Estudo dos genes humanos tipo Mob: hsMo4A e hsMob4B

Dissertação apresentada para a obtenção do grau de Doutor em Biologia,especialidade Genética Molecular pela Universidade Nova de Lisboa,Faculdade de Ciências e Tecnologia

Sensibilidade à insulina pós-prandial: mecanismos fisiológicos e de activação e fisiopatologia na obesidade

RESUMO A acção hipoglicemiante da insulina é máxima no estado pós-prandial e depende da substância hepática sensibilizadora da insulina (HISS). Esta dissertação visa o estudo do mecanismo de acção da insulina no estado pós-prandial e em particular da via dependente da HISS, em modelos animais fisiológicos e patológicos (obesidade e diabetes mellitus tipo 2). Avaliaram-se diferentes tipos de refeição quanto ao seu efeito potenciador da acção da insulina, em ratos Sprague-Dawley (modelo fisiológico). A administração intragástrica de glícidos não afecta a acção da insulina, mas a refeição mista (lípidos, glícidos e proteínas), promove a sensibilização para a acção da insulina, através de um processo que parece ser iniciado no intestino e envolve a activação da via da HISS. Nos estudos de obesidade, o primeiro modelo utilizado foi o rato alimentado com dieta hiperlipídica (HFD), no qual se observou uma insulinorresistência pós-prandial devida quase exclusivamente à perda de acção da HISS, que se correlaciona com a adiposidade (corporal e abdominal) e parece ser devida à diminuição da sua síntese. O segundo modelo de obesidade usado foi o rato Zucker obeso (OZR), modelo genético que apresenta uma diminuição idêntica de ambas as componentes de acção da insulina (dependente e independente da HISS). A alteração na via da HISS parece localizar-se a jusante da sua síntese, sugerindo que um ou vários pontos comuns entre as vias de sinalização intracelular da HISS e da insulina per se estão alterados, resultando num diminuto aporte de glucose. No OZR, a acção da HISS não se altera com a idade, apresentando-se baixa também às 52 semanas de idade. Em ratos não obesos (LZR), a acção da HISS diminui entre as 9 e 52 semanas, sendo acompanhada por um decréscimo menos acentuado, embora significativo, da acção da insulina per se. A diminuição da acção da HISS com a idade parece ser a principal causa de insulinorresistência pós-prandial em LZR velhos, não se agravando no OZR. No modelo de diabetes tipo 2 estudado, o rato Zucker diabético (ZDF), também ambas as componentes de acção da insulina estavam diminuídas. No entanto, a alimentação com ração Purina, ligeiramente mais energética e lipídica do que a ração standard, agrava a disfunção da via da HISS nestes animais, sugerindo que a sensibilidade à insulina em ratos ZDF é muito susceptível a factores nutricionais. A via da HISS é essencial para potenciar a acção da insulina do estado de jejum para o pós-prandial e a sua disfunção é em grande medida responsável pela insulinorresistência observada nos modelos animais de obesidade e diabetes estudados. xix SUMMARY Hypoglycemic insulin action is maximal in the postprandial state and depends on the hepatic insulin sensitizing substance (HISS). The present thesis focus on the postprandial insulin action and, in particular, on the HISS-dependent pathway, both in physiological and pathological (obesity and type 2 diabetes mellitus) animal models. Different meals were tested in Sprague-Dawley rats (physiological model) for their capacity to potentiate insulin action. It was observed that intragastric administration of either glucose or sucrose does not affect insulin sensitivity, unlike the mixed meal, composed of lipids carbohydrates and proteins, which significantly potentiated insulin action through a process that seems to be initiated at the intestine and involves activation of the HISS pathway. For the obesity studies, the first of the two obesity models used was the high fat-fed rat (HFD), in which the postprandial insulin resistance was almost exclusively caused by the decrease of HISS action, probably due to the impairment of HISS synthesis. This impairment correlates with both corporal and abdominal adiposity. The second obesity model used was the obese Zucker rat (OZR), a genetic model, which presented a similar impairment of both components of insulin action (HISSdependent and –independent). The modification in HISS pathway in OZR seems to be located downstream from HISS synthesis, that is, at its site of action – the skeletal muscle -, suggesting that one or several points common to both HISS and insulin per se signaling cascades are defective, resulting in a decreased glucose uptake. In OZR, HISS action does not decrease with age and is also low at 52 weeks of age. In non-obese rats (LZR), HISS action decreases from 9 to 52 weeks and it is accompanied by a lower, although significant, impairment of insulin action per se. HISS action impairment with aging seems to be the major cause of insulin resistance in old LZR, whereas insulin resistance is not aggravated in aging OZR. In the type 2 diabetes model, the diabetic Zucker rat (ZDF), both components of insulin action were also equally impaired. However, feeding the animals with Purina rat chow, which is slightly more caloric and more lipidic, induces additional HISS deterioration when compared with the standard lab diet, suggesting that insulin sensitivity in ZDF is very susceptible to nutritional factors. In conclusion, HISS pathway is essential to potentiate insulin action from the fasted to the fed state and its dysfunction is highly responsible for the insulin resistance observed in the obesity and diabetes animal models studied.

Comparação de métodos para identificação de bactérias filamentosas responsáveis pelo fenómeno de bulking numa ETAR

Dissertação apresentada na Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa para obtenção do Grau de Mestre em Engenharia do Ambiente – Perfil Engenharia Sanitária

Achados neurológicos e laboratoriais em população de área endêmica para teníase-cisticercose, Lagamar, MG, Brasil (1992-1993)

Realizou-se um inquérito clínico-epidemiológico em área endêmica para teníase-cisticercose. Foram examinados 1080 (32,2%) indivíduos da população total, encontrando-se 198 (18,3%) indivíduos referindo antecedente de teníase, e 103 (9,5%) apresentaram história anterior ou atual de convulsões. Destes últimos, 39 (37,8%) referiram início das crises na vida adulta, e 62 (60%) foram avaliados laboratorialmente. Em 21 (33,8%) casos, o resultado da tomografia mostrou calcificações intracranianas compatíveis com neurocisticercose, em número e localização variáveis, mas sem evidência de atividade da doença. Traçados eletroencefalográficos anormais foram lidos em 21 (33,8%) pacientes e alterações no exame do líquido cefalorraquiano (LCR) detectadas em 27 (43,5%), em 3 (4,8%) foi verificada presença de eosinófilos. Somente LCR de 26 (41,9%) pacientes foram submetidos a pesquisa de anticorpos para cisticerco, obtendo-se positividade em 6 (23%) deles, por ensaio imunoenzimático (ELISA) ou reação de imunofluorescência indireta. Outras alterações do LCR foram devidas a aumento variável das proteínas. Considerando-se os fatores epidemiológicos de risco para teníase-cisticercose na região estudada e sua correlação com as alterações laboratoriais mencionadas acima com as crises convulsivas, encontra-se uma provável prevalência de 1,9% para a neurocisticercose.

