Induktion und Analyse spezifischer Immunantworten nach intranodaler Immunisierung mit RNA im murinen Modell

Die Wirksamkeit einer Vakzine ist von vielen Parametern abhängig. Dazu gehören unter anderen: das ausgewählte Antigen, die Formulation in der das Antigen benutzt wird sowie die Applikationsroute. Antigen-kodierende Ribonukleinsäuren (RNA) gilt heutzutage als eine sichere und effiziente Alternative zu traditionellen Impfstoff-Formulierungen, wie Peptiden, rekombinanten Proteinen, viralen Systemen oder DNA basierten Impfstoffen. Bezüglich des Applikationsortes repräsentiert der Lymphknoten ein optimales Milieu für die Interaktion zwischen antigenpräsentierenden Zellen und T-Zellen. Vor diesem Hintergrund war die Zielsetzung dieser Arbeit, ein auf direktem in vivo Transfer von Antigen-kodierender in vitro transkribierter RNA (IVT-RNA) basierendes Impfverfahren zu entwickeln, zu charakterisieren und auf seine anti-tumorale Wirksamkeit zu testen. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass dendritische Zellen (DCs) in vitro hocheffizient mit IVT-RNA transfiziert werden können und eine hohe stimulatorische Kapazität besitzen. Durch Sequenzmodifikation der IVT-RNA konnten wir die Transkriptstabilität und Translationseffizienz erhöhen was zu einer Steigerung der stimulatorischen Kapazität in vivo führte. Darüber hinaus untersuchten wir die Auswirkung der Insertion eines Signalpeptides 5’ sowie einer C-terminalen transmembran- und zytosolischen-Domäne eines MHC-Klasse-I-Moleküls am 3’ der Antigen-kodierenden Sequenz auf die Effizienz der MHC-Klasse-I und -II Präsentation. Wir konnten in vitro und in vivo nachweisen, dass diese Modifikation zu einer gesteigerten, simultanen Stimulation von antigenspezifischen CD4+ und CD8+ T-Zellen führt. Auf der Basis der optimierten Vektorkassetten etablierten wir die intranodale (i.n.) Transfektion von antigenpräsentierenden Zellen in der Maus. Dazu nutzten wir verschiedene Reportersysteme (eGFP-RNA, fluoreszensmarkierte RNA) und konnten zeigen, dass die intranodale Applikation von IVT-RNA zu selektiven Transfektion und Maturation lymphknotenresidenter DCs führt. Zur Untersuchung der immunologischen Effekte wurden in erster Linie auf Influenza-Hemagglutinin-A und Ovalbumin basierende Modellantigensysteme verwendet. Beide Antigene wurden als Antigen-MHC-Fusionskonstrukte genutzt. Als Responderzellen wurden TCR-transgene Lymphozyten verwendet, die MHC-Klasse-I oder -Klasse-II restringierte Epitope des Influenza-Hemagglutinin-A bzw. des Ovalbumin-Proteins erkennen. Wir konnten in vivo zeigen, dass die intranodale Immunisierung mit IVT-RNA zu einer effizienten Stimulation und Expansion von antigenspezifischen CD4+ und CD8+ T-Zellen in einer dosisabhängigen Weise führt. Funktionell konnte gezeigt werden, dass diese T-Zellen Zytokine sezernieren und zur Zytolyse befähigt sind. Wir waren in der Lage durch repetitive i.n. RNA Immunisierung ein ‚Priming’ CD8+ T-Zellen in naiven Mäusen sowohl gegen virale als auch gegen Tumor assoziierte Antigene zu erreichen. Die geprimten T-Zellen waren befähigt eine zytolytische Aktivität gegen mit spezifischem Peptid beladene Targetzellen zu generieren. Darüber hinaus waren wir in der Lage Gedächtnisszellen expandieren zu können. Abschließend konnten wir in Tumormodellen sowohl in prophylaktischen als auch in therapeutischen Experimenten zeigen dass die i.n. RNA Vakzination die Potenz zur Induktion einer anti-tumoralen Immunität besitzt.

Analyse der Transmembran-Agrin-abhängigen Signalkaskade in auswachsenden Axonen des zentralen Nervensystems

Die Entdeckung einer Transmembranform des Proteoglykans Agrin führte zu der Hypothese, dass TM-Agrin ein Rezeptor oder Korezeptor mit signaltransduzierenden Eigenschaften sein könnte. Die durch Antikörper simulierte Ligandenbindung an TM-Agrin resultiert in der Bildung von zahlreichen Ausläufern sowohl auf ZNS als auch auf PNS Axonen und Dendriten und unterstützt diese Hypothese. Übereinstimmend mit diesen Ergebnissen führt die Überexpression von TM-Agrin in ZNS Neuronen ebenfalls zur Bildung von zahlreichen Ausläufern, wohingegen die Unterdrückung der TM-Agrin Expression durch siRNA die Anzahl der Ausläufer stark reduziert. Der Mechanismus der durch TM-Agrin induzierten Bildung von Ausläufern ist jedoch unbekannt. Ziel der Dissertation war es deshalb, die durch TM-Agrin induzierte Signalkaskade zu untersuchen. Mit Hilfe von biochemischen, immunozytochemischen und pharmakologischen Unter-suchungen konnte gezeigt werden, dass sich TM-Agrin auf auswachsenden Axonen und nach Überexpression in nicht-neuronalen Zellen in lipid rafts anreichert und das lipid rafts sowohl für die Bildung als auch für die Aufrechterhaltung der Ausläufer notwendig sind. Die durch polyklonale Antikörper induzierte Bildung von Ausläufern kann sowohl durch die Inhibierung der Src-Kinase Fyn, welche in lipid rafts lokalisiert ist, als auch der 44/42 MAPK gehemmt werden. Zudem führt die Aggregation von TM-Agrin durch polyklonale Antikörper zu einer erhöhten Aktivität der Fyn- und 44/42 MAP-Kinase. Im Gegensatz dazu hat eine Inhibierung der PI3-Kinase keine Auswirkungen auf die Bildung der Ausläufer. Der intrazelluläre, sekundäre Botenstoff cGMP, nicht aber cAMP, fördert die Bildung von Ausläufern. Die konzentrationsabhängige Blockierung des Coxsackie-Adenovirus-Rezeptors (CAR) führt zu einer Hemmung der Ausläuferbildung. Ferner interagiert CAR im Zentralnervensystem während der Phase des aktiven axonalen Wachstums mit TM-Agrin und induziert nach Überexpression in neuronalen und nicht-neuronalen Zellen die Bildung von Ausläufern. In der vorliegenden Arbeit konnten somit Teilabschnitte der durch TM-Agrin induzierten Signalkaskade entschlüsselt werden.

