In vitro characterization of human AML-reactive CTL clones generated from the naive subset of healthy donors and adoptive transfer into leukemia-engrafted NSG mice

Acute myeloid leukemia (AML) is a very aggressive cancer of the hematopoietic system. Chemotherapy and immunotherapeutical approaches including hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) and donor lymphocyte infusion (DLI) are the only curative options available. The beneficial graft-versus-leukemia (GVL) effect of cellular immunotherapy is mostly mediated by donor-derived CD8+ T lymphocytes that recognize minor histocompatibility antigens (mHags) and leukemia-associated antigens (LAAs) presented on the surface of AML blasts (Falkenburg et al. 2008; Kolb 2008). A main complication is graft-versus-host disease (GVHD) that can be induced when cytotoxic T lymphocytes (CTLs) recognize broadly expressed antigens. To reduce the risk of GVHD, specific allogeneic T-cell therapy inducing selective GVL responses could be an option (Barrett & Le Blanc 2010; Parmar et al. 2011; Smits et al. 2011). This requires efficient in vitro strategies to generate AML-reactive T cells with an early differentiation phenotype as well as vigorous effector functions and humanized mouse models to analyze the anti-leukemic potential of adoptively transferred T cells in vivo. In this study, AML-reactive CTL clones and oligoclonal T-cell lines could be reliably generated from the naive subset of healthy HLA-class I-identical donors by stimulation with primary AML blasts in mini-mixed-lymphocyte / leukemia cultures (MLLCs) in eight different patient / donor pairs. These CTLs were promising candidates for cellular immunotherapy because of their relatively early differentiation phenotype and strong proliferative and lytic capabilities. The addition of the common γ-chain cytokine IL-21 to the stimulation protocol enabled more precursors to develop into potent leukemia-reactive CTLs, presumably by its beneficial effects on cell survival and antigen-specific proliferation during the first weeks of cultures. It also strengthened the early-stage phenotype. Three long-term cultured CTLs exemplarily transferred into leukemia-engrafted immunodeficient NSG mice mediated a significant reduction of the leukemic burden after a single transfusion. These results demonstrate that CTL clones with reactivity to patient-derived AML blasts can be isolated from the naive compartment of healthy donors and show potent anti-leukemic effects in vivo. The herein described allo-MLLC approach with in vitro “programmed” naive CTL precursors independent of a HSCT setting is a valuable alternative to the conventional method of isolating in vivo primed donor CTLs out of patients after transplantation (Kloosterboer et al. 2004; Warren et al. 2010). This would make leukemia-reactive CTLs already available at the time point of HSCT, when residual leukemia disease is minimal and the chances for complete leukemia eradication are high. Furthermore, leukemia-reactive CTLs effectively expanded by this in vitro protocol can be used as screening populations to identify novel candidate LAAs and mHags for antigen-specific immunotherapy.

Untersuchungen zur autoimmunen Genese der thrombotisch thrombozytopenischen Purpura

Untersuchungen zur autoimmunen Genese der thrombotisch thrombozytopenischen Purpura. rnEinführung: Die idiopathische thrombotisch thrombozytopenische Purpura (TTP) ist eine lebensbedrohliche Mikroangiopathie und wird durch ein Autoantikörper-induziertes Defizit der ADAMTS13-Protease ausgelöst. Eine Assoziation zwischen Krankheitsprädisposition und Vorliegen bestimmter humaner Leukozytenantigene (HLA) wird vermutet. Untersuchungen zu diesem Zusammenhang stellen einen Teil dieser Arbeit dar. rnAutoimmunkrankheiten tendieren zum gemeinsamen Auftreten innerhalb eines Individuums. Im zweiten Teil dieser Arbeit wird untersucht, ob eine solche Kookkurrenz verschiedener Autoimmunkrankheiten auch bei Patienten mit idiopathischer TTP beobachtet werden kann.rnMethodik: Zur Untersuchung der ersten Fragestellung werden die HLA-Klasse I und II-Merkmale von 54 deutschen TTP-Patienten bestimmt. Alle Patienten weisen Autoantikörper gegen ADAMTS13 und eine Protease-Aktivität <5% vor. Die Blutproben werden mittels Sequence Specific Primer-Polymerase Chain Reaction (PCR) und Sequence Specific Oligonucleotid-PCR auf HLA-DRB1, -DRB3-5 und –DQB1 untersucht. Als Referenz dienen die Werte deutscher Knochenmark- und Blutspender, erhalten über www.allelefrequencies.net. Die statistische Auswertung erfolgt mittels zweiseitigem Binomialtest und die resultierenden p-Werte werden nach Benjamini-Hochberg korrigiert.rnZur Beantwortung der zweiten Fragestellung werden 76 deutsche TTP-Patienten anhand eines standardisierten Fragebogens nach Begleiterkrankungen befragt. Als Vergleichswerte dient die Prävalenz der jeweiligen Erkrankung in der Allgemeinbevölkerung. Die statistische Auswertung erfolgt mittels zweiseitigem Binomialtest. Da die p-Werte nicht korrigiert werden, sind die Ergebnisse nur deskriptiv zu verstehen.rnErgebnis: Der Vergleich der HLA-Frequenzen ergibt ein signifikant gehäuftes Vorkommen von HLA-DQB1*02:02 (p<0,001) und -DRB1*11 (p=0,003) innerhalb des Patientenkollektivs. 20% (DQB1*02:02) bzw. 48,1% (DRB1*11) der TTP-Patienten sind im Gegensatz zu nur 1,2% (DQB1*02:02) bzw. 23,5% (DRB1*11) innerhalb der Vergleichsgruppe für das jeweilige HLA-Merkmal positiv.rnDie Befragung der TTP-Patienten bezüglich weiterer Erkrankungen ergab im Vergleich mit der Allgemeinbevölkerung fünf auffällig häufig im Patientenkollektiv vorkommende Autoimmunkrankheiten: Hashimoto Thyreoiditis (23,5% in der Patientengruppe zu 0,7% in der Allgemeinbevölkerung; p<0,001), systemischer Lupus erythematodes (6,5% der Patienten im Gegensatz zu 0,025% in der Allgemeinbevölkerung, p<0,001), Immunthrombozytopenie (6,3% der Patienten zu 0,02% in der Allgemeinbevölkerung; p<0,001), Psoriasis (9,4% der Patienten zu 2,5% in der Allgemeinbevölkerung; p=0,005) und glutensensitive Enteropathie (3,1% der Patienten zu 0,2% in der Allgemeinbevölkerung; p=0,007). rnSchlussfolgerung: Das vermehrte Vorkommen bestimmter HLA-Merkmale im Patientenkollektiv spricht für eine prädisponierende Wirkung dieser Antigene im Krankheitsgeschehen. Eine mögliche HLA-vermittelte Assoziation zwischen TTP und den genannten Autoimmunkrankheiten wird vermutet, kann jedoch nicht in allen Fällen die beobachtete Kookkurrenz ausreichend erklären. Insgesamt bestätigt die vorliegende Arbeit die Assoziation verschiedener Autoimmunkrankheiten untereinander und spricht für eine genetische Prädisposition zur Ausbildung autoimmuner Störungen. rn

