A proteomic study of the effects of nutrient restriction in utero on postnatal metabolism

It is widely recognized that protein restriction in utero may cause metabolic and endocrine adaptations, which may be of benefit to the neonate on a short-term basis but may cause adverse long-term conditions such as obesity, Type 2 diabetes, metabolic syndrome, hypertension and cardiovascular diseases. Adequate foetal and early post natal nutrient and energy supply is therefore essential for adult animal health, performance and life span. In this project it was investigated the progressive adaptations of the hepatic proteome in male mink offspring exposed to either a low protein (FL) or an adequate protein (FA) diet in utero fed either on a low protein (LP) or on an adequate (AP) diet from weaning until sexual maturity. Specifically, the aim was to determine the metabolic adaptations at selected phases of the animal’s first annual cycle and establish the metabolic priorities occurring during those phases. The three different morphological stages studied during the first year of development included, end of bone growth at 4 months of age, maximal fat accretion at 6 months of age and sexual maturity at 12 months of age. A reference proteome of mink liver coming from these different animal groups were generated using 2D electrophoresis coupled to MALDI-TOF analysis and the way in which dietary treatment affect their proteome was established. Approximately 330 proteins were detected in the mink liver proteome. A total of 27 comparisons were carried out between all different animal groups which resulted in 20 differentially expressed proteins. An extensive survey was conducted towards the characterization of these proteins including their subcellular localization, the biological processes in which they are involved and their molecular functions. This characterization allowed the identification of proteins in various processes including the glycolysis and fatty acid metabolism. The detailed analysis of the different dietary treatment animal groups was indicative of differences in metabolism and also to changes associated with development in mink.

Práticas de preparação de uma tarefa de organização e tratamento de dados com características investigativas

Esta comunicação tem como objetivo discutir a preparação de uma tarefa de organização e tratamento de dados de características investigativas. Presta-se particular atenção aos aspetos valorizados pelos professores e os desafios com que se confrontam quando se envolvem neste tipo de trabalho. Trata-se de um estudo desenvolvido num contexto de trabalho de natureza colaborativa que segue uma metodologia de investigação interpretativa e qualitativa na modalidade de estudo de caso. Os resultados mostram que os professores valorizam tarefas de cunho investigativo, realizadas em contextos do quotidiano dos alunos, com recurso a dados reais recolhidos pelos próprios alunos, revelando a sua preocupação em construir tarefas com significado. Na preparação da tarefa, procuram antecipar possíveis resoluções dos alunos e prever modos de atuação para a sua condução, valorizando a apresentação de propostas por iniciativa dos alunos. Como principal desafio apontam o grau de incerteza com que são confrontados quando realizam este tipo de tarefas.

Comportamento in vitro de formulações lipossomais de um aminoglicosídeo com actividade anti-parasitária: citotoxicidade e interacção lipossoma-célula

Os sistemas de veiculação de fármacos, presentemente, apresentam-se como uma alternativa viável às terapias convencionais. De entre os diversos sistemas de transporte passíveis de associar substâncias farmacologicamente activas, destacam-se os de base lipídica, em particular, os lipossomas, os quais constituem um dos sistemas mais estudados e com maior sucesso, comprovado pelo número de produtos em fase clínica ou já aprovados para utilização em humanos. Os lipossomas são estruturas constituídas por membranas lipídicas organizadas em bicamadas, fechadas e concêntricas, que permitem a encapsulação de moléculas hidrofílicas no espaço interno aquoso e hidrofóbicas na bicamada lipídica. No presente trabalho, foram desenvolvidas metodologias com vista à encapsulação em lipossomas do aminoglicosídeo, a Paromomicina (PRM). Este fármaco está indicado para o tratamento de doenças infecciosas nomeadamente parasitárias e bacterianas. Algumas das principais desvantagens resultantes da sua utilização em clínica são, o reduzido tempo de circulação na corrente sanguínea, rápida excreção renal e consequentemente insuficiente concentração intracelular do fármaco. Como forma de ultrapassar algumas das desvantagens apresentadas, foram desenvolvidas formulações lipossomais de PRM com vista a melhorar o desempenho deste antibiótico. Para tal, foram preparadas e caracterizadas diversas formulações lipossomais de PRM com vista à selecção daquelas que apresentem maiores valores de eficácia de encapsulação (E.E.), e superior estabilidade. Com as formulações seleccionadas foram realizados estudos in vitro de interacção lipossoma-célula, utilizando uma linha celular humana monocítica leucémica, THP-1. De entre as formulações desenvolvidas e seleccionadas para os estudos in vitro de a formulação DPPC:DPPG, foi uma das que apresentou uma E.E. superior a 80% e valores de internalização celular superiores a 90%.

