Streptococcus agalactiae adapts to glucose stress conditions by modulating gene expression profile

Diabetes mellitus is considered a risk factor for Group B Streptococcus (GBS) infections. Typically, this pathology is associated to high glucose levels in the bloodstream. Although clinical evidences support this notion, the physiological mechanisms underlying GBS adaptation to such conditions are not yet defined. In the attempt to address this issue, we performed comparative global gene expression analysis of GBS grown under glucose-stress conditions and observed that a number of metabolic and virulence genes was differentially regulated. Of importance, we also demonstrated that by knocking-out the csrRS locus the transcription profile of GBS grown in high-glucose conditions was profoundly affected, with more than a third of glucose-dependent genes, including the virulence factor bibA, found to be controlled by this two-component system. Furthermore, in vitro molecular analysis showed that CsrR specifically binds to the bibA promoter and the phosphorilation increases the affinity of the regulator to this promoter region. Moreover, we demonstrated that CsrR acts as a repressor of bibA expression by binding to its promoter in vivo. In conclusion, this work by elucidating both the response of GBS to pathological glucose conditions and the underlined molecular mechanisms will set the basis for a better understanding of GBS pathogenesis.

Identifizierung und Charakterisierung von Interaktionspartnern des synaptischen Vesikelproteins Synaptophysin

Die neuronale Signalübertragung beruht auf dem synaptischen Vesikelzyklus, der durch das koordinierte Zusammenspiel von circa 400 verschiedenen Proteinen reguliert wird. Eines der Hauptproteine des synaptischen Vesikels ist Synaptophysin (SYP), das zu den tetraspan vesicle membrane proteins (TVPs) gehört. Es wird vermutet, dass es zahlreiche Funktionen der Exo- und Endozytose moduliert, wenngleich die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen bisher größtenteils unverstanden sind. Ziel der Arbeit war daher die Identifizierung von Interaktionspartnern von SYP, um zum Verständnis der vielen ungeklärten Prozesse im synaptischen Vesikelzyklus beizutragen. Mit dem Split-Ubiquitin Yeast Two-Hybrid System, das eine direkte in vivo Interaktion von Membranproteinen erlaubt, konnten in der vorliegenden Arbeit bekannte, aber auch neue SYP-Bindungspartner identifiziert werden. Ein bekannter Interaktionspartner war Synaptobrevin2 (SYB2), das zu den stärksten im Split-Ubiquitin Y2H System identifizierten Bindeproteinen zählt. Zu den neuen starken SYP-Interaktionspartnern gehören die TVPs Synaptogyrin3 (SYNGR3) und SCAMP1. Somit konnten erstmals heterophile Interaktionen zwischen den verschiedenen TVP-Genfamilien nachgewiesen werden, die für eine universelle Funktion der TVPs sprechen. Die Validierung der im Split-Ubiquitin Y2H System ermittelten Interaktionspartner wurde auf eine Auswahl von Proteinen beschränkt, die vermutlich am synaptischen Vesikelzyklus beteiligt sind. Dabei konnte eine immunhistologische Kolokalisierung von SYP mit SYB2, SYNGR3, SCAMP1, Stathmin-like3 (STMN3), Rho family GTPase2 (RND2), Phospholipid transfer protein, Vesicle transport through interaction with t-SNAREs 1B homolog, Arfaptin2 und Profilin1 in den Synapsen-reichen Schichten der Retina beobachtet werden. Die SYP/SYB2- und SYP/SYNGR3-Komplexe konnten zudem sowohl aus Synaptosomen-Lysat als auch aus cDNA-transfizierten Epithelzellen koimmunpräzipitiert werden, wohingegen dies für die anderen Interaktionspartner nicht gelang. Da Koimmunpräzipitation die Struktur der Proteine durch Solubilisierung mit Detergenzien beeinflusst, wurden die in der Hefe beobachteten Interaktionen noch mittels Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer überprüft, mit dem Proteinwechselwirkungen in der nativen Umgebung nachgewiesen werden können. Ein positives FRET-Signal konnte für SYP mit SYB2, SYP, SYNGR3, SCAMP1, STMN3, RND2 und Arfaptin2 detektiert werden, lediglich für SYP mit Phospholipase D4 (PLD4) gelang dieser Nachweis nicht. Ferner zeigten FRET-Analysen von Synaptophysin-Mutanten, dass der zytoplasmatische C-Terminus für die Interaktion mit zytoplasmatischen und membranassoziierten Proteinen benötigt wird. Durch in vivo FRET-Studien mit der SH2-Domäne der Src-Kinase, die an phosphorylierte Tyrosine bindet, konnte eine Tyrosin-Phosphorylierung des zytoplasmatischen C-Terminus von Synaptophysin und von Synaptogyrin3 detektiert werden. Viele der neu identifizierten Synaptophysin-Interaktionspartner sind im Lipid-Metabolismus involviert. Vermutlich rekrutiert der zytoplasmatische und durch Phosphorylierung modifizierbare C-Terminus diese Partner in spezifische Lipoproteindomänen, die an der Feinabstimmung der synaptischen Vesikelendo- und -exozytose beteiligt sind.

