A proteomic study of the effects of nutrient restriction in utero on postnatal metabolism

It is widely recognized that protein restriction in utero may cause metabolic and endocrine adaptations, which may be of benefit to the neonate on a short-term basis but may cause adverse long-term conditions such as obesity, Type 2 diabetes, metabolic syndrome, hypertension and cardiovascular diseases. Adequate foetal and early post natal nutrient and energy supply is therefore essential for adult animal health, performance and life span. In this project it was investigated the progressive adaptations of the hepatic proteome in male mink offspring exposed to either a low protein (FL) or an adequate protein (FA) diet in utero fed either on a low protein (LP) or on an adequate (AP) diet from weaning until sexual maturity. Specifically, the aim was to determine the metabolic adaptations at selected phases of the animal’s first annual cycle and establish the metabolic priorities occurring during those phases. The three different morphological stages studied during the first year of development included, end of bone growth at 4 months of age, maximal fat accretion at 6 months of age and sexual maturity at 12 months of age. A reference proteome of mink liver coming from these different animal groups were generated using 2D electrophoresis coupled to MALDI-TOF analysis and the way in which dietary treatment affect their proteome was established. Approximately 330 proteins were detected in the mink liver proteome. A total of 27 comparisons were carried out between all different animal groups which resulted in 20 differentially expressed proteins. An extensive survey was conducted towards the characterization of these proteins including their subcellular localization, the biological processes in which they are involved and their molecular functions. This characterization allowed the identification of proteins in various processes including the glycolysis and fatty acid metabolism. The detailed analysis of the different dietary treatment animal groups was indicative of differences in metabolism and also to changes associated with development in mink.

É do conhecimento geral que a restrição proteica aplicada a fetos in utero pode causar adaptações tanto metabólicas como endócrinas. Estas alterações, muito embora possam revelar-se benéficas a curto prazo ao recém-nascido, podem igualmente causar efeitos adversos a longo prazo. Exemplos disso são os casos já reportados de obesidade, diabetes tipo II, síndrome metabólica, hipertensão e ainda doenças cardiovasculares. Deste modo torna-se evidente que uma alimentação adequada, tanto enquanto feto como recém-nascido, bem como, o fornecimento de energia, são essenciais à saúde do animal na vida adulta. No presente trabalho de investigação foram estudadas possíveis adaptações/alterações no metabolismo de martas do sexo masculino, tendo estas sido sujeitas a uma dieta restrita em proteínas tanto in utero como após o período de amamentação. Este estudo foi realizado através da análise comparativa do proteoma do fígado destes animais, sendo que, a escolha deste órgão foi baseada na significativa função metabólica que o fígado possui. A amostragem animal constou de, inicialmente, dois grupos distintos de animais expostos a adequados e baixos níveis de proteína in utero (FA e FL, respectivamente), que posteriormente, após o período de amamentação (7 semanas de idade), foram igualmente alimentados com adequados e baixos níveis de proteína (AP e LP, respectivamente). Sendo assim, foram gerados quatro diferentes grupos de animais – FA-AP, FA-LP, FL-AP e FL-LP – e, de cada um deles (três animais por grupo), foram recolhidas amostras de fígado em diferentes tempos de vida de forma a ser possível determinar adaptações metabólicas em fases específicas do ciclo de vida do animal. Os três estágios morfologicamente diferentes estudados ao longo do primeiro ano de vida das martas foram: aos 4 meses de idade quando se verifica o final do crescimento do osso, aos 6 meses de idade que é o período correspondente ao expoente máximo de acumulação de gordura por parte destes animais e, aos 12 meses de idade, período a partir do qual é atingida a maturidade sexual. O protocolo seguido no presente estudo teve como base metodologias associadas à análise proteómica. Após uma primeira etapa de extracção e quantificação das proteínas presentes no fígado das martas foi aplicada a técnica de electroforese bidimensional. Esta é uma técnica que consiste em duas etapas consecutivas de separação das proteínas: a primeira, denominada primeira dimensão ou focagem isoeléctrica, que se baseia na separação proteica de acordo com o ponto isoeléctrico das proteínas, e a segunda, denominada segunda dimensão ou SDS-PAGE, que se traduz na separação das mesmas de acordo com o seu peso molecular. As imagens do proteoma do fígado representativas de cada grupo de animais foram obtidas através de um densitómetro e, posteriormente, com o auxílio do software ImageMasterTM 2D Platinum 6.0 estas imagens foram analisadas comparativamente de forma a seleccionar as proteínas de expressão significativamente diferente. Por fim, foi aplicada a técnica de espectroscopia de massa tornando-se possível a identificação destas proteínas. Deste modo, tendo como recurso a técnica de electroforese 2D acoplada à análise MALDI-TOF, foi obtido um gel padrão referente ao proteoma do fígado da marta, sendo que foram detectadas aproximadamente 330 proteínas. No total foram realizadas vinte e sete análises comparativas entre todos os diferentes grupos de animais que revelaram vinte proteínas expressas diferencialmente. Uma larga pesquisa foi conduzida com o intuito de caracterizar estas vinte proteínas de acordo com a sua localização celular, os processos biológicos nos quais elas possam estar envolvidas e ainda a sua função molecular. Este passo permitiu identificar os vários processos nos quais as proteínas estão implícitas, tendo-se destacado dois principais - a glicólise e o metabolismo dos ácidos gordos. Relativamente à sequência metabólica na qual a glucose é convertida em piruvato, as três proteínas triose fosfato isomerase, gliceraldeido 3-fosfato desidrogenase e fosfoglicerato cinase 1 revelaram diferentes níveis de expressão entre grupos de animais, enquanto que, associadas ao metabolismo dos ácidos gordos, proteínas de ligação a ácidos gordos foram também identificadas. A análise detalhada das comparações entre os vários grupos de animais com os diferentes tipos de tratamento foi indicativa da presença de diferenças no metabolismo destes animais, bem como, de alterações associadas ao desenvolvimento dos mesmos.

Universidade do Algarve, Faculdade de Ciências e Tecnologia