Terapêuticas antigénio-especificas no tratamento das doenças desmielinizantes: estudos sobre a vacinação com ADN e a descoberta de um novo alvo antigénico

RESUMO A Esclerose Múltipla (EM) é uma doença desmielinizante crónica do Sistema Nervoso Central (SNC), provocada, em grande parte, por um ataque imuno-mediado contra diversos elementos da bainha de mielina. Dentro dos alvos antigénicos desta resposta autoimune, vários componentes proteicos e lipídicos da mielina têm vindo a ser identificados ao longo dos anos, entre os quais se destacam a proteína básica de mielina(MBP), glicoproteína ligodendrocitária da mielina (MOG), proteína proteolipídica (PLP) e glicoproteína associada à mielina (MAG). Com o desenvolvimento do modelo animal de Encefalomielite Autoimune Experimental (EAE), diversas terapias antigénio-específicas foram desenhadas, baseadas na modificação benéfica da resposta autoimune contra a mielina, tais como a administração de mielina ou seus componentes, os copolímeros terapêuticos, os ligandos peptídeos alterados e, recentemente, a vacinação com ácido desoxirribonucleico (ADN) codificador de proteínas de mielina, integrado em plasmídeos e purificado para administração parentérica. Neste trabalho, apresentamos os resultados de um extenso conjunto de experiências, subordinadas a dois temas fundamentais: 1) avaliação do potencial terapêutico, e dos mecanismos de acção, da vacinação tolerizadora com ADN codificador de proteínas de mielina (MBP, MOG, PLP, MAG) na EAE, e da associação desta vacinação com a administração de ADN de citocinas Th2, ou de oligonucleótidos imunomoduladores; 2) identificação e caracterização da resposta imune contra um novo componente da mielina com potencial antigénico, a proteína inibidora do recrescimento axonal, Nogo-A. No que respeita à vacinação com ADN, os nossos resultados comprovam a eficácia desta terapêutica antigénio-específica na prevenção e tratamento da EAE. Os seus mecanismos de acção incluem, entre outros, a supressão anérgica da proliferação antigénioespecífica dos linfócitos T anti-mielina (no modo de prevenção da doença), o enviesamento Th2 da resposta imune (quando co-administrada com a vacina de ADN codificadora da citocina IL-4, funcionando como terapia génica local), e a redução da diversificação de epítopos da resposta humoral anti-mielina, avaliada através de myelin spotted arrays. A associação das vacinas de ADN com oligonucleótidos imunomoduladores GpG, desenvolvidos para contrariar as sequências CpG imunoestimuladoras presentes no vector de vacinação, levou à melhoria da sua eficácia terapêutica, devida, provavelmente, ao efeito estimulador preferencial dos oligonucleótidos GpG sobre linfócitos Th2 e sobre células reguladoras NK-T. Com base nestes resultados a vacinação com ADN foi desenvolvida para o tratamento da EM em humanos, com ensaios clínicos a decorrerem neste momento. Em relação à proteína Nogo-A, estudos de estrutura primária e de previsão de antigenicidade identificaram a região Nogo-66 como alvo antigénico potencial para a EAE. Nas estirpes de ratinho SJL/J e C57BL/6, fomos capazes de induzir sinais clínicos e histológicos de EAE após imunização com os epítopos encefalitogénicos Nogo1-22, Nogo23- 44 e Nogo45-66, utilizando protocolos de quebra de tolerância imune. Ao mesmo tempo, identificámos e caracterizámos uma resposta linfocitária T específica contra os antigénios contidos na região Nogo-66, e uma resposta linfocitária B com diversificação intra e intermolecular a vários determinantes presentes noutras proteínas da mielina. A transferência adoptiva de linhas celulares Th2 anti-Nogo45-66, levou à melhoria clínica e histológica da EAE em animais recipientes induzidos com outros antigénios de mielina, após migração destas células para o SNC. Estes dados comprovam a importância da Nogo-66 como antigénio na EAE, e a eficácia de terapias antigénio-específicas nela baseadas. No seu conjunto, os nossos resultados confirmam o potencial terapêutico das vacinas de ADN codificadoras de proteínas de mielina, bem como a importância dos encefalitogénios contidos na proteína Nogo-A para a fisiopatologia da EAE e da EM, com eventual relevância para o desenvolvimento de novas terapias antigénio-específicas. O aperfeiçoamento futuro destas terapias poderá levar, eventualmente, a uma capacidade de manipulação da resposta imune que permita o tratamento eficaz das doenças inflamatórias desmielinizantes, como a Esclerose Múltipla. ABSTRACT Multiple Sclerosis (MS) is a chronic demyelinating disease of the Central Nervous System (CNS), caused, mainly, by an immune-mediated attack against several elements of the myelin sheath. Among the antigenic targets for this autoimmune response, several proteic and lipidic myelin components have been identified throughout the years, of which myelin basic protein (MBP), myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG), proteolipidic protein (PLP), and myelin associated glycoprotein (MAG) are the best characterized. With the development of the animal model for MS, Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE), several antigen-specific therapies have been designed, based on beneficial modifications of the autoimmune response against myelin. These have included myelin and myelin component administration, therapeutic copolymers, altered peptide ligands and, more recently, vaccination with myelin-protein encoding deoxyribonucleic acid (DNA), integrated into plasmids and purified for parenteral administration. In this work we present the results of an extensive series of experiments, subordinate to two fundamental areas: 1) evaluating the therapeutic potential, and mechanisms of action, of tolerizing myelin protein (MBP, MOG, PLP, MAG) DNA vaccination in EAE, alone and in association with Th2 cytokine DNA administration, or immunomodulatory oligonucleotides; 2) identifying and characterizing the immuneresponse against a new myelin component with antigenic potential, the axonal regrowth inhibitor Nogo-A. Regarding DNA vaccination, our results prove the efficacy of this antigen-specific therapy for the prevention and treatment of EAE. Its mechanisms of action include, among others, anergic suppression of antigen-specific T-cell proliferation against myelin (in prevention mode), Th2 biasing of the immune response (when co-administered with the IL- 4 codifying DNA vaccine, acting as local gene therapy), and reduction of epitope spreading of the anti-myelin antibody response, assessed by myelin spotted arrays. The combination of myelin DNA vaccination with the administration of GpG immunomodulatory oligonucleotides, designed to counteract immunostimulatory CpG motifs present in the vaccination vector, led to an improvement in therapeutic efficacy, probably due to the preferential stimulatory effect of GpG oligonucleotides on Th2 lymphocytes and on regulatory NK-T cells. Based on these results, tolerizing DNA vaccination is being developed for human use, with ongoing clinical trials. As concerns the Nogo-A protein, based on studies of primary structure and prediction of antigenicity, we identified the Nogo-66 region (responsible for the most of the inhibitory capacity of this protein) as a potential antigenic target for EAE. In the SJL/Jand C57BL/6 mouse strains, we were able to induce clinical and histological signs of EAE,after immunization with the encefalitogenic epitopes Nogo1-22, Nogo23-44 and Nogo45-66,using a tolerance breakdown protocol. Concomitantly, we identified and characterized a specific T cell response against these antigens, together with a B cell response which showed extensive intra and intermolecular epitope spread to several determinants present in other myelin proteins. Adoptive transfer of nti-Nogo45-66 Th2 cell lines resulted in clinical and histological improvement of EAE in recipient animals induced with other myelin antigens, after intraparenchymal CNS migration of anti-Nogo cells. These data confirm the relevance of Nogo-66 as an antigen in EAE, as well as the efficacy of antigenspecific therapies based on the response against this protein.In conclusion, our results substantiate the therapeutic potential of myelin-encoding DNA vaccination, as well as the importance of encefalitogenic epitopes present in the Nogo-A protein for the pathophysiology of EAE and MS, with potential relevance for the creation of new antigen specific-therapies. The future development of these therapies may eventually lead to a degree of manipulation of the immune response that allows the effective treatment of autoimmune, inflammatory, demyelinating diseases, such as Multiple Sclerosis.