Der C 4-Dicarboxylat- und Citratsensor DcuS aus Escherichia coli - Signalerkennung und Regulation

Das Zweikomponentensystem DcuSR aus Escherichia coli reguliert in Abhängigkeit von C4-Dicarboxylaten die Expression der Gene der Fumaratatmung. Die Erkennung von C4-Dicarboxylaten erfolgt über die periplasmatische Domäne der Sensorkinase DcuS und führt zur Autophosphorylierung des konservierten Histidinrestes in der Kinasedomäne. Die Phosphatgruppe wird anschließend auf den Responseregulator DcuR übertragen und führt zur Induktion der Zielgene. Dazu gehören der Antiporter DcuB (dcuB), die anaerobe Fumarase B (fumB) und die Fumaratreduktase (frdABCD). DcuS detektiert neben C4-Dicarboxylaten auch Citrat über die periplasmatische Domäne. In dem nah verwandten Sensor CitA wird Citrat spezifisch über die drei Carboxyl- und die Hydroxylgruppe durch die Bindestellen C1, C2, C3 und H erkannt. DcuS benötigt für die Erkennung von C4-Dicarboxylaten und Citrat die gleichen Bindestellen. Die Citratbindung von DcuS ähnelte der von C4-Dicarboxylaten und unterschied sich von der Citraterkennung in CitA. DcuS konnte durch gerichtete Mutagenese der Bindungsstelle in Varianten überführt werden, die spezifisch für C4-Dicarboxylate (DcuSDC) oder Citrat (DcuSCit) waren. DcuSDC und DcuSCit hatten komplementäre Substratspezifitäten und reagierten entweder auf C4-Dicarboxylate oder auf Citrat (und Mesaconat). Citrat wurde vermutlich als C4-Dicarboxylat (mit einem Acetylrest) und somit über die gleichen Bindestellen wie C4-Dicarboxylate erkannt. Die Bindestellen C2 und C3 sind hoch konserviert und essentiell für die Bindung von zwei Carboxylgruppen von Citrat und C4-Dicarboxylaten. Die Stellen C1 und H werden vermutlich für koordinative Zwecke benötigt. Der Fumarat/Succinat-Antiporter DcuB hat neben der Transportaktivität eine regulatorische Aufgabe im DcuSR-System. Die Deletion von DcuB führte zur konstitutiven Expression der dcuB´-´lacZ Reportergenfusion und anderer DcuSR-regulierter Gene in Abwesenheit von C4-Dicarboxylaten. Die Effektor-unabhängige Expression setzte eine intakte periplasmatische Domäne von DcuS voraus und zeigte in Anwesenheit der spezifischen DcuS-Mutanten (DcuSDC, DcuSCit) eine geänderte Antwort. Die lässt vermuten, dass DcuB die regulatorischen Eigenschaften über eine direkte Wechselwirkung mit DcuS ausübt. Um den phosphorylierten Responseregulator DcuR-P in den Ursprungszustand zurückzuführen, muss dieser dephosphoryliert werden. Die bisher unbekannte Dephosphatase kann dabei entweder von dem Responseregulator, der Sensorkinase oder einem weiteren Protein stammen. DcuR verfügt über eine intrinsische Phosphataseaktivität, die durch den Sensor geringfügig stimuliert wurde.

Heuristic algorithms for the Capacitated Location-Routing Problem and the Multi-Depot Vehicle Routing Problem

The Capacitated Location-Routing Problem (CLRP) is a NP-hard problem since it generalizes two well known NP-hard problems: the Capacitated Facility Location Problem (CFLP) and the Capacitated Vehicle Routing Problem (CVRP). The Multi-Depot Vehicle Routing Problem (MDVRP) is known to be a NP-hard since it is a generalization of the well known Vehicle Routing Problem (VRP), arising with one depot. This thesis addresses heuristics algorithms based on the well-know granular search idea introduced by Toth and Vigo (2003) to solve the CLRP and the MDVRP. Extensive computational experiments on benchmark instances for both problems have been performed to determine the effectiveness of the proposed algorithms. This work is organized as follows: Chapter 1 describes a detailed overview and a methodological review of the literature for the the Capacitated Location-Routing Problem (CLRP) and the Multi-Depot Vehicle Routing Problem (MDVRP). Chapter 2 describes a two-phase hybrid heuristic algorithm to solve the CLRP. Chapter 3 shows a computational comparison of heuristic algorithms for the CLRP. Chapter 4 presents a hybrid granular tabu search approach for solving the MDVRP.

Charakterisierung zellulärer Interaktionspartner des großen Hüllproteins des Hepatitis-B-Virus