Sistemas nanoparticulados e a vetorização de fármacos no tratamento do cancro

O cancro é hoje em dia um dos principais fatores de morbilidade e mortalidade. No ano de 2010, o National Institute of Health estimou os custos associados ao cancro em cerca de 263,8 biliões de dólares. Desta forma, a investigação nesta área continua a procurar formas de otimizar os tratamentos, aliviando o sofrimento dos doentes e reduzindo os custos associados à doença. O tratamento do cancro tem evoluído no sentido de atingir uma maior seletividade para as células tumorais. As limitações associadas à quimioterapia com apenas um fármaco conduziram ao aparecimento de novas estratégias, nas quais se combinam diferentes terapêuticas, com diferentes mecanismos de ação, levando a um efeito sinergístico. Esta estratégia permite a administração de uma menor dose de cada fármaco, diminuindo assim os efeitos adversos. No entanto, existem limitações clínicas para estas terapêuticas convencionais relacionadas com as propriedades dos transportadores das membranas celulares, a baixa biodisponibilidade e a distribuição dos fármacos junto das células tumorais. A pesquisa de novas estratégias tornou-se uma necessidade para a obtenção de uma distribuição mais efetiva e especifica dos fármacos nas células tumorais. Assim, os nanossistemas foram extensamente estudados para aumentar a eficácia dos tratamentos. A nanotecnologia, através da encapsulação dos fármacos, permitiu melhorar os parâmetros farmacocinéticos dos fármacos, tendo ainda a vantagem de se poder fazer uma vetorização para as células tumorais, tendo por base o reconhecimento de recetores.

Testes com novos fármacos no tratamento do parasita de peixes Amyloodinium ocellatum

O Amyloodinium ocellatum é um parasita dinoflagelado que aparece em aquaculturas por todo o mundo, infectando as brânquias e o tegumento dos peixes. Esta parasita é particularmente relevante na aquacultura mediterrânica onde os surtos causam perdas consideráveis. Apesar de já terem sido experimentados vários tratamentos, nenhum deles se revelou efectivo na erradicação do parasita e ainda alguns dos químicos utilizados podem ter importantes efeitos nocivos sobre o ambiente. Deste modo, o objectivo deste estudo foi testar novos fármacos para impedir o desenvolvimento e/ou eliminar o parasita em peixes já infectados. Os fármacos utilizados neste estudo foram endoperóxidos, uma recente classe de antimaláricos. Na primeira parte deste estudo realizaram-se ensaios in vitro onde se testaram os efeitos de diferentes concentrações (0,1mM; 1 mM; 2mM e 2,5mM) dos fármacos NAD17, NAD19, LCD93 e LCD67A sobre a divisão dos tomontes. Às 24 e 48 horas de exposição a 0,1mM NAD19 e 1mM LCD93, os tomontes observados não tinham entrado em divisão. Na segunda parte realizou-se um ensaio in vivo no qual os fármacos foram administrados a juvenis de dourada (Sparus aurata) a uma concentração de 10μmol/kg através de tratamento oral. No ensaio in vivo avaliou-se o possível efeito profiláctico dos fármacos na infecção através da análise da abundância e prevalência do parasita, da eficácia dos fármacos e dos efeitos do parasita e do tratamento na fisiologia e no eixo do stress dos animais infectados através de análises enzimáticas e de parâmetros bioquímicos do sangue. As medições realizadas ao plasma sanguíneo e às brânquias de douradas com diferentes níveis de infecção de A. ocellatum revelaram que não existe diferença significativa entre os controlos e os endoperóxidos para a dose testada. Será necessário realizar mais ensaios para obter conclusões sobre o efeito dos endoperóxidos no controlo do parasita de peixes A. ocellatum.