Desenvolvimento de um novo sistema portátil de detecção de sequências específicas de ADN/ARN a partir de nanossondas de ouro com integração de sensores ópticos baseados na tecnologia do silício nanocristalino

Dissertação apresentada para obtenção do Grau de Doutor em Nanotecnologias e Nanociências pela Universidade Nova de Lisboa, Faculdade de Ciências e Tecnologia.

Desenvolvimento de Métodos de Extração de Resíduos de Antimicrobianos e Quantificação em Amostras Alimentares

O leite é um alimento complexo, pela sua composição rico em água, proteínas, lípidos, vitaminas e minerais. Devido ao seu alto valor nutricional é fundamental para a amamentação de crianças e animais em crescimento, pois fornece componentes fundamentais para o desenvolvimento e manutenção da saúde. Os antimicrobianos são amplamente utilizados como uma medida terapêutica no tratamento de infeções bacterianas, profilaxia e como promotores de crescimento (aditivos). A presença de resíduos de antimicrobianos no leite pode representar riscos para a saúde humana, como reações alérgicas em indivíduos hipersensíveis e resistências. Os objetivos deste estudo são o desenvolvimento de novos métodos de limpeza e de pré-concentração para amostras de leite, por meio de extração em fase sólida (SPE), com a finalidade de realizar uma melhor identificação e quantificação de antimicrobiana por Cromatografia Líquida de Alta Performance (HPLC). Todos os métodos desenvolvidos são de fácil execução, com taxas de recuperação dos agentes antimicrobianos viáveis, com uma percentagem de recuperação a partir de 85%. O método cromatográfico utilizado para a deteção e quantificação (HPLC-DAD) têm os limites de deteção (LD) entre 2.43ng / mL e 1.62ng / mL e os limites de quantificação (LQ) entre 7,36 ng / mL e 4.92 ng / mL, o que significa este método vai de encontro às diretrizes estipuladas pela União Europeia para os agentes antimicrobianos estudados. A combinação dos métodos propostos de limpeza e pré-concentração por SPE e multirresíduo por HPLC-DAD permite, por conseguinte, a deteção e quantificação de resíduos de antibióticos no leite, tornando esta uma alternativa importante e útil no processo de controlo de qualidade para a indústria de alimentos e outras área.

Repercussões crónicas nas vias aéreas da hiperóxia neonatal : modelo experimental

RESUMO: O objectivo deste trabalho foi avaliar se a exposição crónica neonatal à hiperóxia mo-derada induz alterações funcionais e estruturais persistentes nas vias aéreas. Desenvolveu-se um modelo animal, no rato, a partir do qual se retiraram implicações para a compreensão das repercussões crónicas da hiperóxia neonatal sobre as vias aéreas de displasia broncopulmonar (DBP), em duas fases distintas: imediatamente após a exposi-ção neonatal a 50%O2 (grupo 50%O2) e após três semanas de recuperação em ar ambiente (grupo 50%O2+Ar).Compararam-se os resultados da resposta do músculo liso de traqueia (MLT) à esti-mulação in vitro com metacolina e salbutamol e avaliaram-se as alterações quantitativas da área de MLT, bem como as alterações qualitativas da estrutura da traqueia. Demonstrou-se que a exposição a 50% de oxigénio não tinha repercussões imediatas sobre a resposta in vitro do MLT à estimulação colinérgica, mas que induzia um aumento do relaxamento em resposta ao salbutamol. A contractilidade do MLT em resposta à estimula-ção com metacolina no grupo 50%O2+Ar foi significativamente superior à do grupo de con-trolo da mesma idade e também superior à observada no grupo 50%O2, enquanto que a resposta ao salbutamol se voltou a aproximar dos valores de controlo após a recuperação em normóxia. Não se observaram diferenças estatisticamente significativas na área de MLT entre os grupos experimental e de controlo, o que se deve provavelmente ao número reduzido de amostras avaliadas e à variabilidade deste parâmetro no grupo de controlo; contudo, verifi-cou-se um aumento médio de 15% imediatamente após a exposição à hiperóxia que persis-tiu após o período de recuperação.As alterações qualitativas sobre a arquitectura da traqueia, avaliadas por microscopia óptica, revelaram no grupo 50%O2 aumentos da espessura da matriz extracelular e da den-sidade de mastócitos desgranulados na submucosa e adventícia vizinhas do MLT, sem outras alterações relativamente ao grupo de controlo com 15 dias. As alterações da matriz extrace-lular foram reversíveis após a recuperação em ar ambiente. A densidade de mastócitos per-maneceu superior à do grupo de controlo de 36 dias de idade, apresentando-se em maior contiguidade com o MLT relativamente ao grupo 50%O2. Em síntese, demonstrou-se que a hiperóxia neonatal crónica em níveis moderados in-duz alterações da resposta contráctil do MLT e da estrutura da traqueia que podem ter ex-pressão funcional após a exposição ter cessado. Assim, o contributo original do presente trabalho foi o desenvolvimento de um modelo animal que permite avaliar os mecanismos pelos quais a hiperóxia é capaz de induzir, isoladamente, alterações crónicas da contracti-lidade, do relaxamento do ML e da estrutura das vias aéreas que podem ser responsáveis pela HRB persistente em doentes sujeitos a oxigenioterapia neonatal.-------------ABSTRACT: The aim of this work was to evaluate whether chronic neonatal exposure to hyperoxia in-duces persistent structural and functional airway changes. An animal model was developed, using neonatal rats, in order to understand the chronic effects of neonatal hyperoxia on the airways, in bronchopulmonary dysplasia, in two distinct phases: immediately after neonatal exposure to 50%O2 (50%O2 group) and after three weeks of recovery at ambient air (50%O2+Ar group).The results from the tracheal smooth muscle (TSM) response to in vitro stimulation with metacholine and salbutamol were compared and quantitative changes in TSM area, as well as qualitative changes in tracheal structure were evaluated. It was demonstrated that while exposure to 50% oxygen had no immediate effects on in vitro TSM response to cholinergic stimulation, it induced an increase in relaxation as a result of salbutamol administration. TSM contractility as a result of methacholine administration in the 50%O2 + Ar group was significantly higher than that of the same-age control group, and also higher than the one observed in the 50%O2 group, whereas the response to salbutamol admini-stration was once again closer to the control values after recovery in normoxia. There were no statistically significant differences in the TSM area between the experi-mental and control groups, which is most likely due to the reduced number of samples evalu-ated and to the variability of this parameter in the control group. However, there was an aver-age increase of 15% immediately after exposure to hyperoxia, which persisted after the recov-ery period. Qualitative changes in tracheal architecture, evaluated by optic microscopy, revealed that the 50%O2 group suffered an increase in the thickness of the extracellular matrix and degranu-lated mast cell density in the submucosa and adventitia adjacent to the TSM, without further changes when compared with the control group at 15 days of age. The changes in extracellular matrix were reversible after recovery in ambient air. Mast cell density remained higher than that of the control group at 36 days of age, and more contiguous to TSM than the 50%O2 group. In conclusion, it has been demonstrated that moderate levels of chronic neonatal hyperoxia in-duce changes in TSM contractile response and tracheal structure, which may be functionally ex-pressed after discontinuation of exposure. Therefore, the original contribution of the present work was the development of an animal model which allows the evaluation of the mechanisms through which hyperoxia alone can induce chronic changes in contractility and relaxation of SM and also in airway structure that can be responsible for the persistent airway hyperrespon-siveness found in patients who were submited to neonatal oxygen therapy.