Im Mittelpunkt dieser Arbeit stand das große L-Hüllprotein (L) des Hepatitis B - Virus. L bildet eine ungewöhnliche duale Topologie in der ER-Membran aus, welche auch im reifen Viruspartikel erhalten bleibt. In einem partiellen, posttranslationalen Reifungsprozess wird die sogenannte PräS-Region von der zytosolischen Seite der Membran aus in das ER-Lumen transloziert. Aufgrund seiner dualen Topologie und der damit verbundenen Multifunktionalität übernimmt L eine Schlüsselfunktion im viralen Lebenszyklus. Ein Schwerpunkt dieser Arbeit lag deshalb darin, neue zelluläre Interaktionspartner des L-Hüllproteins zu identifizieren. Ihre Analyse sollte helfen, das Zusammenspiel des Virus mit der Wirtszelle besser zu verstehen. Hierfür wurde das Split - Ubiquitin Hefe - Zwei - Hybrid System eingesetzt, das die Interaktionsanalyse von Membranproteinen und Membran-assoziierten Proteinen ermöglicht. Zwei der neu identifizierten Interaktionspartner, der v-SNARE Bet1 und Sec24A, die Cargo-bindende Untereinheit des CoPII-vermittelten vesikulären Transports, wurden weitergehend im humanen Zellkultursystem untersucht. Sowohl für Bet1 als auch für Sec24A konnte die Interaktion mit dem L-Hüllprotein bestätigt und der Bindungsbereich eingegrenzt werden. Die Depletion des endogenen Bet1 reduzierte die Freisetzung L-haltiger, nicht aber S-haltiger subviraler Partikel (SVP) deutlich. Im Gegensatz zu Bet1 interagierte Sec24A auch mit dem mittleren M- und kleinen S-Hüllprotein von HBV. Die Inhibition des CoPII-vermittelten vesikulären Transportweges durch kombinierte Depletion der vier Sec24 Isoformen blockierte die Freisetzung sowohl L- als auch S-haltiger SVP. Dies bedeutet, dass die HBV - Hüllproteine das ER CoPII-vermittelt verlassen, wobei sie aktiv Kontakt zur Cargo-bindenden Untereinheit Sec24A aufnehmen. Der effiziente Export der Hüllproteine aus dem ER ist für die Virusmorphogenese und somit für den HBV - Lebenszyklus essentiell. rnEin weiterer Schwerpunkt dieser Arbeit basierte auf der Interaktion des L-Hüllproteins mit dem ER-luminalen Chaperon BiP. In der vorliegenden Arbeit wurde überprüft, ob BiP, ähnlich wie das zytosolische Chaperon Hsc70, an der Ausbildung der dualen Topologie des L-Hüllproteins beteiligt ist. Hierfür wurde BiP durch die ektopische Expression seiner Ko-Chaperone BAP und ERdj4 in seiner Substrat-bindenen Kapazität manipuliert. ERdj4, ein Mitglied der Hsp40 - Proteinfamilie, stimuliert die ATPase-Aktivität von BiP, was die Substratbindung stabilisiert. Der Nukleotid - Austauschfaktor BAP hingegen vermittelt die Auflösung des BiP - Substrat - Komplexes. Die Auswirkung der veränderten in vivo-Aktivität von BiP auf die posttranslationale PräS-Translokation wurde mit Proteaseschutz - Versuchen untersucht. Die ektopische Expression des positiven als auch des negativen Regulators von BiP resultierte in einer drastischen Reduktion der posttranslationalen PräS-Translokation. Ein vergleichbarer Effekt wurde nach Manipulation des BiP ATPase - Zyklus durch Depletion der zellulären ATP - Konzentration beobachtet. Dies spricht dafür, dass das ER-luminale Chaperon BiP, zusammen mit Hsc70, eine zentrale Rolle in der Ausbildung der dualen Topologie des L-Hüllproteins spielt. rnZwei weitere Proteine, Sec62 und Sec63, die sich für die posttranslationale Translokation in der Hefe als essentiell erwiesen haben, wurden in die Analyse der dualen Topologie des L-Hüllproteins einbezogen. Interessanterweise konnte eine rein luminale Ausrichtung der PräS-Region nach kombinierter Depletion des endogenen Sec62 und Sec63 beobachtet werden. Dies deutet an, dass sowohl Sec62 als auch Sec63 an der Ausbildung der dualen Topologie des L-Hüllproteins beteiligt sind. In Analogie zur Posttranslokation der Hefe könnte Sec62 als Translokon-assoziierter Rezeptor für Substrate der Posttranslokation, und damit der PräS-Region, dienen. Sec63 könnte mit seiner J-Domäne BiP zum Translokon rekrutieren und daraufhin dessen Substrat-bindende Aktivität stimulieren. BiP würde dann, einer molekularen Ratsche gleich, die PräS-Region durch wiederholtes Binden und Freisetzen aktiv in das ER-Lumen hereinziehen, bis eine stabile duale Topologie des L-Hüllproteins ausgebildet ist. Die Bedeutung von Sec62 und Sec63 für den HBV - Lebenszyklus wird dadurch untermauert, dass sowohl die ektopische Expression als auch die Depletion des endogenen Sec63 die Freisetzung L-haltiger SVP deutlich reduziert. rn

Il Senato come camera di rappresentanza territoriale

La riforma del bicameralismo rappresenta nell’ordinamento italiano una delle tematiche più dibattute sin dalla “concessione” dello Statuto Albertino. In Assemblea Costituente, infatti, l’opzione tra monocamerali e bicameralismo - prima - e il dibattito su che tipo di bicameralismo si sarebbe dovuto adottare - poi - hanno dato vita ad una parte organizzativa particolarmente debole e in gran parte antiquata rispetto alle esigenze della prima parte della Costituzione che, al contrario, ha rappresentato il precipitato di una profonda consonanza di ideali. La tesi si propone dunque l’obiettivo di dimostrare che l’esigenza di procedere ad una riforma del sistema bicamerale in Italia sia oggi quanto mai attuale e necessaria. Da un lato, infatti, essa favorirebbe il superamento delle inefficienze del sistema parlamentare e potrebbe rappresentare uno strumento per ovviare alla debole razionalizzazione della forma di governo che, da sempre, ha determinato la strutturale instabilità degli esecutivi. Dall’altro lato, la riforma servirebbe soprattutto a realizzare quella connessione organica tra Stato e regioni necessaria per completare il disegno regionalistico che si ricava dalla Costituzione stessa. Esigenza questa che, peraltro, si è notevolmente rafforzata con la riforma del titolo V della Costituzione, la cui portata innovativa è stata sostanzialmente svuotata di contenuto a causa delle difficoltà che si sono incontrate nella sua attuazione.