Regulation der BDNF-Expression in Endothelzellen

Das Neurotrophin BDNF ist ein protektiver Faktor, der das Wachstum, die Differenzierung und das Überleben neuronaler Zellen fördert. Neben der neuronalen Expression wird BDNF auch peripher exprimiert, so auch in Endothelzellen. Dort stimuliert BDNF die Angiogenese und fördert das Endothelzellüberleben. Eine Regulation der BDNF-Expression unter pathologischen Bedingungen wie Epilepsie, M. Alzheimer, M. Parkinson, Depression und Ischämie ist bereits mehrfach beschrieben worden. Literaturdaten zeigen veränderte BDNF-Expressionen unter pathologischen Bedingungen zeitgleich mit einem erhöhten Spiegel des Tumornekrosefaktors (TNF-a) bzw. einer Aktivierung der Proteinkinase C (PKC). Ob ein erhöhter TNF-a-Spiegel bzw. die Aktivierung der PKC Ursache der veränderten BDNF-Expression ist, ist bisher noch nicht bekannt. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass sowohl TNF-a als auch eine Aktivierung der PKC in peripheren Endothelzellen die BDNF-Expression konzentrations- und zeitabhängig reduziert. Im Fall von TNF-a wird diese Reduktion über den TNF-a-Rezeptor 1 (TNFR1) vermittelt und auf dem Niveau der Transkription reguliert. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass BDNF die Angiogenese-Aktivität von humanen Umbilikalvenen-Endothelzellen (HUVEC) in Abhängigkeit der BDNF-Rezeptoren TrkB und p75NTR stimuliert. TNF-a hingegen reduziert die Angiogenese in HUVEC. Bei der Regulation der BDNF-Expression durch den PKC-aktivierenden Phorbolester Phorbol-12-Myristat-13-Acetat (PMA) konnte eine Beteiligung der PKC-Isoformen d gezeigt werden. Die Verminderung der BDNF-Expression durch PKC-Aktivierung konnte durch Inhibitoren der PKC d aufgehoben werden. PMA hatte keine destabilisierende Wirkung auf die BDNF-mRNA. Auch hier wird BDNF durch PMA auf dem Niveau der Transkription reguliert. Weiterhin ist bisher eine pharmakologische Regulation der BDNF-Expression noch nicht näher untersucht worden. Erstmalig konnte eine Wirkung des b1-Adrenorezeptorblockers Nebivolol auf die BDNF-mRNA-Expression beobachtet werden. Nebivolol erhöht die BDNF-Expression in zerebralen Endothelzellen in vitro und im Mäuseherzen in vivo. Hierbei handelt es sich um eine substanzspezifische Wirkung von Nebivolol, die NO-unabhängig verläuft und nicht über den b3-Adrenozeptor vermittelt wird. Teile der klinisch beobachteten protektiven Wirkungen von Nebivolol könnten auf eine erhöhte BDNF-Expression zurückgeführt werden.

Untersuchung der Bindung des humanen Papillomvirus HPV16 an Heparansulfate der Zelloberfläche

In 99,7% aller Zervixkarzinome kann die DNA humaner Papillomviren (HPV) nachgewiesen werden, die somit den Hauptauslöser für eine der häufigsten Krebserkrankungen bei Frauen weltweit darstellen. HPV16 ist verantwortlich für etwa 50% aller Zervixkarzinome. Für die Infektion von Zellen mit HPV16 ist die Interaktion mit Heparansulfatproteoglykanen der Zelloberfläche essentiell. Um Aminosäuren auf der Oberfläche des majoren Kapsidproteins L1 von HPV16 zu identifizieren, die zu dieser Interaktion beitragen, wurden im Rahmen dieser Arbeit zahlreiche Punktmutanten hergestellt und analysiert. Der Austausch der drei Lysine K278, K356 und K361 zu Alaninen führte zu signifikant verminderter Zell-, Heparin- und Heparansulfatbindung, die noch weiter reduziert wurde, wenn zwei oder drei der Lysine gleichzeitig mutiert waren. Auch die Infektiosität der mutanten Pseudovirionen war stark beeinträchtigt, die Trippelmutante zeigte nur noch 5% Infektiosität. Diese Ergebnisse demonstrieren, dass die drei Lysine gemeinsam die Bindestelle für Heparansulfate bilden. Ihr Austausch zu Argininen beeinflusste die Infektiosität der Partikel hingegen nicht, was bestätigt, dass die Interaktion mit Heparansulfaten von der positiven Ladungsdichte abhängt und nicht sequenzspezifisch ist. Die drei Lysine befinden sich auf der Spitze des HPV16-Kapsomers in einer flachen Tasche, die aufgrund ihrer Struktur bereits früher als potentielle Rezeptorbindestelle vorgeschlagen wurde. Fab-Fragmente des bindungsneutralisierenden Antikörpers H16.56E, dessen Epitop in direkter Nachbarschaft der Lysine liegt, inhibierten die heparansulfatvermittelte Zellbindung viraler Partikel. Auch Epitope anderer bindungsneutralisierender Antikörper befinden sich in der Nähe. Dies untermauert die Hypothese, dass die Lysine K278, K356 und K361 die Heparansulfatbindestelle von HPV16 bilden. Der Austausch von Threoninen, die genau zwischen den Lysinen liegen, hatte keine Auswirkung auf Bindung der Partikel und Infektiosität. Sie könnten jedoch durch die Bildung von Wasserstoffbrücken die Bindung an Heparansulfat stabilisieren. Die Bedeutung der Lysine K278, K356 und K361 bei der primären Interaktion von HPV16 mit Heparansulfaten konnte durch die Computersimulation der Interaktion der Virusoberfläche mit einem Heparinmolekül bestätigt werden. Des Weiteren konnten Anforderungen ermittelt werden, die eine solche Interaktion an das Heparinmolekül stellt. Weiterhin zeigten die Ergebnisse dieser Arbeit, dass basische Aminosäuren in der interkapsomeren Grube nicht an der primären Zellbindung an Heparansulfate beteiligt zu sein scheinen, aber eine Rolle bei sekundären Interaktionen mit der Zelloberfläche spielen könnten.