Functional significance of adenosine in carotid body chemosensory activity in control and chronically hypoxic animals

ABSTRACT: Carotid bodies (CB) are peripheral chemoreceptor organs sensing changes in arterial blood O2, CO2 and pH levels. Hypoxia and acidosis or hypercapnia activates CB chemoreceptor cells, which respond by releasing neurotransmitters in order to increase the action potential frequency in their sensory nerve, the carotid sinus nerve (CSN). CSN activity is integrated in the brainstem to induce a fan of cardiorespiratory reflex responses, aimed at normalising the altered blood gases. Exogenously applied adenosine (Ado) increases CSN chemosensory activity inducing hyperventilation through activation of A2 receptors. The importance of the effects of adenosine in chemoreception was reinforced by data obtained in humans, in which the intravenous infusion of Ado causes hyperventilation and dyspnoea, an effect that has been attributed to the activation of CB because Ado does not cross blood-brain barrier and because the ventilatory effects are higher the closer to the CB it is injected. The present work was performed in order to establish the functional significance of adenosine in chemoreception at the carotid body in control and chronically hypoxic rats. To achieve this objective we investigated: 1) The release of adenosine from a rat carotid body in vitro preparation in response to moderate hypoxia and the specificity of this release. We also investigated the metabolic pathways of adenosine production and release in the organ in normoxia and hypoxia; 2) The modulation of adenosine/ATP release from rat carotid body chemoreceptor cells by nicotinic ACh receptors; 3) The effects of caffeine on peripheral control of breathing and the identity of the adenosine receptors involved in adenosine and caffeine effects on carotid body chemoreceptors; 4) The interactions between dopamine D2 receptors and adenosine A2B receptors that modulate the release of catecholamines (CA) from the rat carotid body; 5) The effect of chronic caffeine intake i.e. the continuous blockage of adenosine receptors thereby simulating a caffeine dependence, on the carotid body function in control and chronically hypoxic rats. The methodologies used in this work included: molecular biology techniques (e.g. immunocytochemistry and western-blot), biochemical techniques (e.g. neurotransmitter quantification by HPLC, bioluminescence and radioisotopic methods), electrophysiological techniques (e.g. action potential recordings) and ventilatory recordings using whole-body plethysmography. It was observed that: 1) CB chemoreceptor sensitivity to hypoxia could be related to its low threshold for the release of adenosine because moderate acute hypoxia (10% O2) increased adenosine concentrations released from the CB by 44% but was not a strong enough stimulus to evoke adenosine release from superior cervical ganglia and arterial tissue; 2) Acetylcholine (ACh) modulates the release of adenosine/5’-adenosine triphosphate (ATP) from CB in moderate hypoxia through the activation of nicotinic receptors with α4 and ß2 receptor subunits, suggesting that the excitatory role of ACh in chemosensory activity includes indirect activation of purinergic receptors by adenosine and ATP, which strongly supports the hypothesis that ATP/adenosine are important mediators in chemotransduction; 3) adenosine increases the release of CA from rat CB chemoreceptor cells via A2B receptors; 4) the inhibitory effects of caffeine on CB chemoreceptors are mediated by antagonism of postsynaptic A2A and presynaptic A2B adenosine receptors indicating that chemosensory activity elicited by hypoxia is controlled by adenosine; 5) The release of CA from rat CB chemoreceptor cells is modulated by adenosine through an antagonistic interaction between A2B and D2 receptors, for the first time herein described; 6) chronic caffeine treatment did not significantly alter the basal function of CB in normoxic rats assessed as the dynamics of their neurotransmitters, dopamine, ATP and adenosine, and the CSN chemosensory activity. In contrast, the responses to hypoxia in these animals were facilitated by chronic caffeine intake because it increased the ventilatory response, slightly increased CSN chemosensory activity and increased dopamine (DA) and ATP release; 7) In comparison with normoxic rats, chronically hypoxic rats exhibited an increase in several parameters: ventilatory hypoxic response; basal and hypoxic CSN activity; tyrosine hydroxylase expression, CA content, synthesis and release; basal and hypoxic adenosine release; and in contrast a normal basal release and diminished hypoxia-induced ATP release; 8) Finally, in contrast to chronically hypoxic rats, chronic caffeine treatment did not alter the basal CSN chemosensory activity. Nevertheless, the responses to mild and intense hypoxia, and hypercapnia, were diminished. This inhibitory effect of chronic caffeine in CB output is compensated by central mechanisms, as the minute ventilation parameter in basal conditions and in response to acute hypoxic challenges remained unaltered in rats exposed to chronic hypoxia. We can conclude that adenosine both in acute and chronically hypoxic conditions have an excitatory role in the CB chemosensory activity, acting directly on adenosine A2A receptors present postsynaptically in CSN, and acting presynaptically via A2B receptors controlling the release of dopamine in chemoreceptor cells. We suggest that A2B -D2 adenosine / dopamine interactions at the CB could explain the increase in CA metabolism caused by chronic ingestion of caffeine during chronic hypoxia. It was also concluded that adenosine facilitates CB sensitisation to chronic hypoxia although this effect is further compensated at the central nervous system.