In vitro blood-brain barrier models to predict the permeation of gene therapy vectors into the brain

A terapia génica tem-se revelado uma alternativa relevante no tratamento de doenças neurodegenerativas (DN). Contudo, a entrega de vetores para transferência génica no cérebro representa ainda um enorme desafio devido à presença da barreira hemato-encefálica (BHE). A BHE é uma interface dinâmica e seletiva entre o sangue e o cérebro, constituída pelas células endoteliais cerebrais, astrócitos e pericitos, desempenhando um importante papel na regulação da homeostasia cerebral. A BHE representa um dos maiores obstáculos no tratamento de DN, uma vez que esta barreira impede o transporte para o cérebro da maioria das moléculas terapêuticas, incluindo os vetores para terapia génica. Embora tenham sido desenvolvidos diferentes modelos in vitro da BHE de forma a avaliar o transporte de fármacos através da BHE, muito poucos foram criados com o intuito de testar a permeabilidade desta barreira a vetores de terapia génica. O presente trabalho teve como objetivo principal o desenvolvimento e a avaliação de modelos in vitro de BHE que permitam a investigação da capacidade dos vetores de terapia génica de penetrarem no cérebro. No nosso estudo, foram testados diferentes modelos in vitro de BHE em monocultura, constituídos por células endoteliais de rato ou murganho (RBE4 e bEnd3, respetivamente), e modelos de co-cultura, que combinam células endoteliais com células neuronais (Neuro2a) ou astrócitos primários, cultivados num sistema transwell. Para caraterizar estes modelos foram realizados testes de permeabilidade e de resistência elétrica transendotelial, bem como estudos baseados na técnica de PCR quantitativo e na imunocitoquímica das proteínas das junções intercelulares. Verificámos que os modelos baseados na cultura de células bEnd3 e células neuronais ou astrócitos apresentavam as melhores propriedades de barreira. Posteriormente foi avaliada nos modelos selecionados a penetração de um vetor não-viral que reconhecidamente tem a capacidade de atravessar in vivo a BHE: o peptídeo da glicoproteína do vírus da raiva (RGV-9r). Os siRNAs marcados com um fluoróforo e acoplados ao peptídeo RVG-9r foram capazes de penetrar eficientemente as células bEnd3, localizadas no lado luminal do insert, via endocitose mediada por recetores, e ainda de penetrar os astrócitos ou células neuronais, previamente cultivadas no lado abluminal. Estes resultados correlacionam-se, de forma clara, com os resultados previamente descritos em estudos in vivo. Em conclusão, os modelos in vitro de BHE baseados na co-cultura de células bEnd3 com células Neuro2a ou astrócitos, têm grande potencial na seleção de candidatos a vetores de terapia génica para o cérebro, uma vez que apresentam importantes características da BHE e se baseiam num método fácil e reprodutível. Tal facto representa uma promessa significativa para a identificação de novas estratégias de terapia génica não invasiva para o tratamento de doenças neurológicas.

Searching biocompounds in marine natural extracts with potential use in tumor prevention and treatment

Cancer is a multistage process characterized by three stages: initiation, promotion and progression; and is one of the major killers worldwide. Oxidative stress acts as initiator in tumorigenesis; chronic inflammation promotes cancer; and apoptosis inactivation is an issue in cancer progression. In this study, it was investigated the antioxidant, antiinflammatory and antitumor properties of hexane, ether, chloroform, methanol and water extracts of five species of halophytes: A. macrostachyum, P. coronopus, J. acutus, C. edulis and A. halimus. Antioxidant activity was assessed by DPPH• and ABTS•+ methods, and the total phenolics content (TPC) was evaluated by the Folin-Ciocalteau method. The anti-inflammatory activity of the extracts was determined by the Griess method, and by evaluating the inhibition of NO production in LPS-stimulated RAW- 264.7 macrophages. The cytotoxic activity of the extracts against HepG2 and THP1 cell lines was estimated by the MTT assay, and the results obtained were further compared with the S17 non-tumor cell line. The induction of apoptosis of J. acutus ether extract was assessed by DAPI staining. The highest antioxidant activities was observed in C. edulis methanol and the J. acutus ether extracts against the DPPH• radical; and J. acutus ether and A. halimus ether extracts against the ABTS•+ radical. The methanol extracts of C. edulis and P. coronopus, and the ether extract of J. acutus revealed a high TPC. Generally the antioxidant activity had no correlation with the TPC. The A. halimus chloroform and P. coronopus hexane extracts demonstrated ability to reduce NO production in macrophages (> 50%), revealing their anti-inflammatory capacity. The ether extract of J. acutus showed high cytotoxicity against HepG2 cancer cells, with reduced cellular viability even at the lowest concentrations. This outcome was significantly lower than the obtained with the non-tumor cells (S17). This result was complemented by the induction of apoptosis.