Rolle von NFATc2 in einem murinen Asthmamodell

Nuclear factor of activated T cells (NFAT) ist eine Familie der Transkriptionsfaktoren, welche eine wichtige Rolle bei der Regulation der T-Zellvermittelten Signalkaskade in der Lymphozytenpopulation spielt. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass Nuclear Factor of Activated T cells-2 (NFATc2) defiziente Mäuse einen erhöhten Atemwegswiderstand, einen pathologische Veränderung der Lunge und einen erhöhten IgE Spiegel im Vergleich zu den Wildtypen vorweisen. Die NFATc2 Defizienz konnte ebenfalls sowohl mit einer erhöhten Anzahl an Th2 und Th17 Zellen, die eine erhöhte Proliferation vorweisen, als auch einer erniedrigten Anzahl an CD8+ CD122- T-Zellen, die geringere Mengen an IFN-g produzieren, in Verbindung gebracht werden. Die aus den NFATc2(-/-) Mäusen isolierten CD4+ T-Zellen zeigen im Vergleich zu denen der Wildtypen neben der erhöhten Proliferation einen vermehrte Aktivierung (CD4higCD44highCD69high). Weiterhin konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass in Anwesenheit eines Allergens, die NFATc2(-/-) Mäuse eine erhöhte Anzahl an regulatorischen T-Zellen (CD4+CD25+Foxp3+GITR++) in der Lunge vorweisen, die wiederum die Effektorzellen in diesen hemmen. Ein Grund für die geringere Freisetzung an IFN-g durch die CD8+ T-Zellen in den NFATc2 defizienten Mäusen ist eine erhöhte Subpopulation von CD8+CD122+ (IL-2Rb Kette) CD127hi (IL-7Ra Kette) „long-lived memory Zellen“ in den NFATc2(-/-) Mäusen. Diese besitzen einen regulatorischen Effekt, so dass immundefiziente SCID Mäuse, die in einem adoptiven Transfer mit OVA-spezifischen CD8+ und CD4+ T-Zellen, welchen aus NFATc2(-/-) Mäuse isoliert werden, behandelt wurden, eine erhöhten Atemwegswiderstand, eine erhöhte IL-17 und eine erniedrigte IFN-g Produktion vorweisen. Eine Depletion der memory CD8+CD122+IL-7Rhigh T-Zellen hebt dagegen die verringerte IFN-g Produktion der CD8+CD122- T-Zellen auf und führt zu einer Erniedrigung des Atemwegswiderstandes in einem SCID Model Zusammenfassend zeigen unsere Untersuchungen, dass sowohl die IFN-g Produktion der CD8+ Effektor T-Zellen als auch die Anzahl an CD4+CD25+Foxp3+GITR++ regulatorischen T-Zellen die Entwicklung der Th2 und Th17 als auch die Höhe des Atemwegswiderstandes unterdrückt.

Expression und Funktion der Lyn Kinase in Oligodendrozyten

Die Bildung, Aufrechterhaltung und die Funktionalität von Oligodendrozyten, den myelinisierenden Zellen des ZNS, bedarf einer präzisen Regulation von Ereignissen wie Migration, Proliferation und Differenzierung. Die Src-Kinasen spielen in vielen Signalkaskaden eine zentrale Rolle. In murinen Oligodendrozyten werden die beiden Src-Kinasen Fyn und Lyn exprimiert, diese Arbeit konzentriert sich auf die Analyse der Lyn Kinase. Es konnte die Expression von Lyn in Oligodendrozyten und Myelin in vitro und in vivo bestätigen werden, sowie die Lokalisation innerhalb und außerhalb von rafts. Je älter die Mäuse, desto weniger Lyn wird in Myelin exprimiert und desto stärker ist das verbleibende Lyn in den rafts lokalisiert. Die Aktivität von Lyn ist im Myelin 12-Tage alter Mäuse am höchsten. Synchronisation des Zellzyklus in Oli-neu Zellen zeigte eine zyklische Expression von Lyn. Transfektion aktiver und inaktiver Konstrukte machte deutlich, dass eine Lyn Aktivität die Zellausläufer Bildung, sowie die Differenzierung der Zelle, hemmt. Es konnte eine Assoziation der GluRB/C Untereinheit des AMPA Rezeptors mit Lyn nachgewiesen werden. Stimulierung des AMPA-Rezeptors mit Glutamat führte zu einer Aktivierung der Lyn Kinase und daraus resultierend, zu einer Inhibierung der Zelldifferenzierung. Welche biologische Relevanz diese Ergebnisse haben könnten, wurde in drei Hypothesen festgehalten. Zum einen könnte die Lyn Kinase den zeitlichen Übergang von Proliferation und Differenzierung in Oligodendrozyten regulieren und zwar sowohl in perinatalen oligodendroglialen Vorläuferzellen, als auch, unter besonderen Umständen, in adulten oligodendroglialen Vorläuferzellen. Des Weiteren könnte die Lyn Kinase auch eine Rolle in der Neuron-Glia-Synapsenbildung spielen. Weitere Versuche, insbesondere in vivo, müssen folgen, um diese Hypothesen zu bestätigen oder zu widerlegen.