Oligomerisation, localisation and interaction of the sensor histidine kinases DcuS and CitA in Escherichia coli

The two-component system DcuSR of Escherichia coli regulates gene expression of anaerobic fumarate respiration and aerobic C4-dicarboxylate uptake. C4-dicarboxylates and citrate are perceived by the periplasmic domain of the membrane-integral sensor histidine kinase DcuS. The signal is transduced across the membrane by phosphorylation of DcuS and of the response regulator DcuR, resulting in activation of DcuR and transcription of the target genes.rnIn this work, the oligomerisation of full-length DcuS was studied in vivo and in vitro. DcuS was genetically fused to derivatives of the green fluorescent protein (GFP), enabling fluorescence resonance energy transfer (FRET) measurements to detect protein-protein interactions in vivo. FRET measurements were also performed with purified His6-DcuS after labelling with fluorescent dyes and reconstitution into liposomes to study oligomerisation of DcuS in vitro. In vitro and in vivo fluorescence resonance energy transfer showed the presence of oligomeric DcuS in the membrane, which was independent of the presence of effector. Chemical crosslinking experiments allowed clear-cut evaluation of the oligomeric state of DcuS. The results showed that detergent-solubilised His6-DcuS was mainly monomeric and demonstrated the presence of tetrameric DcuS in proteoliposomes and in bacterial membranes.rnThe sensor histidine kinase CitA is part of the two-component system CitAB of E. coli, which is structurally related to DcuSR. CitAB regulates gene expression of citrate fermentation in response to external citrate. The sensor kinases DcuS and CitA were fused with an enhanced variant of the yellow fluorescent protein (YFP) and expressed in E. coli under the control of an arabinose-inducible promoter. The subcellular localisation of DcuS-YFP and CitA-YFP within the cell membrane was studied by means of confocal laser fluorescence microscopy. Both fusion proteins were found to accumulate at the cell poles. The polar accumulation was slightly increased in the presence of the stimulus fumarate or citrate, respectively, but independent of the expression level of the fusion proteins. Cell fractionation demonstrated that polar accumulation was not related to inclusion bodies formation. The degree of polar localisation of DcuS-YFP was similar to that of the well-characterised methyl-accepting chemotaxis proteins (MCPs), but independent of their presence. To enable further investigations on the function of the polar localisation of DcuS under physiological conditions, the sensor kinase was genetically fused to the flavin-based fluorescent protein Bs2 which shows fluorescence under aerobic and anaerobic conditions. The resulting dcuS-bs2 gene fusion was inserted into the chromosome of various E. coli strains.rnFurthermore, a protein-protein interaction between the related sensor histidine kinases DcuS and CitA, regulating common metabolic pathways, was detected via expression studies under anaerobic conditions in the presence of citrate and by in vivo FRET measurements.

The C-4-Dicarboxylate carriers DcuB and DctA of Escherichia coli: function as cosensors and topology

Das fakultativ anaerobe Enterobakterium Escherichia coli nutzt C4-Dicarboxylate sowohl unter aeroben als auch anaeroben Bedingungen als Kohlenstoff- und Energiequelle. Die Aufnahme der C4-Dicarboxylaten und die Energiekonservierung mittels Fumaratatmung wird durch das Zweikomponentensystem DcuSR reguliert. Die Sensorhistidinkinase DcuS und der nachgeschaltete Responseregulator DcuR aktivieren bei Verfügbarkeit von C4-Dicarboxylaten die Expression der Gene für den Succinat Transporter DctA, den anaeroben Fumarat/Succinat Antiporter DcuB, die Fumarase B sowie die Fumaratreduktase FrdABCD. Die Transportproteine DctA und DcuB wiederum regulieren die Expression der DcuSR-abhängigen Gene negativ. Fehlen von DctA oder DcuB resultiert bereits ohne Effektor in einer maximalen Expression von dctA bzw. dcuB. Durch gerichtete und ungerichtete Mutagenese wurde gezeigt, dass die Transportfunktion des Carriers DcuB unabhängig von seiner regulatorischen Funktion ist. DcuB kann daher als Cosensor des DcuSR Systems angesehen werden.rnUnter Verwendung von Reportergenfusionen von C-terminal verkürzten Konstrukten von DcuB mit der Alkalischen Phosphatase und der β-Galactosidase wurde die Topologie des Multitransmembranproteins DcuB bestimmt. Zusätzlich wurde die Zugänglichkeit bestimmter Aminosäurereste durch chemische Modifikation mit membran-durchlässigen und membran-undurchlässigen Thiolreagenzien untersucht. Die erhaltenen Ergebnisse deuten auf die Existenz eines tief in die Membran reichenden, hydrophilen Kanal hin, welcher zum Periplasma hin geöffnet ist. Mit Hilfe der Topologie-Studien, des Hydropathie-Blots und der Sekundärstruktur-Vorhersage wurde ein Modell des Carriers erstellt. DcuB besitzt kurze, periplasmatisch liegende Proteinenden, die durch 12 Transmembranhelices und zwei große hydrophile Schleifen jeweils zwischen TM VII/VIII und TM XI/XII verbunden sind. Die regulatorisch relevanten Reste K353, T396 und D398 befinden sich innerhalb von TM XI sowie auf der angrenzenden cytoplasmatischen Schleife XI-XII. Unter Berücksichtigung der strukturellen und funktionellen Aspekte wurde ein Regulationsmodell erstellt, welches die gemeinsam durch DcuB und DcuS kontrollierte C4-Dicarboxylat-abhängige Genexpression darstellt. rnDer Effekt von DctA und DcuSR auf die Expression einer dctA´-´lacZ Reportergenfusion und auf die aerobe C4-Dicarboxylat-Aufnahme wurde untersucht. In-vivo FRET-Messungen weisen auf eine direkte Wechselwirkung zwischen dem Carrier DctA und dem Sensor DcuS hin. Dieses Ergebnis stützt die Theorie der Regulation von DcuS durch C4-Dicarboxylate und durch die Cosensoren DctA bzw. DcuB mittels direkter Protein-Protein Interaktion.rn

On the inheritance and mechanism of baculovirus resistance of the codling moth, Cydia pomonella (L.)