-------- RESUMO: Os corpos carotídeos (CB) são pequenos orgãos emparelhados localizados na bifurcação da artéria carótida comum. Estes órgãos são sensíveis a variações na PaO2, PaCO2, pH e temperatura sendo responsáveis pela hiperventilação que ocorre em resposta à hipóxia, contribuindo também para a hiperventilação que acompanha a acidose metabólica e respiratória. As células quimiorreceptoras (tipo I ou glómicas) do corpo carotídeo respondem às variações de gases arteriais libertando neurotransmissores que activam as terminações sensitivas do nervo do seio carotídeo (CSN) conduzindo a informação ao centro respiratório central. Está ainda por esclarecer qual o neurotransmissor (ou os neurotransmissores) responsável pela sinalização hipóxica no corpo carotídeo. A adenosina é um neurotransmissor excitatório no CB que aumenta a actividade eléctrica do CSN induzindo a hiperventilação através da activação de receptores A2. A importância destes efeitos da adenosina na quimiorrecepção, descritos em ratos e gatos, foi reforçada por resultados obtidos em voluntários saudáveis onde a infusão intravenosa de adenosina em induz hiperventilação e dispneia, efeito atribuído a uma activação do CB uma vez que a adenosina não atravessa a barreira hemato-encefálica e o efeito é quanto maior quanto mais perto do CB for a administração de adenosina. O presente trabalho foi realizado com o objectivo de esclarecer qual o significado funcional da adenosina na quimiorrecepção no CB em animais controlo e em animais submetidos a hipoxia crónica mantida. Para alcançar este objectivo investigou-se: 1) o efeito da hipóxia moderada sobre a libertação de adenosina numa preparação in vitro de CB e a especificidade desta mesma libertação comparativamente com outros tecidos não quimiossensitivos, assim como as vias metabólicas de produção e libertação de adenosina no CB em normoxia e hipóxia; 2) a modulação da libertação de adenosina/ATP das células quimiorreceptoras do CB por receptores nicotínicos de ACh; 3) os efeitos da cafeína no controlo periférico da ventilação e a identidade dos receptores de adenosina envolvidos nos efeitos da adenosina e da cafeína nos quimiorreceptores do CB; 4) as interacções entre os receptores D2 de dopamina e os receptores A2B de adenosina que modulam a libertação de catecolaminas (CA) no CB de rato e; 5) o efeito da ingestão crónica de cafeína, isto é, o contínuo bloqueio e dos receptores de adenosina, simulando assim o consumo crónico da cafeína, tal como ocorre na população humana mundial e principalmente no ocidente, na função do corpo carotídeo em ratos controlo e em ratos submetidos a hipoxia crónica. Os métodos utilizados neste trabalho incluíram: técnicas de biologia molecular como imunocitoquímica e western-blot; técnicas bioquímicas, tais como a quantificação de neurotransmissores por HPLC, bioluminescência e métodos radioisotópicos; técnicas electrofisiológicas como o registro de potenciais eléctricos do nervo do seio carotídeo in vitro; e registros ventilatórios in vivo em animais não anestesiados e em livre movimento (pletismografia). Observou-se que: 1) a especificidade dos quimiorreceptores do CB como sensores de O2 está correlacionada com o baixo limiar de libertação de adenosina em resposta à hipóxia dado que a libertação de adenosina do CB aumenta 44% em resposta a uma hipóxia moderada (10% O2), que no entanto não é um estímulo suficientemente intenso para evocar a libertação de adenosina do gânglio cervical superior ou do tecido arterial. Observou-se também que aproximadamente 40% da adenosina libertada pelo CB provém do catabolismo extracelular do ATP quer em normóxia quer em hipóxia moderada, sendo que PO2 reduzidas induzem a libertação de adenosina via activação do sistema de transporte equilibrativo ENT1. 2) a ACh modula a libertação de adenosina /ATP do CB em resposta à hipoxia moderada sugerindo que o papel excitatório da ACh na actividade quimiossensora inclui a activação indirecta de receptores purinérgicos pela adenosina e ATP, indicando que a adenosina e o ATP poderiam actuar como mediadores importantes no processo de quimiotransducção uma vez que: a) a activação dos receptores nicotínicos de ACh no CB em normóxia estimula a libertação de adenosina (max 36%) provindo aparentemente da degradação extracelular do ATP. b) a caracterização farmacológica dos receptores nicotínicos de ACh envolvidos na estimulação da libertação de adenosina do CB revelou que os receptores nicotínicos de ACh envolvidos são constituídos por subunidades α4ß2. 3) a adenosina modula a libertação de catecolaminas das células quimiorreceptoras do CB através de receptores de adenosina A2B dado que: a)a cafeína, um antagonista não selectivo dos receptores de adenosina, inibiu a libertação de CA quer em normóxia quer em resposta a estímulos de baixa intensidade sendo ineficaz na libertação induzida por estímulos de intensidade superior; b) o DPCPX e do MRS1754 mimetizaram os efeitos da cafeína no CB sendo o SCH58621 incapaz de induzir a libertação de CA indicando que os efeitos da cafeína seriam mediados por receptores A2B de adenosina cuja presença nas células quimiorreceptoras do CB demonstramos por imunocitoquímica. 4) a aplicação aguda de cafeína inibiu em 52% a actividade quimiossensora do CSN induzida pela hipóxia sendo este efeito mediado respectivamente por receptores de adenosina A2A pós-sinápticos e A2B pré-sinápticos indicando que a actividade quimiossensora induzida pela hipóxia é controlada pela adenosina. 5) existe uma interacção entre os receptores A2B e D2 que controla a libertação de CA do corpo carotídeo de rato uma vez que: a) os antagonistas dos receptores D2, domperidona e haloperidol, aumentaram a libertação basal e evocada de CA das células quimiorreceptoras confirmando a presença de autorreceptores D2 no CB de rato que controlam a libertação de CA através de um mecanismo de feed-back negativo. b) o sulpiride, um antagonista dos receptores D2, aumentou a libertação de CA das células quimiorreceptoras revertendo o efeito inibitório da cafeína sobre esta mesma libertação; c) a propilnorapomorfina, um agonista D2 inibiu a libertação basal e evocada de CA sendo este efeito revertido pela NECA, um agonista dos receptores A2B. O facto de a NECA potenciar o efeito do haloperidol na libertação de CA sugere que a interacção entre os receptores D2 e A2B poderia também ocorrer ao nível de segundos mensageiros, como o cAMP. 6) a ingestão crónica de cafeína em ratos controlo (normóxicos) não alterou significativamente a função basal do CB medida como a dinâmica dos seus neurotransmissores, dopamina, ATP e adenosina e como actividade quimiossensora do CSN. Contrariamente aos efeitos basais, a ingestão crónica de cafeína facilitou a resposta à hipóxia, dado que aumentou o efeito no volume minuto respiratórioapresentando-se