The role of EBI-3 in a murine model of lung metastases of melanoma

In dieser Arbeit wurde die Rolle des Epstein-Barr Virus induzierten Gens 3 in einem Mausmodel des durch B16-F10 Zellen hervorgerufenen metastasierenden Melanoms untersucht. Das von aktivierten antigenpräsentierenden Zellen exprimierte EBI-3 gehört zur Familie der löslichen Typ 1 Zytokinrezeptoren, weist eine hohe Homologie zur p40 Untereinheit des IL-12 auf und bildet zusammen mit p28 das IL-27. Die intravenöse Injektion der B16-F10 Zelllinie führte zu einer signifikanten Erniedrigung der Tumormetastasen in den EBI-3 defizienten Lungen sowie zu einer höheren Lebenserwartung dieser Mäuse im Vergleich zu den B6 Wildtypen. Darüber hinaus habe ich in den EBI-3 defizienten Mäusen eine verminderte VCAM-1 Expression auf den Endothelzellen der Lunge gefunden während Änderungen in der VEGF Expression nicht detektiert wurden. Der immunologische Hintergrund, der diesen therapeutischen Effekt hervorrief, konnte durch die T-Zellaktivierung durch die kürzlich neu beschriebene DC Population, welche Interferon-produzierende Killer Dendritische Zellen genannt werden (IK-DC), die zusätzlich von aktivierten und maturierten klassischen DCs unterstützt wurden, erklärt werden. IK-DCs von EBI-3 defizienten Mäusen produzierten höhere Mengen an IFN-g während die klassischen DCs MHC und co-stimulatorische Moleküle exprimierten, welche die Sekretion von IL-12 initiierten. Das Zusammenspiel der genannten Faktoren induzierte eine verstärkte CD4 und CD8 T-Zellantwort in den Lungen dieser Mäuse. Dies wiederum resultierte im TNF- und TRAIL abhängigen programmierten Zelltod der B16-F10 Melanomzellen in den Lungen der EBI-3 defizienten Mäuse, wohingegen sowohl weitere anti-apoptotische Mechanismen als auch T regulatorische Zellen keinen Einfluss auf die in den EBI-3 defizienten Mäusen beobachtete Tumorabwehr zu spielen scheint. Schlussendlich konnten EBI-3 defiziente CD8+ T-Zellen, welche zuvor mit Tumorantigen geprimed wurden, adoptiv in B6 Wildtypmäuse transferiert werden, was zeigte, dass diese Zellen in der Lage sind, die Tumormasse in den Empfängermäusen signifikant zu verringern. Zusammengefasst, demonstrieren diese Daten, dass das Blockieren von EBI-3 im metastasierenden Melanom ein vielversprechender Angriffspunkt in der Tumortherapie darstellt.

Immunevasion des murinen Cytomegalovirus: Regulatoren der MHC-Klasse-I vermittelten Antigenpräsentation

Zu den Immunevasionsmechanismen des murinen Cytomegalovirus, die sich im Laufe der Koevolution von Virus und Wirt entwickelt haben, gehört die Interferenz von drei viralen Regulatoren mit der Antigenpräsentation über MHC-Klasse-I-Moleküle, wodurch die Aktivierung von zytotoxischen CD8 T-Zellen beeinflusst wird: Während m152/gp40 peptidbeladene MHC-Klasse-I-Komplexe im cis-Golgi-Kompartiment akkumuliert, führt m06/gp48 diese Komplexe der lysosomalen Degradation zu. Im Gegensatz dazu vermittelt m04/gp34 deren Transport an die Zelloberfläche, wurde in der Literatur bisher aber trotzdem als Inhibitor der CD8 T-Zellaktivierung beschrieben. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, den Einfluss dieser viralen Proteine auf die Peptidpräsentation bzw. die T-Zellaktivierung zu untersuchen. Dazu wurde ein Set von Viren verwendet, das neben mCMV-WT aus mCMV-Deletionsmutanten besteht, die jedes der regulatorischen Proteine einzeln bzw. in allen möglichen Kombinationen exprimieren, einschließlich einer Mutante, die keines der Proteine besitzt. Entgegen der bisher gültigen Annahme konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass m04/gp34 die Antigenpräsentation nicht inhibiert. Wird es allein exprimiert, bleibt die T-Zellaktivierung unbeeinflusst. Wird es zusammen mit m152/gp40 exprimiert, stellt es die T-Zellaktivierung wieder her, indem es den herunter regulierenden Effekt von m152/gp40 antagonisiert. Dieser positiv regulierende Effekt von m04/gp34 wird wiederum durch m06/gp48 aufgehoben. Es konnte ebenfalls gezeigt werden, wie die verschiedenen Effekte dieser Virusproteine in vivo das Überleben im infizierten Wirt steuern. So wird im adoptiven Transfermodell die Infektion mit der Deletionsmutante, die m152/gp40 alleine exprimiert, schlechter kontrolliert als die Infektion mit der m152/gp40 und m04/gp34 exprimierenden Mutante. Dieser die CD8 T-Zellkontrolle verbessernde Effekt von m04/gp34 wird durch m06/gp48 wieder aufgehoben. Dass ein viraler Erreger nicht nur negative Regulatoren der Antigenpräsentation exprimiert, sondern auch einen positiven Regulator, der den Effekt eines negativen Regulators wieder aufhebt, ist in der Literatur beispiellos. Durch differentielle Expression dieser Regulatoren eröffnet sich damit dem Virus die Möglichkeit, die Antigenpräsentation gezielt zu modulieren.