Avaliação da qualidade microbiológica e da atividade antimicrobiana de água-mel

A produção de água-mel é conhecida em alguns países do Mediterrâneo como Itália e Portugal como uma prática antiga por parte dos apicultores. A água-mel resulta do aproveitamento de mel, própolis e poléns das colmeias após a extração do mel ao qual é adicionado água e sujeita a tratamento térmico prolongado. Conhecida na doçaria regional como ingrediente para bolos ou simplesmente como doce, a água-mel também é retratada pelos populares como remédio para doenças do trato respiratório e tratamento de feridas. Neste trabalho de dissertação o principal objetivo foi verificar a qualidade microbiológica da água-mel assim como a existência de atividade antimicrobiana perante alguns microrganismos de interesse para a saúde humana. As 21 amostras de água-mel foram analisadas em relação aos parâmetros de qualidade microbiológica que incluíram a contagem de aeróbios totais, bolores e leveduras bactérias da família Enterobacteriaceae, a presença de Salmonella spp e esporos de clostrideos sulfito-redutores, no qual todas as amostras apresentaram valores negativos, à exceção de uma amostra que apresentou um valor de microrganismos aeróbios de 3,41±0,09 Log10 UFC/g e de esporos de clostrideos sulfito-redutores o valor foi de 4,05±0,11 Log10 UFC/g. Na análise da atividade antimicrobiana, foram selecionadas quatro amostras de água-mel (1B2010, 1B2011, 1F2011 e 1H2011) baseadas nos resultados obtidos na análise físico-química. Foram testadas diferentes concentrações de água-mel, nomeadamente 20%, 30%, 40% e 50% (p/v) no crescimento de três estirpes de bactérias Gram negativas, oito bactérias Gram positivas e duas leveduras. Após cálculo das percentagens de inibição observou-se inibição de todas as estirpes testadas à exceção da levedura Saccharomyces cerevisiae que se demonstrou menos suscetível (P<0,05). Podemos concluir que a água-mel é um produto seguro para consumo humano do ponto de vista microbiológico e apresenta benefícios para a saúde humana pela sua capacidade de inibir o crescimento de agentes patogénicos.

Montagem de um sistema laboratorial de células de combustível microbianas para aproveitamento energético e tratamento de efluentes doméstico

O presente trabalho objetiva a montagem em escala laboratorial de um grupo de 6 protótipos de Células de Combustível Microbianas (CCM) de Câmara Simples pretendendo constituir um contributo de desenvolvimento de processos anaeróbios para tratamento de águas residuais em Estações de Tratamento de Águas Residuais (ETARs) e produção simultânea de energia elétrica. Em fase preliminar procede-se à montagem de um sistema laboratorial composto por 3 conjuntos de protótipos em duplicados com 3 granulometrias de carvão ativado granular (GAC). Os princípios que fundamentam a seleção do protótipo tipo são uma câmara anódica tubular totalmente preenchida com GAC para facilitar a fixação de biofilmes e a diminuição do espaçamento entre elétrodos com a interposição de um separador para reduzir a resistência interna. A experiência laboratorial inicia-se com uma fase de aclimatação com Água residual artificial e sequencialmente com água residual recolhida na ETAR Faro-Noroeste. Na etapa final a carga orgânica da água residual é incrementada com adição de Acetato de sódio. Os ensaios decorrem em modo de fluxo contínuo. São testados e comparados três tempos de contacto do afluente com o GAC (3, 10 e 30 horas), a combinação destes com dois separadores designados por Daramic HP 200 e GF/A e sem qualquer separador. Finalmente é efetuado um teste incrementando 6 a 8 vezes a carga orgânica do afluente. O desempenho é aferido através do traçado de curvas de polarização, curvas de potência e da percentagem de remoção da Carência Química de Oxigénio (CQO). Conclui que em alguns testes as eficiências de remoção de CQO são adequadas à legislação em vigor, que o aumento e tipo de carga orgânica do afluente e a operação sem separadores incrementam a diferença de potencial e reduzem a resistência interna e que as granulometrias do GAC testadas tiveram pouco efeito na avaliação dos parâmetros considerados.