também uma clara tendência para aumentar a actividade quimiossensora do CSN e aumentar a libertação de ATP e dopamina.7) após um período de 15 dias de hipóxia crónica era evidente o fenómeno de aclimatização dado que as respostas ventilatórias à hipóxia se encontram aumentadas, assim como a actividade quimiossensora do CSN basal e induzida pela hipóxia. As alterações observadas no metabolismo da dopamina, assim como na libertação basal de dopamina e de adenosina poderiam contribuir para a aclimatização durante a hipoxia crónica. A libertação aumentada de adenosina em resposta à hipóxia aguda em ratos hipóxicos crónicos sugere um papel da adenosina na manutenção/aumento das respostas ventilatórias à hipóxia aguda durante a hipóxia crónica. Observou-se também que a libertação de ATP induzida pela hipóxia aguda se encontra diminuída em hipóxia crónica, contudo a ingestão crónica de cafeína reverteu este efeito para valores similares aos valores controlo, sugerindo que a adenosina possa modular a libertação de ATP em hipóxia crónica. 8) a ingestão crónica de cafeína em ratos hipóxicos crónicos induziu o aumento do metabolismo de CA no CB, medido como expressão de tirosina hidroxilase, conteúdo, síntese e libertação de CA. 9) a ingestão crónica de cafeína não provocou quaisquer alterações na actividade quimiossensora do CSN em ratos hipóxicos crónicos no entanto, as respostas do CSN à hipóxia aguda intensa e moderada e à hipercapnia encontram-se diminuídas. Este efeito inibitório que provém da ingestão crónica de cafeína parece ser compensado ao nível dos quimiorreceptores centrais dado que os parâmetros ventilatórios em condições basais e em resposta à hipoxia aguda não se encontram modificados em ratos expostos durante 15 dias a uma atmosfera hipóxica. Resumindo podemos assim concluir que a adenosina quer em situações de hipoxia aguda quer em condições de hipoxia crónica tem um papel excitatório na actividade quimiossensora do CB actuando directamente nos receptores A2A presentes pós-sinapticamente no CSN, assim como facilitando a libertação de dopamina pré-sinapticamente via receptores A2B presentes nas células quimiorreceptoras. A interacção negativa entre os receptores A2B e D2 observadas nas células quimiorreceptoras do CB poderia explicar o aumento do metabolismo de CA observado após a ingestão crónica de cafeína em animais hipóxicos. Conclui-se ainda que durante a aclimatização à hipóxia a acção inibitória da cafeína, em termos de resposta ventilatória, mediada pelos quimiorreceptores periféricos é compensada pelos efeitos excitatórios desta xantina ao nível do quimiorreceptores centrais.------- RESUMEN Los cuerpos carotídeos (CB) son órganos emparejados que están localizados en la bifurcación de la arteria carótida común. Estos órganos son sensibles a variaciones en la PaO2, en la PaCO2, pH y temperatura siendo responsables de la hiperventilación que ocurre en respuesta a la hipoxia, contribuyendo también a la hiperventilación que acompaña a la acidosis metabólica y respiratoria. Las células quimiorreceptoras (tipo I o glómicas) del cuerpo carotídeo responden a las variaciones de gases arteriales liberando neurotransmissores que activan las terminaciones sensitivas del nervio del seno carotídeo (CSN) llevando la información al centro respiratorio central. Todavía esta por clarificar cual el neurotransmisor (o neurotransmisores) responsable por la señalización hipóxica en el CB. La adenosina es un neurotransmisor excitatório en el CB ya que aumenta la actividad del CSN e induce la hiperventilación a través de la activación de receptores de adenosina del subtipo A2. La importancia de estos efectos de la adenosina en la quimiorrecepción, descritos en ratas y gatos, ha sido fuertemente reforzada por resultados obtenidos en voluntarios sanos en los que la infusión intravenosa de adenosina induce hiperventilación y dispnea, efectos estés que han sido atribuidos a una activación del CB ya que la adenosina no cruza la barrera hemato-encefalica y el efecto es tanto más grande cuanto más cercana del CB es la administración. Este trabajo ha sido realizado con el objetivo de investigar cual el significado funcional de la adenosina en la quimiorrecepción en el CB en animales controlo y en animales sometidos a hipoxia crónica sostenida. Para alcanzar este objetivo se ha estudiado: 1) el efecto de la hipoxia moderada en la liberación de adenosina en una preparación in vitro de CB y la especificidad de esta liberación en comparación con otros tejidos no-quimiosensitivos, así como las vías metabólicas de producción y liberación de adenosina del órgano en normoxia y hipoxia; 2) la modulación de la liberación de adenosina/ATP de las células quimiorreceptoras del CB por receptores nicotínicos de ACh; 3) los efectos de la cafeína en el controlo periférico de la ventilación y la identidad de los receptores de adenosina involucrados en los efectos de la adenosina y cafeína en los quimiorreceptores del CB; 4) las interacciones entre los receptores D2 de dopamina y los receptores A2B de adenosina que modulan la liberación de catecolaminas (CA) en el CB de rata y; 5) el efecto de la ingestión crónica de cafeína, es decir, el bloqueo sostenido de los receptores de adenosina, simulando la dependencia de cafeína observada en la populación mundial del occidente, en la función del CB en ratas controlo y sometidas a hipoxia crónica sostenida. Los métodos utilizados en este trabajo incluirán: técnicas de biología molecular como imunocitoquímica y western-blot; técnicas bioquímicas, tales como la cuantificación de neurotransmissores por HPLC, bioluminescencia y métodos radioisotópicos; técnicas electrofisiológicas como el registro de potenciales eléctricos del nervio do seno carotídeo in vitro; y registros ventilatórios in vivo en animales no anestesiados y en libre movimiento (pletismografia). Se observó que: 1) la sensibilidad de los quimiorreceptores de CB esta correlacionada con un bajo umbral de liberación de adenosina en respuesta a la hipoxia ya que en respuesta a una hipoxia moderada (10% O2) la liberación de adenosina en el CB aumenta un 44%, sin embargo esta PaO2 no es un estimulo suficientemente fuerte para inducir la liberación de adenosina del ganglio cervical superior o del tejido arterial; se observó también que aproximadamente 40% de la adenosina liberada del CB proviene del catabolismo extracelular del ATP en normoxia y en hipoxia moderada, y que bajas PO2 inducen la liberación de adenosina vía activación del sistema de transporte equilibrativo ENT1. 