Verifikation der Niederschlagsvorhersage für Deutschland von 2001 - 2004

Die Verifikation numerischer Modelle ist für die Verbesserung der Quantitativen Niederschlagsvorhersage (QNV) unverzichtbar. Ziel der vorliegenden Arbeit ist die Entwicklung von neuen Methoden zur Verifikation der Niederschlagsvorhersagen aus dem regionalen Modell der MeteoSchweiz (COSMO-aLMo) und des Globalmodells des Europäischen Zentrums für Mittelfristvorhersage (engl.: ECMWF). Zu diesem Zweck wurde ein neuartiger Beobachtungsdatensatz für Deutschland mit stündlicher Auflösung erzeugt und angewandt. Für die Bewertung der Modellvorhersagen wurde das neue Qualitätsmaß „SAL“ entwickelt. Der neuartige, zeitlich und räumlich hoch-aufgelöste Beobachtungsdatensatz für Deutschland wird mit der während MAP (engl.: Mesoscale Alpine Program) entwickelten Disaggregierungsmethode erstellt. Die Idee dabei ist, die zeitlich hohe Auflösung der Radardaten (stündlich) mit der Genauigkeit der Niederschlagsmenge aus Stationsmessungen (im Rahmen der Messfehler) zu kombinieren. Dieser disaggregierte Datensatz bietet neue Möglichkeiten für die quantitative Verifikation der Niederschlagsvorhersage. Erstmalig wurde eine flächendeckende Analyse des Tagesgangs des Niederschlags durchgeführt. Dabei zeigte sich, dass im Winter kein Tagesgang existiert und dies vom COSMO-aLMo gut wiedergegeben wird. Im Sommer dagegen findet sich sowohl im disaggregierten Datensatz als auch im COSMO-aLMo ein deutlicher Tagesgang, wobei der maximale Niederschlag im COSMO-aLMo zu früh zwischen 11-14 UTC im Vergleich zu 15-20 UTC in den Beobachtungen einsetzt und deutlich um das 1.5-fache überschätzt wird. Ein neues Qualitätsmaß wurde entwickelt, da herkömmliche, gitterpunkt-basierte Fehlermaße nicht mehr der Modellentwicklung Rechnung tragen. SAL besteht aus drei unabhängigen Komponenten und basiert auf der Identifikation von Niederschlagsobjekten (schwellwertabhängig) innerhalb eines Gebietes (z.B. eines Flusseinzugsgebietes). Berechnet werden Unterschiede der Niederschlagsfelder zwischen Modell und Beobachtungen hinsichtlich Struktur (S), Amplitude (A) und Ort (L) im Gebiet. SAL wurde anhand idealisierter und realer Beispiele ausführlich getestet. SAL erkennt und bestätigt bekannte Modelldefizite wie das Tagesgang-Problem oder die Simulation zu vieler relativ schwacher Niederschlagsereignisse. Es bietet zusätzlichen Einblick in die Charakteristiken der Fehler, z.B. ob es sich mehr um Fehler in der Amplitude, der Verschiebung eines Niederschlagsfeldes oder der Struktur (z.B. stratiform oder kleinskalig konvektiv) handelt. Mit SAL wurden Tages- und Stundensummen des COSMO-aLMo und des ECMWF-Modells verifiziert. SAL zeigt im statistischen Sinne speziell für stärkere (und damit für die Gesellschaft relevante Niederschlagsereignisse) eine im Vergleich zu schwachen Niederschlägen gute Qualität der Vorhersagen des COSMO-aLMo. Im Vergleich der beiden Modelle konnte gezeigt werden, dass im Globalmodell flächigere Niederschläge und damit größere Objekte vorhergesagt werden. Das COSMO-aLMo zeigt deutlich realistischere Niederschlagsstrukturen. Diese Tatsache ist aufgrund der Auflösung der Modelle nicht überraschend, konnte allerdings nicht mit herkömmlichen Fehlermaßen gezeigt werden. Die im Rahmen dieser Arbeit entwickelten Methoden sind sehr nützlich für die Verifikation der QNV zeitlich und räumlich hoch-aufgelöster Modelle. Die Verwendung des disaggregierten Datensatzes aus Beobachtungen sowie SAL als Qualitätsmaß liefern neue Einblicke in die QNV und lassen angemessenere Aussagen über die Qualität von Niederschlagsvorhersagen zu. Zukünftige Anwendungsmöglichkeiten für SAL gibt es hinsichtlich der Verifikation der neuen Generation von numerischen Wettervorhersagemodellen, die den Lebenszyklus hochreichender konvektiver Zellen explizit simulieren.

Die Leber als Latenzort des murinen Cytomegalovirus: Identifizierung und Charakterisierung des latent infizierten Zelltyps

Die Untersuchungen der murinen Cytomegalovirus (mCMV) Infektion im BALB/c Mausmodell konzentrierten sich bislang auf die Lunge, da diese einen Hauptort der mCMV Latenz darstellt. Da latentes CMV auch häufig durch Lebertransplantationen übertragen wird, wurde in dieser Arbeit die Leber als ein weiteres medizinisch relevantes Organ der CMV Latenz und Reaktivierung untersucht. Um zunächst die zellulären Orte der mCMV Latenz in der Leber zu ermitteln, wurden verschiedengeschlechtliche Knochenmarktransplantationen (KMT) mit männlichen tdy-positiven Spendern und weiblichen, tdy-negativen Empfängern, mit anschließender mCMV Infektion durchgeführt, um latent infizierte Mäuse mit geschlechtschromosomalem Chimärismus zu generieren. Diese Chimären erlaubten eine Unterscheidung zwischen tdy-positiven Zellen hämatopoetischen Ursprungs und tdy-negativen stromalen und parenchymalen Gewebszellen. Die Separation von Leberzellen der Chimären mittels zentrifugaler Elutriation und anschließender DNA Quantifizierung viraler und zellulärer Genome durch eine quantitative real-time PCR ergab einen ersten Hinweis, dass Endothelzellen ein zellulärer Ort der mCMV Latenz sind. Die darauf folgende immunomagnetische Zelltrennung lokalisierte latente virale DNA in der CD31-positiven Zellfraktion. Die Koexpression von CD31 mit dem endothelzellspezifischen Oberflächenmarker ME-9F1 identifizierte die sinusoidalen Endothelzellen der Leber (LSEC) als die Zellen, die latente virale DNA beherbergen. In den zytofluorometrisch aufgereinigten CD31+/ME-9F1+ LSEC waren bei gleichzeitigem Rückgang der männlichen tdy Markergene virale Genome angereichert, was darauf hinwies, dass Zellen, die virale DNA enthalten, vom Knochenmark-Empfänger stammen. Durch zytofluorometrische Analysen isolierter LSEC konnte eine vom Spender abstammende Subpopulation MHCII+/CD11b+ LSEC identifiziert werden. Anschließende Quantifizierungen viraler DNA aus latent infizierten Mäusen detektierten eine Abnahme viraler Genome mit zunehmender Menge an tdy-positiven Zellen, was beweist, dass MHCII+/CD11b+ LSEC keinen Ort der mCMV Latenz darstellen. Die limiting dilution Untersuchungen der isolierten latent infizierten LSEC ergaben eine Frequenz von einer latent infizierten Zelle unter ~1,9x104 LSEC und eine Anzahl von 7 bis 19 viralen Genomen pro latent infizierter Zelle. Nach 24 Stunden Kultivierung der LSEC konnte mittels quantitativer real-time RT-PCR mit Gesamt-RNA aus LSEC ein Anstieg der Genexpression der immediate early Gene ie1 und ie3 sowie eine Induktion des early Gens e1 gezeigt werden. Eine Erhöhung der transkriptionellen Reaktivierung durch die Inkubation der LSEC mit unterschiedlichen HDAC Inhibitoren konnte allerdings nicht erzielt werden, da sowohl die Menge der isolierten RNA aus behandelten Kulturen, als auch die Anzahl viraler Transkripte im Vergleich zu den unbehandelten Kulturen erniedrigt war. Aufgrund der kurzen Lebensdauer isolierter LSEC in vitro konnte durch Kokultivierungen latent infizierter LSEC zusammen mit murinen embryonalen Fibroblasten keine Virusreaktivierung induziert werden. Im Gegensatz dazu wurden durch den Transfer gereinigter ME-9F1+/CD31+ LSEC aus latent infizierten Spendern in immunsupprimierte Empfänger virale Rekurrenzen in Lungenexplantatkulturen des Rezipienten detektiert. Damit konnten LSEC eindeutig als zellulärer Ort von mCMV Latenz und Reaktivierung in der Leber identifiziert werden.