Synthesis and evaluation of polymer nanoparticles for delivery in RPE cells

Ocular pathologies are among the most debilitating medical conditions affecting all segments of the population. Traditional treatment options are often ineffective, and gene therapy has the potential to become an alternative approach for the treatment of several pathologies. Methacrylate polymers have been described as highly biocompatible and are successfully used in medical applications. Due to their cationic nature, these polymers can be used to form polyplexes with DNA for its delivery. This work aims to study the potential of PDMAEMA (poly(2-(N,N’-dimethylamino)ethyl methacrylate)) as a non viral gene delivery system to the retina. The first part of this work aimed to study the potential for gene delivery of a previously synthesized PDMAEMA polymer of high molecular weight (354kDa). In the second part, we synthesized by RAFT a PDMAEMA with a lower molecular weight (103.3kDa) and similarly, evaluated its ability to act as a gene delivery vehicle. PDMAEMA/DNA polyplexes were prepared at 5, 7.5, 10, 12.5 and 20 nitrogen/phosphorous (N/P) ratio for the 354kDa PDMAEMA and at 5 and 7.5 for the 103.3kDa PDMAEMA. Dynamic light scattering and zeta potential measurements confirmed the nanosize and positive charge of polyplexes for all ratios and for both polymers. Both high and low Mw PDMAEMA were able to efficiently complex and protect DNA from DNase I degradation. Their cytotoxicity was evaluated using a non-retinal cell line (HEK293) and a retinal pigment epithelium (RPE) cell line (D407). We have found that cytotoxicity of the free polymer is concentration and time dependent, as expected, and negligible for all the concentrations of the PDMAEMA-DNA polyplexes. Furthermore, for the concentrations to be used in vivo, the 354kDa PDMAEMA showed no signs of inflammation upon injection in the intravitreal space of C57BL/6 mice. The transfection efficiency, as evaluated by fluorescence microscopy and flow cytometry, showed that the D407 retinal cells were transfected by polyplexes of both high and low Mw PDMAEMA, but with varied efficiency, which was dependent on the N/P ratio. Althogether, these results suggest that PDMAEMA is a feasible candidate for non-viral gene delivery to the retina, and this work constitutes the basis of further studies to elucidate the bottleneck in transfection and further optimization of the material.

Farmacogenómica do eixo renina angiotensina: relevância na suscetibilidade e terapêutica da hipertensão arterial