2) la ACh modula la liberación de adenosina /ATP del CB en respuesta a la hipóxia moderada lo que sugiere que el papel excitatório de la ACh en la actividad quimiosensora incluye la activación indirecta de receptores purinérgicos por la adenosina y el ATP, indicando que la adenosina y el ATP pueden actuar como mediadores importantes en el proceso de quimiotransducción ya que: a) la activación de los receptores nicotínicos de ACh en el CB en normoxia estimula la liberación de adenosina (max 36%) que aparentemente proviene de la degradación extracelular del ATP. Se observó también que este aumento de adenosina en el CB en hipoxia ha sido antagonizado parcialmente por antagonistas de estos mismos receptores; b) la caracterización farmacológica de los receptores nicotínicos de ACh involucrados en la estimulación de la liberación de adenosina del CB ha revelado que los receptores nicotínicos de ACh involucrados son constituidos por sub-unidades α4ß2. 3) la adenosina modula la liberación de CA de las células quimiorreceptoras del CB a través de receptores de adenosina A2B ya que: a) la cafeína, un antagonista no selectivo de los receptores de adenosina, ha inhibido la liberación de CA en normoxia y en respuesta a estímulos de baja intensidad siendo ineficaz en la liberación inducida por estímulos de intensidad superior; b) el DPCPX y el MRS1754 ha mimetizado los efectos de la cafeína en el CB y el SCH58621 ha sido incapaz de inducir la liberación de CA lo que sugiere que los efectos de la cafeína son mediados por receptores A2B de adenosina que están localizados pré-sinapticamente en las células quimiorreceptoras del CB. 4) la aplicación aguda de cafeína ha inhibido en 52% la actividad quimiosensora del CSN inducida por la hipoxia siendo este efecto mediado respectivamente por receptores de adenosina A2A pós-sinápticos y A2B pré-sinápticos lo que indica que la actividad quimiosensora inducida por la hipoxia es controlada por la adenosina. 5) existe una interacción entre los receptores A2B y D2 que controla la liberación de CA del CB de rata ya que: a) el sulpiride, un antagonista de los receptores D2, ha aumentado la liberación de CA de las células quimiorreceptoras revertiendo el efecto inhibitorio de la cafeína sobre esta misma liberación; b) los antagonistas de los receptores D2, domperidona y haloperidol, han aumentado la liberación basal e evocada de CA de las células quimiorreceptoras confirmando la presencia de autorreceptores D2 en el CB de rata que controlan la liberación de CA a través de un mecanismo de feed-back negativo; c) la propilnorapomorfina, un agonista D2, ha inhibido la liberación basal e evocada de CA sendo este efecto revertido por la NECA, un agonista de los receptores A2B. Ya que la NECA potencia el efecto del haloperidol en la liberación de CA la interacción entre los D2 y A2B puede también ocurrir al nivel de segundos mensajeros, como el cAMP. 6) la ingestión crónica de cafeína en ratas controlo (normóxicas) no ha cambiado significativamente la función basal del CB medida como la dinámica de sus neurotransmisores, dopamina, ATP y adenosina y como actividad quimiosensora del CSN. Al revés de lo que pasa con los efectos básales, la ingestión crónica de cafeína facilitó la respuesta a la hipóxia, ya que ha aumentado la respuesta ventilatória medida como volumen minuto presentando también una clara tendencia para aumentar la actividad quimiosensora del CSN y aumentar la liberación de ATP y dopamina. 7. Después de un período de 15 días de hipoxia crónica se puede observar el fenómeno de climatización ya que las respuestas ventilatórias a la hipoxia están aumentadas, así como la actividad quimiosensora del CSN basal e inducida por la hipoxia. Los cambios observados en el metabolismo de la dopamina, así como en la liberación basal de dopamina y de adenosina podrían contribuir para la climatización en hipoxia crónica. El aumento en la liberación de adenosina en respuesta a la hipoxia aguda en ratas sometidas a hipoxia crónica sugiere un papel para la adenosina en el mantenimiento/aumento de las respuestas ventilatórias a la hipoxia aguda en hipoxia crónica sostenida. Se ha observado también que la liberación de ATP inducida por la hipoxia aguda está disminuida en hipoxia crónica y que la ingestión crónica de cafeína reverte este efecto para valores similares a los valores controlo, sugiriendo que la adenosina podría modular la liberación de ATP en hipoxia crónica. 8. la ingestión crónica de cafeína ha inducido el aumento del metabolismo de CA en el CB en ratas hipóxicas crónicas, medido como expresión de la tirosina hidroxilase, contenido, síntesis y liberación de CA. 9. la ingestión crónica de cafeína no ha inducido cambios en la actividad quimiosensora del CSN en ratas hipóxicas crónicas sin embargo las respuestas do CSN a una hipoxia intensa y moderada y a la hipercapnia están disminuidas. Este efecto inhibitorio que es debido a la ingestión crónica de cafeína es compensado al nivel de los quimiorreceptores centrales ya que los parámetros ventilatórios en condiciones básales y en respuesta a la hipoxia aguda no están modificados en ratas expuestas durante 15 días a una atmósfera hipóxica. Resumiendo se puede concluir que la adenosina en situaciones de hipoxia aguda así como en hipoxia crónica tiene un papel excitatório en la actividad quimiosensora del CB actuando directamente en los receptores A2A localizados pós-sinapticamente en el CSN, así como controlando la liberación de dopamina pré-sinaptica vía receptores A2B localizados en las células quimiorreceptoras. Las interacciones entre los receptores A2B y D2 observadas en las células quimiorreceptoras del CB podrían explicar el aumento del metabolismo de CA observado después de la ingestión crónica de cafeína en animales hipóxicos. Por fin, pero no menos importante se puede concluir que durante la climatización a la hipoxia la acción inhibitoria de la cafeína, medida como respuesta ventilatória, mediada por los quimiorreceptores periféricos es compensada por los efectos excitatórios de esta xantina al nivel de los quimiorreceptores centrales.

