四株海洋放线菌遗传转化体系的研究

作者所在的课题组，自1998年以来从胶州湾海泥中陆续分离了800株海洋放线菌，并从4株放线菌中分离出了12个新结构活性化合物。选择产生新颖抗肿瘤抗生素的海洋放线菌M045和M048，产全霉素的海洋放线菌M095和产蒽醌类化合物的海洋放线菌M097为研究材料，建立了海洋放线菌的遗传转化体系，为海洋放线菌的遗传工程操作及天然化合物组合生物合成奠定了基础。 （1）通过接合转移建立了菌株M045的遗传转化体系。用来源于蓝藻Anacystis nidulans UTEX625的别藻蓝蛋白基因验证了转化体系的有效性。通过PCR及基因组步移方法获得长度为1709bp的部分聚酮合成酶（PKS）基因，分析其同放射菌素基因具有同源性，利用基因中断插入失活该基因，但未获得突变株。因此尝试通过反向遗传学方法，克隆该菌株中新骨架抗肿瘤抗生素——中国霉素的生物合成基因簇，本研究已经构建了该菌株Fosmid基因组文库，对基因组文库的筛选工作正在进行中。 （2）利用PEG-介导的质粒pIJ702转化原生质体和接合转移两种方法均成功获得菌株M048的转化子，其中接合转移率高达10-4。菌株M048来源于高盐的海洋环境，维持原生质体所需渗透压与模式菌株—变铅青链霉菌（Streptomyces lividans）有很大差异，本研究对菌株M048原生质体形成和再生的各种因素进行了优化，获得了渗透压稳定剂蔗糖最佳浓度为0.4M。 质粒pIJ8600整合于菌株M048染色体上，对该转化株的抑菌活性、薄层层析（TLC）以及HPLC-MS进行了分析。结果表明，同野生菌株相比，该转化株对7种受试菌的抑菌活性显著增强，TLC显示差异的化合物条带，HPLC-MS显示化合物组分有差异。因此质粒pIJ8600的整合，引起菌株次级代谢产物生物合成途径的改变，使有抑菌活性的化合物大量累积。 从菌株M048染色体上克隆获得了1196bp的部分PKS基因，通过基因中断插入失活该基因，结果显示M048突变株次级代谢产物抑菌活性增强，HPLC分析发现显著差异。初步分析该PKS基因的中断使菌株体内某些生物合成途径受阻，而大量合成抗菌活性强的chandrananimycin C，或者产生了抑菌活性强的其它化合物。 （3）本研究成功建立了菌株M095的接合转移体系。M095/pIJ8600转化株的生物学活性分析并未发现差异，表明该菌株染色体上的整合位点（attB）是中性（neutral）的。通过PCR以及基因组步移的方法克隆获得了该菌株的部分糖基转移酶基因，该基因中断突变株对4株受试菌的抑菌活性增强，HPLC显示有差异，表明该糖基转移酶基因参与了菌株M095活性次级代谢产物的生物合成过程。 （4）对于菌株M097，用接合转移法成功获得了转化子。实现了别藻蓝蛋白基因的重组表达，并纯化了表达产物，体外试验表明其具有清除羟基自由基能力。结果表明来源于蓝藻的外源基因可以在海洋放线菌体内有效表达和正确折叠，初步验证了本研究所建立的海洋放线菌遗传转化体系的稳定性及有效性。对M097/pIJ8600转化株的生物学活性分析，未发现差异，表明该菌株染色体上的整合位点是中性的。 本论文首次将基因工程技术引入四株海洋放线菌，建立了海洋放线菌自身的基因转移系统，为利用基因工程技术改造海洋放线菌的天然化合物生物合成途径提供了方法。对部分PKS基因中断突变株的生物学活性及化学分析，初步揭示了通过遗传转化方法进行化合物组合生物合成的可行性。