Das Cydia pomonella Granulovirus (CpGV, Baculoviridae) wird seit Ende der 1980er Jahre als hoch-selektives und effizientes biologisches Bekämpfungsmittel zur Kontrolle des Apfelwicklers im Obstanbau eingesetzt. Seit 2004 wurden in Europa verschiedene Apfelwicklerpopulationen beobachtet die resistent gegenüber dem hauptsächlich angewendeten Isolat CpGV-M aufweisen. Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Untersuchung der Vererbung und des Mechanismus der CpGV Resistenz. Einzelpaarkreuzungen zwischen einem empfindlichen Laborstamm (CpS) und einem homogen resistenten Stamm (CpRR1) zeigten, dass die Resistenz durch ein einziges dominantes Gen, das auf dem Z-Chromosom lokalisiert ist, vererbt wird. Massernkreuzungen zwischen CpS und einer heterogen resistenten Feldpopulation (CpR) deuteten zunächst auf einen unvollständig dominanten autosomalen Erbgang hin. Einzelpaarkreuzungen zwischen CpS und CpR bewiesen jedoch, dass die Resistenz in CpR ebenfalls monogen dominant und geschlechtsgebunden auf dem Z-Chromosom vererbt wird. Diese Arbeit diskutiert zudem die Vor- und Nachteile von Einzelpaarkreuzungen gegenüber Massernkreuzungen bei der Untersuchung von Vererbungsmechanismen. Die Wirksamkeit eines neuen CpGV Isolates aus dem Iran (CpGV-I12) gegenüber CpRR1 Larven, wurde in Bioassays getestet. Die Ergebnisse zeigen, dass CpGV-I12 die Resistenz in allen Larvenstadien von CpRR1 brechen kann und fast so gut wirkt wie CpGV-M gegenüber CpS Larven. Daher ist CpGV-I12 für die Kontrolle des Apfelwicklers in Anlagen wo die Resistenz aufgetreten ist geeignet. Um den der CpGV Resistenz zugrunde liegenden Mechanismus zu untersuchen, wurden vier verschiedene Experimente durchgeführt: 1) die peritrophische Membran degradiert indem ein optischer Aufheller dem virus-enthaltenden Futtermedium beigefügt wurde. Das Entfernen dieser mechanischen Schutzbarriere, die den Mitteldarm auskleidet, führte allerdings nicht zu einer Reduzierung der Resistenz in CpR Larven. Demnach ist die peritrophische Membran nicht am Resistenzmechanismus beteiligt. 2) Die Injektion von Budded Virus in das Hämocoel führte nicht zur Brechung der Resistenz. Folglich die die Resistenz nicht auf den Mitteldarm beschränkt, sondern auch in der Sekundärinfektion wirksam. 3) Die Replikation von CpGV in verschiedenen Geweben (Mitteldarm, Hämolymphe und Fettkörper) von CpS und CpRR1 wurde mittels quantitativer PCR verfolgt. In CpS Larven konnte in allen drei Gewebetypen sowohl nach oraler als auch nach intra-hämocoelarer Infektion eine Zunahme der CpGV Genome in Abhängigkeit der Zeit festgestellt werden. Dagegen konnte in den Geweben aus CpRR1 nach oraler sowie intra-hämocoelarer Infektion keine Virusreplikation detektiert werden. Dies deutet darauf hin, dass die CpGV Resistenz in allen Zelltypen präsent ist. 4) Um zu untersuchen ob ein humoraler Faktor in der Hämolymphe ursächlich an der Resistenz beteiligt ist, wurde Hämolymphe aus CpRR1 Larven in CpS Larven injiziert und diese anschließend oral mit CpGV infiziert. Es konnte jedoch keine Immunreaktion beobachtet und kein Faktor in der Hämolymphe identifiziert werden, der Resistenz induzieren könnte. Auf Grundlage dieser Ergebnisse kann festgestellt werden, dass in resistenten Apfelwicklerlarven die virale Replikation in allen Zelltypen verhindert wird, was auf eine Virus-Zell Inkompatibilität hinweist. Da in CpRR1 keine DNA Replikation beobachtet wurde, wird die CpGV Resistenz wahrscheinlich durch eine frühe Unterbindung der Virusreplikation verursacht.Das früh exprimierte Gen pe38 codiert für ein Protein, das wahrscheinlich für die Resistenzbrechung durch CpGV-I12 verantwortlich ist. Interaktionen zwischen dem Protein PE38 und Proteinen in CpRR1 wurden mit Hilfe des Yeast Two-Hybrid (Y2H) Systems untersucht. Die detektierten Interaktionen sind noch nicht durch andere Methoden bestätigt, jedoch wurden zwei mögliche Gene auf dem Z-Chromosom und eines auf Chromosom 15 gefunden, wie möglicherweise an der CpGV Resistenz beteiligt sind.

