Evolution, gene regulation and functional analysis of BMP2 in fish

Bone morphogenetic proteins (BMPs) are multifunctional growth factors belonging to the transforming growth factor β (TGFβ) superfamily with a central role in bone formation and mineralization. BMP2, a founding member of this family, has demonstrated remarkable osteogenic properties and is clinically used to promote bone repair and fracture healing. Lack of basic data on factors regulating BMP2 expression and activity have hampered a better understanding of its role in bone formation and bone-related diseases. The objective of this work was to collect new functional data and determine spatiotemporal expression patterns in a fish system aiming towards a better understanding of BMP2 function and regulation. Transcriptional and post-transcriptional regulation of gilthead seabream BMP2 gene was inferred from luciferase reporter systems. Several bone- and cartilage-related transcription factors (e.g. RUNX3, MEF2c, SOX9 and ETS1) were found to regulate BMP2 transcription, while microRNA 20a was shown to affect stability of the BMP2 transcript and thus the mineralogenic capacity of fish bone-derived host cells. The regulation of BMP2 activity through an interaction with the matrix Gla protein (MGP) was investigated in vitro using BMP responsive elements (BRE) coupled to luciferase reporter gene. Although we demonstrated the functionality of the experimental system in a fish cell line and the activation of BMP signaling pathway by seabream BMP2, no conclusive evidence could be collected on a possible interaction beween MGP and BMP2. The evolutionary relationship among the members of BMP2/4/16 subfamily was inferred from taxonomic and phylogenetic analyses. BMP16 diverged prior to BMP2 and BMP4 and should be the result of an ancient genome duplication that occurred early in vertebrate evolution. Structural and functional data suggested that all three proteins are effectors of the BMP signaling pathway, but expression data revealed different spatiotemporal patterns in teleost fish suggesting distinct mechanisms of regulation. In this work, through the collection of novel data, we provide additional insight into the regulation, the structure and the phylogenetic relationship of BMP2 and its closely related family members.