Konditionale Mutagenese von Desmoglein 2 in der Maus

Desmosomen sind hoch organisierte interzelluläre Verbindungen, die Zellverbänden eine mechanische Stabilität verleihen. Die Intermediärfilamentnetzwerke benachbarter Zellen werden mit Hilfe der desmosomalen Cadherine vom Desmoglein- und Desmocollin-Typ miteinander verknüpft. Diese Glykoproteine interagieren miteinander im Interzellularspalt zwischen benachbarten Zellen und stellen mit ihren zytoplasmatischen Domänen einen Ankerpunkt für desmosomale Brückenproteine dar, an welche wiederum die Proteine des Intermediärfilament-Zytoskeletts binden. Bei der Maus spielt das desmosomale Cadherin Desmoglein 2 (DSG2) bereits in frühen Stadien der Embryogenese eine entscheidende Rolle. Homozygote DSG2-Knockout-Mäuse sterben bereits vor der Implantation des Embryos ab. Im adulten Tier ist Dsg2 die am weitesten verbreitete Isoform, in Darm, Leber und Herzmuskel wird es zudem exklusiv exprimiert. Ziel dieser Arbeit war es, die Bedeutung von Dsg2 in differenzierten Gewebeverbänden adulter Tiere zu untersuchen. Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurden mehrere transgene Mauslinien hergestellt, in denen mit Hilfe des Cre/loxP-Systems eine Deletion im DSG2-Gen konditional und gewebsspezifisch induziert werden konnte. Dazu wurden zuerst zwei loxP-Sequenzen und eine mit zwei FRT-Stellen flankierte Neomyzinresistenzgen-Kassette in das DSG2-Gen von embryonalen Stammzellen durch homologe Rekombination eines Targeting-Konstrukts inseriert. Diese Zellen wurden in Blastozysten injiziert und Mauslinien hergestellt. Mit Hilfe der Flpe-Rekombinase wurde anschließend die Resistenzenzgen-Kassette entfernt. Diese Stämme wurden mit Mäusen verpaart, die eine induzierbare und gewebsspezifische Synthese der Cre-Rekombinase ermöglichen. Im Darmepithel und der Leber konnte eine gewebsspezifische Rekombination des DSG2-Gens induziert werden. Untersuchungen der DSG2-mRNA zeigten, dass die DSG2-Rekombination in der Darmschleimhaut nahezu vollständig erfolgte. Immunfluoreszenz-Analysen an Gewebsfragmenten induzierter Tiere mit Isotyp-spezifischen Antikörpern, die im Rahmen dieser Arbeit hergestellt worden waren, zeigten jedoch keine signifikanten Unterschiede der Desmosomenzahl und -verteilung. Daher wurden eGFP-Hybride des zu erwartenden mutierten Dsg2-Proteins in Zellen exprimiert und mit wildtypischem Dsg2 verglichen. Es konnte hinsichtlich der Verteilung und Morphologie der Desmosomen keine Unterschiede zwischen beiden Dsg2-Proteinen festgestellt werden. Der Dsg2-Mutante fehlen wichtige Proteinbereiche, die für die trans-Interaktion der extrazellulären Domäne verantwortlich sind, die Haupt-N-Glykosylierungsstelle, sowie eine der insgesamt vier Kalzium-Bindestellen. Dies sind Eigenschaften, von denen man bisher annahm, dass sie eine zentrale Bedeutung für die desmosomale Adhäsion besitzen. Weitere Experimente werden zeigen, inwieweit die hergestellte Dsg2-Mutante in „Stresssituationen“, wie sie z.B. bei Regenerationsvorgängen oder der Tumorgenese auftreten, zu veränderten adhäsiven Eigenschaften führt.

Regulation der Stress-aktivierten Proteinkinasen durch den gentoxischen Benzo[a]pyren-Metaboliten BPDE

Polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe (PAK) sind ubiquitäre Verschmutzungen der Umwelt und entstehen während der unvollständigen Verbrennung organischen Materials wie Holz, Kohle und Erdöl. Werden diese chemisch nicht reaktiven PAK in den Körper aufgenommen, durchlaufen sie eine Reihe von enzymatischen Umsetzungen, die unter der Bezeichnung Fremdstoffmetabolismus zusammengefasst werden. Die chemische Umsetzung des PAK und Prokarzinogens Benzo[a]pyren (B[a]P) führt u.a. zur Bildung des reaktiven Metaboliten B[a]P-7,8-dihydrodiol-9,10-epoxid (BPDE). BPDE ist stark elektrophil und kann auf Grund dieser Eigenschaft an nukleophile Makromoleküle wie Proteine und DNA binden. Die Bildung von BPDE-DNA-Addukten resultiert in der Entstehung von Mutationen und kann zur Tumorbildung führen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollte die Wirkung von BPDE als Modellsubstanz für gentoxische Agenzien auf intrazelluläre Signalkaskaden und die Konsequenzen der BPDE-Exposition bezüglich der Zellaktivität untersucht werden. Es konnte gezeigt werden, dass BPDE-Behandlung von Mausfibroblasten eine intrazelluläre Signalkaskade induziert, welche zur Aktivierung der Stressaktivierten Proteinkinasen (SAPK) JNK und p38 führt. An dieser Signalkaskade sind Src-ähnliche Kinasen beteiligt. BPDE-Behandlung führt in den untersuchten Mausfibroblasten zur Induktion von DNA-Einzelstrangbrüchen, deren Auftreten zeitlich mit der SAPK-Aktivierung korreliert. Die BPDEinduzierten DNA-Strangbrüche sind die Folge der Entfernung dieser Läsionen aus dem Genom durch die Nukleotidexzisionsreparatur (NER). Erkannt werden BPDE-DNA-Addukte durch die NERProteine XPA und XPC (Xeroderma Pigmentosum Komplementationsgruppe A und C). Nach der Erkennung von BPDE-DNA-Addukten kommt es zur Rekrutierung von Nukleasen, welche die vorliegende Läsion und umliegende Nukleotide aus dem Genom entfernen. In XPA- und XPCdefizienten Mausfibroblasten induziert BPDE daher keine DNA-Strangbrüche. Jedoch ist nur in XPCdefizienten Zellen, aber nicht in XPA-defizienten Zellen, die SAPK-Aktivierung drastisch reduziert. Behandlung von Mausfibroblasten mit Benzo[c]phenanthren-3,4-Diol-1,2-Epoxid, einem PAK, dessen DNA-Addukte schlecht durch NER-Faktoren erkannt und repariert werden, führt zu keiner SAPKAktivierung. Die Aktivierung von p38 und JNK scheint demnach abhängig zu sein von der Erkennung des primären DNA-Schadens. Die XPC-abhängige SAPK-Aktivierung schützt die Zellen vor BPDEabhängiger Toxizität, da sowohl XPC- als auch p38-defiziente Mausfibroblasten eine höhere Sensitivität gegenüber BPDE zeigen als korrespondierende Wildtypzellen. Zusamenfassend konnte in dieser Arbeit ein neuer Signalweg beschrieben werden, in dem DNASchäden, verursacht durch BPDE, über die XPC-abhängige DNA-Schadenserkennung, die Aktivierung der SAPK induziert. Diese Aktivierung der SAPK schützt vor BPDE-induzierter Toxizität.

Bedeutung der viralen IE4-Region für die Genexpression und Replikation des humanen Cytomegalovirus

Das humane Cytomegalovirus (HCMV) ist ein fakultativ-pathogener Erreger, der bei Patienten mit geschwächter oder unausgereifter Immunabwehr schwerwiegende Erkrankungen hervorrufen kann. Wie alle Herpesviren zeigt das HCMV eine streng koordinierte Expression viraler Gene, die in eine „sehr frühe-“ (IE), „frühe “ (E) und „späte-“ (L) Phase unterteilt werden kann. Die Produkte der IE-Gene IE1 und IE2 sind für die Expression der frühen Gene und somit für die Initiation der viralen DNA-Replikation entscheidend. Sie greifen gleichzeitig in den zellulären Stoffwechsel ein und schaffen damit optimale Vorraussetzungen für die virale Vermehrung. Zu Beginn dieser Arbeit war bekannt, dass HCMV in lytisch infizierten Zellen ein abundantes IE-Transkript von 5 kb (IE4-RNA) exprimierte, dessen Funktion bislang unklar war. Ältere Publikationen deuteten darauf hin, dass die IE4-Genregion an der Transformation eukaryonter Zellen beteiligt sein könnte. Neuere Arbeiten zeigten, dass es sich bei diesem IE4-Transkript um ein metabolisch stabiles Intron handelt. Im Rahmen dieser Arbeit sollte zunächst geklärt werden, ob die IE4-Genregion ein Protein kodiert. In der Folge sollten mit viralen Deletionsmutanten Hinweise auf die biologische Funktion des IE4-Bereichs erarbeitet werden. Durch Northern Blot Analysen und cDNA-Klonierungsexperimente konnte eine Reihe neuer Spleiß-Varianten der IE4-RNA identifiziert werden. Durch Sequenzanalysen wurde gezeigt, dass diese Transkripte keine längeren offenen Leserahmen enthalten. Zusammen mit bereits publizierten Erkenntnissen, kann aus diesen Ergebnissen mit hoher Wahrscheinlichkeit geschlossen werden, dass die IE4 Region nicht für ein Protein kodiert. Zur Analyse der biologischen Funktion der IE4-Region wurde das DNA-Genom des HCMV gezielt mutagenisiert. Eine phänotypische Analyse der entsprechenden Viren mittels Reportergen-Tests und quantitativer RealTime RT-PCR zeigte, dass einige der Mutanten eine verringerte Expression früher Gene aufwiesen, die mit einer Beeinträchtigung ihrer Replikationsfähigkeit in Fibroblastenkulturen korrelierte. Dabei war die Ausbildung eines Phänotyps jedoch von dem genetischen Hintergrund des verwendeten viralen Ausgangsstammes abhängig. Auffällig war, dass phänotypische Veränderungen nur bei solchen Mutanten sichtbar wurden, die auf der Grundlage des Laborstammes Ad169 des HCMV generiert worden waren. Die nachfolgende Analyse der Ausgangsstämme ergab deutliche Unterschiede in der IE-Genexpression. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen somit, dass die IE4-RNA mit hoher Wahrscheinlichkeit nicht für ein Protein kodiert, aber bei limitierender Expression der essentiellen Regulatoren IE1 und IE2 die frühe lytische Genexpression stimuliert. Die Ergebnisse dieser Arbeit stellen die Grundlage für nachfolgende Untersuchungen zur Aufklärung der molekularen Funktion der IE4-RNA im Rahmen der lytischen Infektion des HCMV dar.

