 MU/g组织（湿重），毒性在监测期间也呈“M”状波动，高峰期出现在6月初和7月底。2006年3-9月采集自福建省宁德霞浦、厦门同安和莆田涵江采集的织纹螺样品中，阳性样品检出率分别为20%、43%和14%，除7月中旬采集自宁德霞浦的一个样品毒性达到16.19 MU/g组织（湿重）之外，其余样品毒性均在2-5 MU/g组织（湿重）间波动。从阳性样品的时间分布规律来看，3月份和6、7月份是阳性样品集中出现的时期。根据以上调查结果可以看出，织纹螺的毒性消长呈现出较明显的地域性和季节性特征，不同地区的织纹螺毒性存在差异，而同一区域织纹螺毒性的消长则表现出明显的季节性集中趋势。除了2007年采集自连云港赣榆的织纹螺样品毒性与其平均个体组织重量有相似的变化趋势以外，其余地区的织纹螺样品毒性和个体大小无明显相关性。 利用LC-MS和HPLC技术对织纹螺样品中的毒素成分进行了分析，确定河豚毒素（tetrodotoxin, TTX）及其同系物（trideoxyTTX，4-epi-TTX，anhydroTTX，oxoTTX）是所采集织纹螺中的主要致毒成分，样品中没有检测到麻痹性贝毒毒素（Paralytic Shellfish Poison, PSP）。自不同地区采集的织纹螺中毒素成分基本一致，但组成存在一定差异。其中，采自江苏省连云港赣榆和浙江省舟山定海的织纹螺样品中，trideoxyTTX是主要的成分，其次是TTX；而从其它采样地点采集的织纹螺中，TTX都是主要的毒素成分，其次才是trideoxyTTX及其它同系物。对采集自江苏省连云港赣榆和浙江舟山定海的织纹螺体内毒素的解剖学分布进行了分析，结果表明肌肉、消化腺和剩余部分中的毒素组成基本一致，其中trideoxyTTX是主要的毒素成分，其次为TTX，但采自浙江舟山的织纹螺剩余部分中的TTX是主要的毒素成分。在监测期间，各组织中的毒素组成没有明显变化，但毒素含量随季节变化表现出了一定的差异。 综上所述，在中国沿海典型区域开展的织纹螺毒性调查结果表明其毒性消长具有一定的地域性和季节性特征。分析结果显示织纹螺体内的毒素成分是河豚毒素及其同系物，采自不同区域的织纹螺体内毒素成分基本一致，但毒素组成稍有差异。对织纹螺中毒素的解剖学分布研究显示，各组织中的毒素含量随季节变化而表现出一定差异，但毒素组成没有明显的季节性变化。这些结果显示中国沿海的织纹螺应具有相似的毒素来源，研究结果将为相关部门有效监测、预防和控制食用织纹螺中毒事件提供有力的科学依据。

四株海洋放线菌遗传转化体系的研究

作者所在的课题组，自1998年以来从胶州湾海泥中陆续分离了800株海洋放线菌，并从4株放线菌中分离出了12个新结构活性化合物。选择产生新颖抗肿瘤抗生素的海洋放线菌M045和M048，产全霉素的海洋放线菌M095和产蒽醌类化合物的海洋放线菌M097为研究材料，建立了海洋放线菌的遗传转化体系，为海洋放线菌的遗传工程操作及天然化合物组合生物合成奠定了基础。 （1）通过接合转移建立了菌株M045的遗传转化体系。用来源于蓝藻Anacystis nidulans UTEX625的别藻蓝蛋白基因验证了转化体系的有效性。通过PCR及基因组步移方法获得长度为1709bp的部分聚酮合成酶（PKS）基因，分析其同放射菌素基因具有同源性，利用基因中断插入失活该基因，但未获得突变株。因此尝试通过反向遗传学方法，克隆该菌株中新骨架抗肿瘤抗生素——中国霉素的生物合成基因簇，本研究已经构建了该菌株Fosmid基因组文库，对基因组文库的筛选工作正在进行中。 （2）利用PEG-介导的质粒pIJ702转化原生质体和接合转移两种方法均成功获得菌株M048的转化子，其中接合转移率高达10-4。菌株M048来源于高盐的海洋环境，维持原生质体所需渗透压与模式菌株—变铅青链霉菌（Streptomyces lividans）有很大差异，本研究对菌株M048原生质体形成和再生的各种因素进行了优化，获得了渗透压稳定剂蔗糖最佳浓度为0.4M。 质粒pIJ8600整合于菌株M048染色体上，对该转化株的抑菌活性、薄层层析（TLC）以及HPLC-MS进行了分析。结果表明，同野生菌株相比，该转化株对7种受试菌的抑菌活性显著增强，TLC显示差异的化合物条带，HPLC-MS显示化合物组分有差异。因此质粒pIJ8600的整合，引起菌株次级代谢产物生物合成途径的改变，使有抑菌活性的化合物大量累积。 从菌株M048染色体上克隆获得了1196bp的部分PKS基因，通过基因中断插入失活该基因，结果显示M048突变株次级代谢产物抑菌活性增强，HPLC分析发现显著差异。初步分析该PKS基因的中断使菌株体内某些生物合成途径受阻，而大量合成抗菌活性强的chandrananimycin C，或者产生了抑菌活性强的其它化合物。 （3）本研究成功建立了菌株M095的接合转移体系。M095/pIJ8600转化株的生物学活性分析并未发现差异，表明该菌株染色体上的整合位点（attB）是中性（neutral）的。通过PCR以及基因组步移的方法克隆获得了该菌株的部分糖基转移酶基因，该基因中断突变株对4株受试菌的抑菌活性增强，HPLC显示有差异，表明该糖基转移酶基因参与了菌株M095活性次级代谢产物的生物合成过程。 （4）对于菌株M097，用接合转移法成功获得了转化子。实现了别藻蓝蛋白基因的重组表达，并纯化了表达产物，体外试验表明其具有清除羟基自由基能力。结果表明来源于蓝藻的外源基因可以在海洋放线菌体内有效表达和正确折叠，初步验证了本研究所建立的海洋放线菌遗传转化体系的稳定性及有效性。对M097/pIJ8600转化株的生物学活性分析，未发现差异，表明该菌株染色体上的整合位点是中性的。 本论文首次将基因工程技术引入四株海洋放线菌，建立了海洋放线菌自身的基因转移系统，为利用基因工程技术改造海洋放线菌的天然化合物生物合成途径提供了方法。对部分PKS基因中断突变株的生物学活性及化学分析，初步揭示了通过遗传转化方法进行化合物组合生物合成的可行性。

海洋环境中有机锡的形态分析及其代谢降解研究

有机锡化合物被广泛用作塑料制品中的稳定剂、船舶油漆的防污剂、工业催化剂、农林业杀虫杀菌剂以及用于木材的防腐保存等，已经引起严重的环境污染。世界上许多国家纷纷制定相应的法规对其使用加以禁止或限制。我国目前还没有明确的限制有机锡使用的法律法规，缺少有机锡污染的第一手资料，更没有长期的控制、监测与研究计划。由于有机锡的种类繁多，理化性质存在差别，所以在提取、分离和测定中均存在较大的困难。从我国这方面己有的工作来看，缺乏各种高选择性的分离方法和高灵敏度的检测方法是制约这项研究广泛开展的原因之一。有机锡的痕量与超痕量分析技术是当今环境和食品安全分析领域的前沿技术。 本论文利用高效液相色谱和电感耦合等离子体质谱联用技术建立了海洋环境中多种有机化合物的同时快速检测方法；发展了多种海洋环境样品中有机锡的前处理技术；研究了有机锡在海洋生物中的分布、代谢及降解过程中化学形态的变化；同时发展了海洋环境中多种痕量元素的快速检测方法。