Post-transcriptional regulation of HFE gene expression

Thesis presented to obtain the Ph.D. degree in Biology (Molecular Genetics), by the Universidade Nova de Lisboa, Faculdade de Ciências e Tecnologia.

Avaliação da eficiência de microscópios de fluorescência confocais

Dissertação apresentada na Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa para obtenção do Grau de Mestre em Engenharia Biomédica. A presente dissertação foi desenvolvida em colaboração com o Instituto Gulbenkian de Ciência

Contributo para o estudo dos mecanismos de resistência ao imatinib em leucemia mielóide crónica

Dissertação apresentada para a obtenção do Grau de Mestre em Genética Molecular e Biomedicina, pela Universidade Nova de Lisboa, Faculdade de Ciências e Tecnologia

Desenvolvimento de um sistema para irradiação por ultravioleta de biomoléculas

Dissertação apresentada na Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa para a obtenção do grau de Mestre em Engenharia Biomédica

Estudos estruturais e funcionais da fenilalanina hidroxilase humana

Dissertação apresentada para a obtenção do Grau de Mestre em Genética Molecular e Biomedicina, pela Universidade Nova de Lisboa, Faculdade de Ciências e Tecnologia

UMA ABORDAGEM YEAST TWO-HYBRID PARA O ESTUDO DA REPLICAÇÃO E PATOGÉNESE DO VÍRUS DA HEPATITE DELTA

O vírus da hepatite delta (HDV) é o agente etiológico de uma das formas mais graves de hepatite viral e é ainda endémico em diversas regiões do globo, nomeadamente em África, na Amazónia e no Extremo Oriente. O HDV co-infecta ou super-infecta hepatócitos infectados com o vírus da hepatite B (HBV) aumentando em cerca de 10 vezes o risco de cirrose e hepatite fulminante. A associação clínica entre os dois vírus deve-se ao facto do invólucro do HDV ser constituído pelos antigénios de superfície do HBV (HBsAgs) que são necessários para a propagação da infecção. O genoma do HDV é constituído por uma molécula de RNA de cadeia simples, circular, com cerca de 1.7 Kb, que possui cerca de 70% de emparelhamento interno. Foi identificada uma única grelha de leitura aberta (ORF) no RNA viral que codifica para o antigénio delta (HDAg). A ocorrência de um mecanismo de editing do RNA, resulta na expressão de duas formas do HDAg, a pequena (S-HDAg) e a grande (L-HDAg). Várias funções essenciais para a replicação do HDV têm sido atribuídas a ambas as formas do HDAg, sendo a S-HDAg essencial para a acumulação de RNA viral e a L-HDAg responsável pela interacção com os HBsAgs para formar partículas virais. No entanto, dada a simplicidade dos seus componentes, admite-se que a replicação viral depende das interacções estabelecidas entre os HDAgs e factores celulares do hospedeiro. Apesar do número considerável de factores celulares descritos como interactores dos HDAgs ou RNA virais, a importância de muitas destas interacções não foi elucidada e muitas etapas do ciclo de replicação do HDV permanecem pouco claras. Para além disso, dado o número limitado de factores do hospedeiro que estão envolvidos na sua replicação, é muito provável que um número elevado de interactores do HDV permaneça por identificar. Este trabalho teve como objectivo a identificação de proteínas de fígado humano capazes de interagir com os HDAgs, utilizando o sistema yeast Two-Hybrid (YTH). Identificaram-se trinta proteínas com capacidade de interagir com a S-HDAg no sistema YTH, sendo que estas proteínas se encontram envolvidas em diferentes processos celulares. Com base nas características funcionais, foram seleccionadas três destas proteínas e as suas interacções com a S-HDAg foram investigadas com maior detalhe. As três proteínas seleccionadas foram a ribonucleoproteína nuclear heterogénea C (hnRNPC), a embryonic lethal abnormal vision like1 (ELAVL1/HuR) e a proteína 2 de ligação a EBNA1 (EBP2). As duas primeiras são proteínas de ligação a RNA, previamente descritas como envolvidas em processos de replicações de outros vírus com genoma RNA, enquanto a EBP2, é uma proteína de localização preferencialmente nucleolar, tal como por vezes acontece com os HDAgs. As interacções foram analisadas recorrendo a vários ensaios bioquímicos. No caso da hnRNPC e da HuR, após validação no sistema YTH, a capacidade de interacção com a S-HDAg foi confirmada quer in vitro por blot overlay quer in vivo por co-imunoprecipitação em células de hepatoma humano. Nas mesmas células, observou-se uma co-localização considerável entre os HDAgs e os RNAs virais. Finalmente, de modo a investigar a contribuição das proteínas hnRNPC e HuR na replicação do HDV, procedeu-se ao silenciamento destas proteínas pela utilização de short hairpin RNAs (shRNAs) específicos para os mRNAs correspondentes Observou-se que o silenciamento de ambas as proteínas hnRNPC e HuR endógenas, individualmente resultou numa diminuição acentuada nos níveis de expressão dos HDAgs. No que respeita à EBP2, a interacção com a S-HDAg foi confirmada em condições in vitro com recurso a ensaios de blot overlay e de cromatografia de afinidade. A análise por imunofluorescência indirecta e microscopia confocal revelou co-localização elevada entre os HDAgs e a EBP2, principalmente nos nucléolos de células de hepatoma humano. Finalmente, foi ainda utilizado o sistema YTH para estudar os mecanismos de importação dos HDAgs. Assim, este sistema foi utilizado com o propósito de identificar proteínas celulares capazes de interagir com um domínio específico dos HDAgs, o sinal de localização nuclear (NLS). Na pesquisa YTH realizada obtiveram-se 161 clones positivos, sendo que um deles mostrou codificar para a carioferina α4 (KPNA4). A interacção da KPNA4 com a S-HDAg foi reproduzida em condições in vitro através de um ensaio de cromatografia de afinidade tendo sido utilizadas formas recombinantes das duas proteínas. Este trabalho permitiu identificar várias proteínas celulares que interagem com a S-HDAg. Obtiveram-se evidências sugestivas de que algumas das proteínas identificadas podem desempenhar funções importantes no ciclo de replicação do HDV e que abrem novas perspectivas para o estudo do ciclo de replicação do vírus.