Die Entwicklung der Mesofauna eines Weinberges im nordöstlichen Rheinhessen im Vergleich zum Lennebergwald und weiteren Agrarflächen

ZusammenfassungrnrnrnDer Köderstreifentest, die Auswertung der Minicontainer und die Erfassung der Bodenlebewesen mit Hilfe der Bodenstechkerne ergeben zusammen eine gut standardisierte Methode zur Darstellung und Beurteilung der Mesofauna. Unter der Vorraussetzung gleicher abiotischer Faktoren ist es problemlos möglich, selbst unterschiedliche Standorte wie Agrarflächen, Weinberge und Waldböden vergleichend zu untersuchen.rnrnAuf den verschiedenen Versuchsflächen des Laubenheimer Weinberges gelingt es deutlich zu zeigen, wie wichtig eine naturnahe Begrünung für den Boden ist. Dies betrifft nicht nur die Entwicklung der Humusschicht und damit die Bodenlebewesen, sondern auch die Schaffung von Kapillaren und Poren, die durch schwere landwirtschaftliche Geräte im Rahmen der Bo-denverdichtung reduziert werden. Erosionserscheinungen kommen vollständig zum Stillstand. Das Ökosystem Boden sollte auch so gut wie keine Belastung durch Herbizide, Insektizide und Pestizide erfahren. Ähnliches gilt auch für agrarisch genutzte Flächen. rnrnDer Lennebergwald als Naherholungsregion von Mainz ist besonders schützenswert, da dieser durch intensiven Immissionseintrag aufgrund der Nähe zu den Autobahnen und durch die Eutrophierung über die Haustiere stark belastet wird. Die immer größere Ausdehnung des Siedlungsgebietes und die damit verbundene steigende Anzahl an Waldbesuchern, die durch Verlassen der vorgegebenen Wege den Boden zerstören, gefährden zusätzlich das Ökosystem.rnrnÜber Sinn und Zweck einer Flurbereinigung zu diskutieren ist hier nicht angebracht. Aus bo-denkundlicher Sicht ist sie nicht zu befürworten, da hiermit alle bodenbewahrenden Maßnah-men ignoriert werden. Wichtig ist es, bei den Landwirten Aufklärungsarbeit zu leisten, was bodenschonende und bodenweiterentwickelnde Bearbeitungsmethoden bedeuten. Mit Hilfe sachgemäßer Aufklärung und richtiger Umsetzung kann durch Begrünungsmaßnahmen der zum Teil sehr stark strapazierte Boden erhalten, gefördert und auf lange Sicht stabilisiert wer-den.rnrnAufgrund der festgestellten Tatsachen wurde ab 2008 auf eine flächige Dauerbegrünung um-gestellt, so dass es auch in den unbegrünten Rebzeilen zu einer Bodenverbesserung kommen kann. Mit großer Wahrscheinlichkeit dürfte diese schneller voranschreiten, da die Mesofauna von den benachbarten begrünten Rebzeilen einwandern kann. rnDie Mesofauna landwirtschaftlich genutzter Flächen und Waldgebiete kann, obwohl extrem unterschiedlich, miteinander verglichen werden.rnrnBrachflächen und Waldgebiete lassen sich aufgrund der unberührten Bodenstrukturen sogar gut miteinander vergleichen. Temperatur- und Niederschlagsverhältnisse müssen dabei über-einstimmen. Die Azidität der jeweiligen Böden gilt es zu berücksichtigen, da verschiedene Tiergruppen damit unterschiedlich umgehen. Collembolen bevorzugen neutrale Böden, wäh-rend Acari als Räuber mit den Lebewesen in sauren Böden besser zurechtkommen. Die Streu-auflage ist dabei von großer Bedeutung.rnrnIm Rahmen von Bearbeitungsmaßnahmen kommt es durch jeglichen Maschineneinsatz zu ei-ner mehr oder weniger starken Veränderung der Bodenstruktur und somit auch der darin le-benden Mesofauna. Bis sich diese erholt hat, steht meist schon die nächste Bodenbewirtschaf-tung an. Die Bodenverdichtung spielt auch eine Rolle. Bei herkömmlichem Ackerbau ist eine Fruchtfolge mit eingeschalteter Brache oder Gründüngung mit Klee oder Luzerne angebracht, um die Mesofauna nicht zu stark zu strapazieren. Organische Düngegaben leicht abbaubarer Streu sind deutlich zu bevorzugen gegenüber sehr zellulose- und ligninhaltigen Pflanzenresten. Die Einbringung von Stoppeln nach Aberntung von Getreidefeldern ist sinnvoll, solange dabei nicht zu tief in die Bodenstruktur eingegriffen wird (ZIMMER 1997).rnrnIm Rahmen der Sonderkultur Wein, bei der eine Bodenbearbeitung aus den aufgezeigten Gründen eigentlich nicht notwendig wäre, sind Dauerbegrünungsmaßnahmen generell von Nutzen: der Erosion wird vorgebeugt, die Bodenfeuchte konstant gehalten, der anfallende Mulch als Gründüngung genutzt. Dies sind alles entscheidende Faktoren, die die Meso- und Makrofauna fördern. Nur die Bodenverdichtung durch schweres Gerät, wie Schlepper und Vollernter, sind für den Boden nicht förderlich (HEISLER 1993, EHRENSBERGER 1993). Nie-derdruckreifen und Verringerung der Befahrung sind geeignete Gegenmaßnahmen. rnrnEntgegen landläufiger Winzermeinung, stellen die Pflanzen einer Begrünung eigentlich keine Konkurrenz für die Weinstöcke dar. Die Vorteile einer Begrünung sind nicht nur die Förde-rung der einheimischen Flora in ihrem standortgerechten Artenreichtum, sondern auch Ver-vielfältigung von Meso- und Makrofauna aufgrund der dadurch mehr anfallenden und ein-zuarbeitenden leicht abbaubaren Streu (GRIEBEL 1995).rn