所建立的高效液相色谱和电感耦合等离子体质谱联用技术可同时、快速分析5种有机锡的形态(三甲基锡TMT、二苯基锡DPhT、二丁基锡DBT、三丁基锡TBT和三苯基锡TPhT)，其检出限均低于0.3μg/L。 用所建立方法对南海海洋生物样品中的有机锡污染进行了研究，利用SPSS软件对检测结果进行了探讨，发现在所研究海洋生物样品的97.2%中可检出丁基锡和苯基锡化合物，其浓度分布处于该化合物检出限～1487.8ng/g范围内。其中，贝类样品中总有机锡的平均浓度为416.9ng/g，远远高于鱼类样品中总有机锡的平均浓度（211.9ng/g）。海洋生物中存在高浓度的有机锡说明本海域有机锡污染严重，已经对生态环境造成了严重影响，危害到人类生活。其主要的污染源是防污涂料的应用，目前紧迫的问题是采取必要的措施来控制有机锡的使用。 本工作建立了海水样品和沉积物样品中五种有机锡的简单快速萃取方法。采用加入2%的环庚三烯酚（tropolone）的二氯甲烷CH2Cl2对海水中的有机锡进行萃取，大大提高了有机锡的萃取率，减少了萃取的时间，二苯基锡（DPhT）、二丁基锡（DBT）、三丁基锡（TBT）和三苯基锡（TPhT）的萃取率均在80%以上，仅三甲基锡（TMT）的萃取率较低（在50%左右），究其原因，可能是因为在萃取的过程中三甲基锡（TMT）产生了降解。采用流动相和0.2%环庚三烯酚酮（tropolone）对沉积物国际标准物质PACS-2进行超声萃取及高速离心后，用所建方法进行了分析。结果表明，测定值与标准值吻合。研究表明，所建立的方法可用于实际环境沉积物中有机锡的形态分析。 本文建立了流动注射与电感耦合等离子体质谱联用技术直接同时测定海水中多种痕量元素的方法。该方法采用痕量进样技术，能够有效地减少海水中Na，Mg, Ca和Cl等大量基体元素对待测痕量元素测定的干扰，减少这些元素在电感耦合等离子体采样锥上的盐沉积，可以同时测量海水中的V、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Zn、As、Mo、Cd、Pb，Hg和U等痕量级元素。用所建的方法测定南海海域海水中的重金属元素，发现Cd，Cr，As等有毒有害元素的污染很轻，均符合Ⅰ级海水的限量。 在海洋沉积物样品处理研究中，本工作改进了不需要赶走HF酸就可以对沉积物消解完全的密闭容器消解法，由于减少了赶走HF酸的步骤，使消解的时间由原来的二十个小时降低为十个小时，大大降低了消解的时间。采用该样品消解方法，并用ICP-MS测定了南黄海海域沉积物中锡及其他重金属元素的含量。建立了微波消解-ICP-MS测定海洋生物中锡、砷、镉、汞及铅等有害重金属元素的分析方法，并用于南黄海7个及南海海域29个海产品中的测定。测定结果表明海洋生物中上述有毒有害元素有不同程度的超标问题；不同种类，不同产地的海洋生物中重金属元素的含量有一定的差别，这些研究结果为海产品安全质量控制提供了有价值的科学信息。 在上述各章工作的基础上，本文研究了有机锡在海洋生物中的分布、代谢及降解过程，并初步建立了高效液相-电喷雾-飞行时间质谱（LC-APCI-TOF-MS）测定有机锡的方法，可对未知的有机锡化合物进行结构表征。有机锡在贝类中不同的组织显示，其内脏中有机锡的含量高于肌肉中有机锡含量。常规的煮、炸、蒸及微波的烹饪方式并不能降解海产品中的有机锡化合物。