O sistema esquelético confere suporte e proteção ao organismo, permite o armazenamento de minerais e desempenha funções hematopoiéticas. Um dos seus principais componentes é o osso, um tecido conectivo especializado e constituído por uma matriz extracelular extensamente mineralizada. O processo de mineralização envolve mecanismos extremamente complexos que estão sujeitos a um rigoroso controlo a nível molecular, no qual estão envolvidas várias proteínas responsáveis pela diferenciação celular e pela síntese de matriz extracelular. Dentro deste conjunto de proteínas, destacam-se alguns fatores de crescimento essenciais ao mecanismo de mineralização tecidular, como é o caso das proteínas morfogenéticas do osso (BMPs). As BMPs pertencem à superfamília de fatores de crescimento de transformação β (TGFβ) e estão envolvidas em vários processos durante a embriogénese, organogénese, proliferação e diferenciação celular e mecanismos de formação óssea. Atualmente estão descritos e caracterizados mais de vinte membros pertencentes a esta família, que foram divididos em várias subfamílias, de acordo com a semelhança da estrutura primária das suas proteínas. A subfamília BMP2/4/16 à qual pertence a BMP2 foi uma das primeiras a ser identificada e caracterizada. A BMP2 é uma das proteínas que possui uma maior capacidade osteogénica e é, desde há muito tempo, considerada um potencial agente terapêutico para o tratamento de doenças relacionadas com o osso, sendo mesmo utilizada em alguns casos clínicos de fraturas ósseas. O conhecimento dos processos de formação óssea, bem como os mecanismos de regulação da BMP2, são por isso de extrema importância para uma melhor compreensão dos processos subjacentes ao desenvolvimento e progressão de algumas doenças ósseas. Assim, a BMP2 tem sido alvo de vários estudos, quer a nível de conhecimento da sua função, quer a nível de mecanismos de ação e processamento. Sabe-se que a BMP2 é uma proteína secretada para a matriz extracelular onde, através de um mecanismo de sinalização molecular, é responsável pela regulação de vários processos. O mecanismo de sinalização inicia-se quando dímeros de BMP2 se ligam aos respetivos recetores, presentes na superfície da célula, ativando assim uma cascata de sinalização molecular. Através de diferentes intermediários intracelulares, envolvidos na cascata de sinalização, a BMP2 é responsável pela regulação transcricional de vários genes-alvo. No entanto, e apesar dos vários estudos que foram feitos nesta área, o conhecimento existente acerca deste assunto é ainda bastante escasso. Neste sentido, o objetivo principal deste trabalho foi a recolha de novos dados funcionais e estruturais, que permitam uma melhor compreensão da função da BMP2. Para tal, e de modo a complementar o conhecimento existente, utilizámos o peixe como modelo alternativo aos sistemas de mamíferos. O peixe é atualmente reconhecido como um modelo válido para estudos do esqueleto de vertebrados para o qual existem já várias ferramentas que permitem análises in silico, in vitro e in vivo. Este trabalho envolveu o estudo da regulação do gene da BMP2 de dourada, tanto a nível transcricional como a nível pós-transcricional. Numa primeira fase, foram identificados potenciais reguladores transcricionais da BMP2 de dourada, através da análise in silico da região reguladora do gene. Dentro dos potenciais reguladores transcricionais, foram identificados vários fatores de transcrição com funções descritas ao nível do osso e da cartilagem, nomeadamente o RUNX3, SOX9, MEF2C e ETS1, que foram posteriormente testados a nível funcional através de ensaios repórter de luciferase. Em paralelo, no decorrer da caracterização de reguladores pós-transcricionais da BMP2, através da análise da região 3’ não traduzida (3’UTR) do seu mRNA, foi possível identificar um local de ligação para o miR-20a, conservado ao longo da evolução. A fim de melhor compreender os mecanismos de ação da BMP2, neste trabalho investigámos também possíveis parceiros desta proteína. A caraterização da interação entre a BMP2 e a proteína Gla da matriz (MGP), um conhecido inibidor da calcificação, foi avaliada através do uso de um sistema de elementos de resposta às BMPs, acoplado a um gene repórter, a luciferase. Embora tenhamos demonstrado a funcionalidade do sistema através da ativação do mecanismo de sinalização celular pela BMP2 de dourada, não foram obtidos dados conclusivos no que diz respeito à interação entre a BMP2 e a MGP. Finalmente, abordamos o aspecto evolutivo dos membros da subfamília BMP2/4/16 através da análise da sua distribuição taxonómica entre vários organismos vertebrados, bem como as relações filogenéticas existentes entre os vários membros desta subfamília. Foi demonstrado que a BMP16 divergiu antes da BMP2 e BMP4 na linhagem dos vertebrados e foi, provavelmente, o resultado de uma duplicação genómica que terá ocorrido ancestralmente. Dados estruturais sugerem uma conservação funcional das três proteínas, facto que foi confirmado pela capacidade de ativação dos mecanismos de sinalização das BMPs. No entanto, e apesar da conservação ao nível da região codante dos genes das BMP2, BMP4 e BMP16, as regiões não traduzidas são substancialmente diferentes, apontando para uma regulação diferencial dos três genes, como é aliás sugerido pelos distintos padrões de expressão observados para a BMP2, BMP4 e BMP16, tanto em linguado como em peixe zebra. Ao longo deste trabalho foram recolhidos novos dados que permitem uma melhor compreensão da função e regulação da BMP2. Foram igualmente obtidas informações relevantes acerca da filogenia molecular dos membros da subfamília das BMP2/4/16 que contribuíram para uma melhor compreensão e interpretação da complexa história evolutiva desta subfamília. No seu conjunto, os resultados deste trabalho contribuem para uma validação do uso dos peixes como um modelo alternativo na investigação de mecanismos moleculares envolvidos no processo de mineralização tecidular.

Universidade do Algarve, Departamento de Ciências Biomédicas