Funktion der C 4-Dicarboxylat-Transporter DctA und DcuB als Co-Sensoren von DcuS in Escherichia coli

Escherichia coli kann C4-Dicarboxylate sowohl unter aeroben als auch unter anaeroben Bedingungen zur Energiekonservierung nutzen. Die Synthese der beteiligten Transporter und Enzyme wird auf der Transkriptionsebene durch das Zweikomponentensystem DcuSR reguliert. DcuS ist der Sensor für C4-Dicarboxylate. Der Antwortregulator DcuR wird von DcuS aktiviert und induziert die Expression des C4-Dicarboxylat-Transporters DctA unter aeroben Verhältnissen. Anaerob verstärkt DcuSR die Expression des Fumarat/Succinat-Antiporters DcuB, der Fumarase B und der Fumaratreduktase FrdABCD. DctA und DcuB agieren als Co-Sensoren von DcuS und üben einen negativen Effekt auf die Genexpression von dctA bzw. dcuB aus.rnIn dieser Arbeit wurde die Funktion von DctA und DcuB als Co-Sensoren von DcuS untersucht. Sowohl für DcuB als auch für DctA wurde eine direkte Protein-Protein-Interaktion mit DcuS über ein bakterielles Two-Hybrid System nachgewiesen. DcuS bildete ein Transporter-Sensor-Cluster mit DctA und DcuB. C-terminale Verkürzung und die Mutagenese einzelner Aminosäuren der C-terminalen Helix 8b von DctA führten zu einem Verlust der Interaktion mit DcuS. Mit dieser Interaktion gingen sowohl die regulatorische Funktion als auch die Transportfunktion der Punktmutante DctA-L414A verloren. Ein Verlust der Interaktion wurde ebenfalls zwischen einer konstitutiv aktiven DcuS-Mutante und wildtypischem DctA beobachtet. Ebenso zeigte sich eine partielle Reduktion der Interaktion von DcuS mit DctA, wenn DcuS nach der zweiten Transmembranhelix verkürzt wurde. Die Interaktion zwischen DcuS und DctA wurde durch den Effektor Fumarat modifiziert, ging aber nicht komplett verloren.rnDctA konnte in verschiedenen Plasmidsystemen überproduziert werden und bildete Homotrimere. Die Topologie von DctA wurde mit experimentellen und in silico Methoden aufgeklärt. DctA ähnelt der Struktur und Topologie des Aminosäuretransporters Glt aus Pyrococcus horikoshii. DctA besitzt acht Transmembranhelices mit einem cytosolischen N- und C-Terminus sowie zwei Haarnadelschleifen. Die Substratbindung findet höchstwahrscheinlich in den Haarnadelschleifen statt und der Transport erfolgt nach dem „alternating access“ Modell.rnAußerdem wurde die Funktion des Transporters YfcC untersucht. Das Gen yfcC wurde mit Schlüsselgenen des Acetatstoffwechsels co-transkribiert. In yfcC-Deletionsstämmen zeigte sich ein stammspezifischer Defekt bei Wachstum mit Acetat und Transport von Acetat.

Escherichia coli is able to use C4-dicarboxylates for energy conservation under aerobic and anaerobic conditions. Synthesis of the involved transporters and enzymes is regulated on the transcription level by the DcuSR two-component system. DcuS is the C4-dicarboxylate-sensor. The response regulator DcuR is activated by DcuS and induces the expression of several target genes. In aerobiosis, expression of the C4-dicarboxylate-transporter DctA is increased. In anaerobiosis, the expression of the fumarate/succinate-Antiporter DcuB, the Fumarase B and the fumarate reductase FrdABCD is enhanced. DctA and DcuB both act as co-sensors for DcuS and repress the gene expression of dctA or dcuB, respectively. rnIn this work the role of DctA and DcuB as co-sensors for DcuS was investigated. A direct protein-protein-interaction between DctA as well as DcuB with DcuS was confirmed with a bacterial two-hybrid system. DcuS formed a transporter-sensor-cluster with DctA and DcuB. Truncation and single amino acid mutagenesis of the C-terminal DctA helix 8b resulted in a loss of interaction with DcuS. Additionally, regulatory and transport function were lost in the single mutant DctA-L414A. A loss of interaction was also observed between a constitutively active DcuS point mutant and DctA. The interaction of DcuS with DctA was reduced when DcuS was truncated after its second transmembrane helix. The substrate fumarate modified but did not abolish the interaction between DcuS and DctA. rnDctA was overproduced in several plasmid systems and formed homotrimers. The topology of DctA was analysed by experimental and in silico methods. DctA has a structure and topology similar to the amino acid transporter Glt from Pyrococcus horikoshii. It consists of eight transmembrane helices with the N- and C-terminus located in the cytoplasm and two hairpin loops. The substrate binding site is most probably located in the hairpin loops and substrate transport occurs according to the “alternating access” model. rnAdditionally, the function of the putative transporter YfcC was investigated. The gene yfcC was co-transcribed with key genes of the acetate metabolism. Its deletion mutants showed a strain specific defect in growth on acetate and transport of acetate.rn