Die Beteiligung von wildtypischer SOD1 an der Pathogenese der SOD1-vermittelten amyotrophen Lateralsklerose (ALS1)

Bei der amyotrophen Lateralsklerose 1 (ALS1) handelt es sich um eine altersabhängige Motoneuronenerkrankung, die durch Mutationen im Gen der Cu/Zn-Superoxid Dismutase (hSOD1mut) ausgelöst wird. Die toxischen Eigen¬schaften von hSOD1mut (z. B. Aggregations- oder oxidative Stress-Hypothese) und der Einfluss wildtypischer hSOD1 (hSOD1WT) auf den Krankheitsverlauf sind weithin ungeklärt. Das Ziel dieser Arbeit war es, die Auswirkungen von hSOD1mut-hSOD1WT-Heterodimeren im Vergleich zu mutanten Homodimeren auf die Pathogenese der ALS1 zu untersuchen. Nachdem gezeigt werden konnte, dass es in humanen Zellen in der Tat zu einer Bil¬dung hetero- und homodimerer mutanter hSOD1-Spezies kommt, wurden Dimerfusionsproteine aus zwei hSOD1-Monomeren generiert, die durch einen flexiblen Peptidlinker verbunden und C-terminal mit eGFP markiert waren. Neben hSOD1WT-WT wurden hSOD1mut-mut- und hSOD1mut-WT-Dimere mit vier verschiedenen hSOD1-Mu¬tanten untersucht. Die biochemische Charakterisierung zeigte, dass alle Dimere, die wildtyp-ähnliche hSOD1mut enthielten, eine Dismutaseaktivität aufwiesen. Im Gegensatz dazu war das Homodimer aus zwei metalldefizienten hSOD1G85R inaktiv, wobei interessanterweise hSOD1G85R mit hSOD1WT ein Dismutase-aktives Dimer bilden konnte. Sowohl in Zellkultursystemen als auch in einem C. elegans-Modell bildeten alle mutanten Homodimere vermehrt Aggregate im Vergleich zu den dazugehörigen Heterodimeren. Dieses Aggregationsverhalten korrelierte aber nicht mit der Toxizität der Dimerproteine in Überlebensassays und einer C. elegans Bewe¬gungs¬analyse. In diesen funktionellen Studien assoziierte die Toxizität der dimeren Fusionsproteine mit der enzy¬matischen Aktivität. In Übereinstimmung mit diesen Ergebnissen konnte gezeigt werden, dass hSOD1WT nicht in hSOD1mut-abhängigen Aggregaten vorkommt. Die Ergebnisse dieser Studie sprechen gegen die Aggregation als primäre toxische Eigen¬schaft der hSOD1mut und unterstützen die oxidative Stress-Hypothese. Dis¬mutase-inaktive hSOD1mut können eine untypische Enzymaktivität durch die Heterodimerisierung mit hSODWT erlangen, die auf diese Weise maßgeblich an der Pathogenese der ALS1 beteiligt sein könnte.

Zelluläre Kontrolle adulter Neurogenese - Expression und Funktion des VEGF-Rezeptor-1 (Flt-1) im adulten Säugerhirn

Neurale Stammzellen sind im adulten Säugerhirn in der Subventrikulären Zone (SVZ) der Lateralventrikel und dem Hippokampus lokalisiert. In der SVZ entstandene neurale Zellen migrieren entlang eines von Astrozyten umgebenen Pfades, dem Rostralmigratorischen Strom (RMS), zum Olfaktorischen Bulbus (OB), wo sie zu olfaktorischen Interneuronen differenzieren. Vaskuläre Wachstumsfaktoren, wie VEGF-A beeinflussen die adulte Neurogenese. Die vorliegende Arbeit beschreibt erstmalig detailliert die spezifische Expression des VEGF-Rezeptor-1 (VEGFR-1) in den Regionen olfaktorischer und hippokampaler Neurogenese des adulten ZNS. Die Ergebnisse zeigen, dass VEGFR-1 im adulten Hirn hauptsächlich in GFAP-positiven Zellen in der SVZ, dem RMS, dem OB, dem Corpus callosum und dem Hippokampus exprimiert ist. In vivo-Analysen transgener Mäuse (Flt-1TK-/-), denen die Signaltransduktionsdomäne des VEGFR-1 fehlt, demonstrieren hier erstmals eine Rolle des VEGFR-1 in adulter Neurogenese. Flt-1TK-/- weisen eine erhöhte Proliferation neuronaler Vorläuferzellen der SVZ auf. Im RMS ist jedoch 6 Tage nach BrdU-Administration die Anzahl markierter Zellen im Vergleich zum Wildtyp (wt) um 47,97% reduziert, ohne dass es zu einer Akkumulation in der SVZ kommt. Zusammen mit der in Kulturversuchen stark erhöhten Migrationsgeschwindigkeit von Neuroblasten der Flt-1TK-/- und einer verminderten Abwanderung von Zellen aus dem RMS ins Corpus callosum der Flt-1Tk-/-, weist dies auf eine gesteigerte Migration zum OB hin. Tatsächlich war der OB der Flt-1TK-/-, vor allem die Plexiform- und Periglomerulärzellschicht (PGL), signifikant vergrößert. Im OB der transgenen Tiere migrieren zudem signifikant mehr BrdU-markierte Zellen in die PGL. Dort differenzieren signifikant mehr Neurone als im wt. Subtypisierungen zeigen, zudem eine erhöhte Differenzierung in dopaminerge Interneurone in der PGL der Flt-1TK-/-. Im Gehirn Flt-1TK-/- war die Konzentration von VEGF-A erhöht. Intrazerebroventrikuläre Infusion von VEGF-A in wt-Tiere erbrachte den eindeutigen Nachweis, dass die Erhöhung der VEGF-A-Konzentration im Gehirn der Flt-1TK-/- ursächlich für die in diesen Tieren beobachtete Reduktion der BrdU-positiven Zellen im RMS ist. Dies ist gleichzeitig der erste Nachweis einer Wirkung von VEGF-A auf Neuroblasten im RMS in vivo unter physiologischen Bedingungen. Die erhöhte VEGF-A-Konzentration könnte auch den anderen hier dargelegten Effekten zugrunde liegen. VEGFR-1 ist somit ein regulatorischer Faktor für die adulte olfaktorische Neurogenese und spielt eine potentielle Rolle in der Differenzierung dopaminerger Interneurone.