The oxygen sensors FNR from Escherichia coli and NreABC from Staphylococcus carnosus

Im Laufe der Evolution entwickelte sich eine Reihe von Sauerstoff-Sensorsystemen in Bakterien, um die Genexpression der Sauerstoffverfügbarkeit anzupassen. Der Sauerstoffsensor FNR aus Escherichia coli bindet unter anaeroben Bedingungen ein [4Fe4S]2+ Zentrum. Unter Sauerstoffeinfluß zerfällt aktives [4Fe4S]2+FNR zu inaktivem [2Fe2S]2+FNR und weiter zu ebenfalls inaktivem apoFNR. In der vorliegenden Arbeit wurde der Zustand von FNR in vivo in aeroben und anaeroben Zellen von Escherichia coli aufgeklärt. Durch Alkylierung der Cysteine in FNR und anschließender Analyse im Massenspektrometer konnte gezeigt werden, das FNR in aeroben Zellen hauptsächlich in der apo-Form vorliegt. Nach ca. 6 Minuten war in lebenden E. coli Zellen die Umwandlung von [4Fe4S]2+ FNR zu apoFNR abgeschlossen.rnrnIn dem gram positiven Bakterium Staphylococcus carnosus aktiviert das NreBC System unter anaeroben Wachstumsbedingungen die Gene der Nitratatmung. NreB ist eine cytoplasmatische Sensorhistidinkinase, die ein sauerstofflabiles [4Fe4S]2+ Zentrum über eine PAS-Domäne bindet. Das [4Fe4S]2+ Zentrum wird von vier Cysteinen gebunden. Der Responsregulator NreC steuert nach Aktivierung durch NreB die Transkription der Zielgene. In der vorliegenden Arbeit wurde NreB mit Hilfe von Cysteinmarkierungen in vivo charakterisiert. Durch die Änderung der Cystein-Zugänglichkeit für Thiolreagenzien nach Sauerstoffzugabe konnte eine Halbwertszeit von ca. 3 Minuten für das [4Fe4S]2+ Zentrum in vivo bestimmt werden. In anaeroben Bakterien stellt [4Fe4S]2+NreB die Hauptform von NreB dar, während in aeroben Bakterien hauptsächlich apoNreB vorkommt. Dieses Ergebnis konnte durch Massenspektroskopie bestätigt werden. Weiterhin konnte gezeigt werden das NreA mit NreB und NreC wechselwirkt und Bestandteil des NreABC Drei-Komponentensystems ist. rn

Analysis and mathematical modeling of wave-structure interaction

The aim of this thesis, included within the THESEUS project, is the development of a mathematical model 2DV two-phase, based on the existing code IH-2VOF developed by the University of Cantabria, able to represent together the overtopping phenomenon and the sediment transport. Several numerical simulations were carried out in order to analyze the flow characteristics on a dike crest. The results show that the seaward/landward slope does not affect the evolution of the flow depth and velocity over the dike crest whereas the most important parameter is the relative submergence. Wave heights decrease and flow velocities increase while waves travel over the crest. In particular, by increasing the submergence, the wave height decay and the increase of the velocity are less marked. Besides, an appropriate curve able to fit the variation of the wave height/velocity over the dike crest were found. Both for the wave height and for the wave velocity different fitting coefficients were determined on the basis of the submergence and of the significant wave height. An equation describing the trend of the dimensionless coefficient c_h for the wave height was derived. These conclusions could be taken into consideration for the design criteria and the upgrade of the structures. In the second part of the thesis, new equations for the representation of the sediment transport in the IH-2VOF model were introduced in order to represent beach erosion while waves run-up and overtop the sea banks during storms. The new model allows to calculate sediment fluxes in the water column together with the sediment concentration. Moreover it is possible to model the bed profile evolution. Different tests were performed under low-intensity regular waves with an homogeneous layer of sand on the bottom of a channel in order to analyze the erosion-deposition patterns and verify the model results.

Funktion der C 4-Dicarboxylat-Transporter DctA und DcuB als Co-Sensoren von DcuS in Escherichia coli