As doenças cardiovasculares (DCVs) apresentam-se como uma das principais causas de morte e incapacidade na maioria dos países desenvolvidos. A hipertensão arterial (HTA) é um fator de risco que contribui grandemente para o desenvolvimento destas doenças, tendo estado associado, em 2004, a aproximadamente 51% das mortes por doença cerebrovascular, 45% das mortes por doença coronária e 7.5 milhões de mortes prematuras no mundo. Em Portugal, a prevalência de HTA ultrapassa os 40% na população adulta. A terapêutica farmacológica, como os inibidores da enzima de conversão da angiotensina (IECAs) e os antagonistas dos recetores da angiotensina II (ARAs), apesar de serem utilizados como fármacos de 1ª linha e de serem determinantes na evolução positiva das DCV, continuam longe dos efeitos desejados de controlo e tratamento. A variada etiologia da HTA contribui para o difícil tratamento. A farmacogenómica tem vindo a tornar-se uma ferramenta extremamente útil na deteção de grupos populacionais em risco e com fraca resposta ao tratamento, pelo que a sua prática no meio clínico deve ser privilegiada. Deste modo, este estudo incidirá sobre os polimorfismos em genes que integram o eixo renina angiotensina (ERA) – farmacodinâmica (PD) - e também sobre as alterações nos genes que podem estar envolvidos na metabolização e transporte dos fármacos anti-hipertensivos – farmacocinética (PK). Exemplos de algumas destas alterações genéticas foram já descritas na literatura. Um polimorfismo do tipo inserção/deleção (I/D) no gene que codifica a enzima de conversão da angiotensina (ECA), leva ao aumento dos níveis plasmáticos desta e da pressão arterial (PA), originando resistência ao tratamento com IECAs; o polimorfismo 1166A>C no recetor do tipo 1 da angiotensina II (R1AII) leva ao aumento da sua expressão, e por conseguinte, a uma resposta mais efetiva aos ARAs; e a alteração -5312C>T no gene que codifica para a renina (REN) conduz ao aumento da expressão desta, podendo o paciente deixar de responder a concentrações padrão de antagonistas da REN. Em termos de PK, polimorfismos nos enzimas metabolizadores dos ARAs como é o caso do CYP 2C9*2 e CYP 2C9*3 levam ao fenótipo de metabolizador lento (PM) e, por conseguinte a possíveis efeitos tóxicos e inesperados. Também a variante do transportador de influxo OATP1B1*1B tem sido descrita como um fator de variabilidade na PK do valsartan e temocapril. Assim, com o desenvolvimento desta monografia, pretende-se estudar como os diferentes polimorfismos existentes nestes genes podem influenciar na suscetibilidade à HTA e na sua terapêutica.

Farmacogenómica na terapêutica das leucemias agudas

As leucemias agudas são doenças raras, quando comparadas com outros tipos de neoplasias constituindo, no entanto, a doença maligna mais comum na infância. São responsáveis por 30% de todos os tipos de cancros diagnosticados em crianças menores de 15 anos em países industrializados. Enquanto que a leucemia linfoblástica aguda apresenta uma taxa de incidência superior em crianças até aos 15 anos, correspondendo a cerca de 80% das leucemias em crianças e adolescentes, a leucemia mieloide aguda é rara abaixo dos 40 anos, sendo que a sua incidência aumenta progressivamente com a idade. As estratégias atuais de tratamento dividem a terapêutica em duas etapas: a primeira possui como objetivo induzir a remissão da doença e a segunda consiste numa terapêutica de pós-remissão com o objetivo de erradicar a doença residual mínima, evitar recidivas e promover a cura. Após anos de pesquisa na área da farmacogenómica, observa-se que as diferenças genéticas entre indivíduos podem explicar alguma da variabilidade observada na farmacocinética, eficácia e toxicidade de alguns fármacos. Embora muitos estudos relacionem diferentes respostas farmacológicas com a variabilidade genética, a maioria daqueles aplicam-se à população adulta pelo que a atenção dada à população pediátrica tem sido muito menor. Assim, o aperfeiçoamento na terapêutica das leucemias agudas é urgente. Atualmente encontra-se perfeitamente estabelecida a relação entre reações adversas à 6-mercaptopurina e polimorfismos no gene que codifica para a enzima tiopurina s-metiltransferase, sendo um dos poucos exemplos na área da farmacogenética a ser “traduzido” para a prática clínica.

Práticas de comunicação em contexto de organização e tratamento de dados

Esta comunicação reporta-se às práticas de comunicação matemática de uma professora do 1.º ciclo do ensino básico na condução de tarefas de organização e tratamento de dados. Trata-se de um trabalho desenvolvido num contexto de trabalho de natureza colaborativa que segue uma metodologia de investigação qualitativa e interpretativa, na modalidade de estudo de caso. As práticas de comunicação da professora, caracterizadas pelo questionamento dos alunos, desafiando a sua participação nas discussões de sala de aula e valorizando o seu conhecimento matemático, assumem predominantemente o modo de comunicação reflexiva e o padrão de interação de discussão.

The activity of mouse Cerberus like 2 during cardiogenesis - genetic and morphogenetic studies

Cardiogenesis is a delicate and complex process that requires the coordination of an intricate network of pathways and the different cell types. Therefore, understanding heart development at the morphogenetic level is an essential requirement to uncover the causes of congenital heart disease and to provide insight for disease therapies. Mouse Cerberus like 2 (Cerl2) has been defined as a Nodal antagonist in the node with an important role in the Left-Right (L/R) axis establishment, at the early embryonic development. As expected, Cerl2 knockout mice (Cerl2-/-) showed multiple laterality defects with associated cardiac failure. In order to identify the endogenous role of Cerl2 during heart formation independent of its described functions in the node, we accurately analyzed animals where laterality defects were not present. We thereby unravel the consequences of Cerl2 lossof- function in the heart, namely increased left ventricular thickness due to hyperplasia of cardiomyocytes and de-regulated expression of cardiac genes. Furthermore, the Cerl2 mutant neonates present impaired cardiac function. Once that the cardiac expression of Cerl2 is mostly observed in the left ventricle until around midgestration, this result suggest a specific regulatory role of Cerl2 during the formation of the left ventricular myoarchitecture. Here, we present two possible molecular mechanisms underlying the cardiac Cerl2 function, the regulation of Cerl2 antagonist in activation of the TGFßs/Nodal/Activin/Smad2 signaling identified by increased Smad2 phosphorilation in Cerl2-/- hearts and the negative feedback between Cerl2 and Wnt/ß-catenin signaling in heart formation. In this work and since embryonic stem cells derived from 129 mice strain is extensively used to produce targeted mutants, we also present echocardiographic reference values to progressive use of juveniles and young adult 129/Sv strain in cardiac studies. In addition, we investigate the cardiac physiology of the surviving Cerl2 mutants in 129/Sv background over time through a follow-up study using echocardiographic analysis. Our results revealed that Cerl2-/- mice are able to improve and maintain the diastolic and most of systolic cardiac physiologic parameters as analyzed until young adult age. Since Cerl2 is no longer expressed in the postnatal heart, we suggest that an intrinsic and compensatory mechanism of adaptation may be active for recovering the decreased cardiac function found in Cerl2 mutant neonates. Altogether, these data highlight the role of Cerl2 during embryonic heart development in mice. Furthermore, we also suggest that Cerl2-/- may be an interesting model to uncover the molecular, cellular and physiological mechanisms behind the improvement of the cardiac function, contributing to the development of therapeutic approaches to treat heart failures.

Evolution, gene regulation and functional analysis of BMP2 in fish

Bone morphogenetic proteins (BMPs) are multifunctional growth factors belonging to the transforming growth factor β (TGFβ) superfamily with a central role in bone formation and mineralization. BMP2, a founding member of this family, has demonstrated remarkable osteogenic properties and is clinically used to promote bone repair and fracture healing. Lack of basic data on factors regulating BMP2 expression and activity have hampered a better understanding of its role in bone formation and bone-related diseases. The objective of this work was to collect new functional data and determine spatiotemporal expression patterns in a fish system aiming towards a better understanding of BMP2 function and regulation. Transcriptional and post-transcriptional regulation of gilthead seabream BMP2 gene was inferred from luciferase reporter systems. Several bone- and cartilage-related transcription factors (e.g. RUNX3, MEF2c, SOX9 and ETS1) were found to regulate BMP2 transcription, while microRNA 20a was shown to affect stability of the BMP2 transcript and thus the mineralogenic capacity of fish bone-derived host cells. The regulation of BMP2 activity through an interaction with the matrix Gla protein (MGP) was investigated in vitro using BMP responsive elements (BRE) coupled to luciferase reporter gene. Although we demonstrated the functionality of the experimental system in a fish cell line and the activation of BMP signaling pathway by seabream BMP2, no conclusive evidence could be collected on a possible interaction beween MGP and BMP2. The evolutionary relationship among the members of BMP2/4/16 subfamily was inferred from taxonomic and phylogenetic analyses. BMP16 diverged prior to BMP2 and BMP4 and should be the result of an ancient genome duplication that occurred early in vertebrate evolution. Structural and functional data suggested that all three proteins are effectors of the BMP signaling pathway, but expression data revealed different spatiotemporal patterns in teleost fish suggesting distinct mechanisms of regulation. In this work, through the collection of novel data, we provide additional insight into the regulation, the structure and the phylogenetic relationship of BMP2 and its closely related family members.