Escherichia coli kann C4-Dicarboxylate sowohl unter aeroben als auch unter anaeroben Bedingungen zur Energiekonservierung nutzen. Die Synthese der beteiligten Transporter und Enzyme wird auf der Transkriptionsebene durch das Zweikomponentensystem DcuSR reguliert. DcuS ist der Sensor für C4-Dicarboxylate. Der Antwortregulator DcuR wird von DcuS aktiviert und induziert die Expression des C4-Dicarboxylat-Transporters DctA unter aeroben Verhältnissen. Anaerob verstärkt DcuSR die Expression des Fumarat/Succinat-Antiporters DcuB, der Fumarase B und der Fumaratreduktase FrdABCD. DctA und DcuB agieren als Co-Sensoren von DcuS und üben einen negativen Effekt auf die Genexpression von dctA bzw. dcuB aus.rnIn dieser Arbeit wurde die Funktion von DctA und DcuB als Co-Sensoren von DcuS untersucht. Sowohl für DcuB als auch für DctA wurde eine direkte Protein-Protein-Interaktion mit DcuS über ein bakterielles Two-Hybrid System nachgewiesen. DcuS bildete ein Transporter-Sensor-Cluster mit DctA und DcuB. C-terminale Verkürzung und die Mutagenese einzelner Aminosäuren der C-terminalen Helix 8b von DctA führten zu einem Verlust der Interaktion mit DcuS. Mit dieser Interaktion gingen sowohl die regulatorische Funktion als auch die Transportfunktion der Punktmutante DctA-L414A verloren. Ein Verlust der Interaktion wurde ebenfalls zwischen einer konstitutiv aktiven DcuS-Mutante und wildtypischem DctA beobachtet. Ebenso zeigte sich eine partielle Reduktion der Interaktion von DcuS mit DctA, wenn DcuS nach der zweiten Transmembranhelix verkürzt wurde. Die Interaktion zwischen DcuS und DctA wurde durch den Effektor Fumarat modifiziert, ging aber nicht komplett verloren.rnDctA konnte in verschiedenen Plasmidsystemen überproduziert werden und bildete Homotrimere. Die Topologie von DctA wurde mit experimentellen und in silico Methoden aufgeklärt. DctA ähnelt der Struktur und Topologie des Aminosäuretransporters Glt aus Pyrococcus horikoshii. DctA besitzt acht Transmembranhelices mit einem cytosolischen N- und C-Terminus sowie zwei Haarnadelschleifen. Die Substratbindung findet höchstwahrscheinlich in den Haarnadelschleifen statt und der Transport erfolgt nach dem „alternating access“ Modell.rnAußerdem wurde die Funktion des Transporters YfcC untersucht. Das Gen yfcC wurde mit Schlüsselgenen des Acetatstoffwechsels co-transkribiert. In yfcC-Deletionsstämmen zeigte sich ein stammspezifischer Defekt bei Wachstum mit Acetat und Transport von Acetat.

Kontinuierliche Kreuzkupplungsreaktionen in mikrostrukturierten Systemen

Im Rahmen dieser Arbeit wurden unterschiedliche Palladium-katalysierte Kreuzkupplungsreaktionen untersucht. Ein besonderes Augenmerk wurde dabei auf die Suzuki-Miyaura-Reaktion gelegt. Unter anderem aufgrund der langen Reaktionszeiten und der zweiphasigen Bedingungen ist diese Reaktionsklasse nur sehr schwer als kontinuierlicher Prozess zu etablieren. Vielen dieser Ansätze ist jedoch zu eigen, dass der große Vorteil der Mikroprozesstechnik, eine überlegene Kontrolle von Temperatur und Stofftransport, kaum ausgeschöpft wird. An diesem Punkt setzt diese Arbeit von technischer aus Seite an. Der zweite Schwerpunkt der Arbeit sind die prinzipiellen Untersuchungen an kontinuierlichen Flüssig-Flüssig-Zwei-Phasen-Reaktionen. Im Zuge des DBU-finanzierten Transkat-Projektes wurden hierbei anhand einfacher Veresterungsreaktionen grundlegende Kenntnisse zu Stofftransport, Grenzflächen und Phasentrennung innerhalb mikrostrukturierter Systeme gesammelt. Dank speziell angefertigter Glasmikroreaktoren von der Firma mikroglas chemtech GmbH war eine genaue optische und digitale Charakterisierung der Phasengrenzflächen möglich. Ein wichtiges Ergebnis war darüber hinaus, dass ionische Flüssigkeiten, als eigenständige Phasen verwendet, enorm zum Massentransfer und somit zur Reaktionsgeschwindigkeit beitragen können.

Dinamica di una faglia con due asperità in presenza di accoppiamento viscoelastico

Il lavoro di tesi si propone di analizzare l'evoluzione dinamica di una faglia caratterizzata da due asperità complanari contraddistinte da diverso attrito (modello asimmetrico) e da accoppiamento viscoelastico. Il modello reologico assunto per la crosta terrestre è di tipo Maxwelliano: lo sforzo trasferito da un'asperità all'altra in occasione degli scorrimenti delle asperità stesse subisce parziale rilassamento durante il periodo intersismico, con conseguente anticipo o ritardo degli eventi sismici successivi. Lo studio del sistema viene condotto tramite un modello di faglia discreto, in cui lo stato della faglia è determinato da tre variabili che rappresentano i deficit di scorrimento delle asperità e il loro accoppiamento viscoelastico. Scopo principale della tesi è quello di caratterizzare i differenti modi dinamici del sistema, determinando equazioni del moto e orbite nello spazio delle fasi e confrontando i risultati ottenuti con i modelli precedentemente sviluppati, con particolare riferimento al caso simmetrico (asperità caratterizzate dallo stesso attrito) studiato in [Amendola e Dragoni (2013)] e al caso di accoppiamento puramente elastico analizzato in [Dragoni e Santini (2012)]. Segue l'applicazione del modello all'evento sismico verificatosi in Alaska nel 1964, generato dallo scorrimento delle asperità di Kodiak Island e Prince William Sound: lo studio verte in particolare sulla valutazione dello stato di sforzo sulla faglia prima e dopo il terremoto, la determinazione della funzione sorgente (moment rate) a esso associata e la caratterizzazione della possibile evoluzione futura del sistema. Riferimenti bibliografici Amendola, A. & Dragoni, M., “Dynamics of a two-fault system with viscoelastic coupling”. Nonlinear Processes in Geophysics, 20, 1–10, 2013. Dragoni, M. & Santini, S., “Long-term dynamics of a fault with two asperities of different strengths”. Geophysical Journal International, 191, 1457–1467, 2012.