Generation of FLT3-ITD-reactive T-cell populations from different sources

Approximately 25% of acute myeloid leukemias (AMLs) carry internal tandem duplications (ITD) of various lengths within the gene encoding the FMS-like tyrosine kinase receptor 3 (FLT3). Although varying duplication sites exist, most of these length mutations affect the protein´s juxtamembrane domain. FLT3-ITDs support leukemic transformation by constitutive phosphorylation resulting in uncontrolled activation, and their presence is associated with worse prognosis. As known form previous work, they represent leukemia- and patient-specific neoantigens that can be recognized by autologous AML-reactive CD8+ T cells (Graf et al., 2007; Graf et al., unpublished). Herein, in patient FL, diagnosed with FLT3-ITD+ AML and in first complete remission after induction chemotherapy, T cells against her leukemia´s individual FLT3-ITD were detected at a frequency up to 1.7x10-3 among peripheral blood CD8+ T lymphocytes. This rather high frequency suggested, that FLT3-ITD-reactive T cells had been expanded in vivo due to the induction of an anti-leukemia response.rnrnCell material from AML patients is limited, and the patients´ anti-leukemia T-cell repertoire might be skewed, e.g. due to complex previous leukemia-host interactions and chemotherapy. Therefore, allogeneic sources, i.e. buffy coats (BCs) from health donors and umbilical cord blood (UCB) donations, were exploited for the presence and the expansion of FLT3-ITD-reactive T-cell populations. BC- and UCB-derived CD8+ T cells, were distributed at 105 cells per well on microtiter plates and, were stimulated with antigen-presenting cells (APCs) transfected with in vitro-transcribed mRNA (IVT-mRNA) encoding selected FTL3-ITDs. APCs were autologous CD8- blood mononuclear cells, monocytes or FastDCs.rnrnBuffy coat lymphocytes from 19 healthy individuals were analyzed for CD8+ T-cell reactivity against three immunogenic FLT3-ITDs previously identified in patients VE, IN and QQ and designated as VE_, IN_ and QQ_FLT3-ITD, respectively. These healthy donors carried at least one of the HLA I alleles known to present an ITD-derived peptide from one of these FLT3-ITDs. Reactivities against single ITDs were observed in 8/19 donors. In 4 donors the frequencies of ITD-reactive T cells were determined and were estimated to be in the range of 1.25x10-6 to 2.83x10-7 CD8+ T cells. These frequencies were 1,000- to 10,000-fold lower than the frequency of autologous FLT3-ITD-reactive T cells observed in patient FL. Restricting HLA I molecules were identified in two donors. In one of them, the recognition of VE_FLT3-ITD was found to be restricted by HLA-C*07:02, which is different from the HLA allele restricting the anti-ITD T cells of patient VE. In another donor, the recognition of IN_FLT3-ITD was restricted by HLA-B*35:01, which also had been observed in patient IN (Graf et al., unpublished). By gradual 3´-fragmentation of the IN_FLT3-ITD cDNA, the 10-mer peptide CPSDNEYFYV was identified as the target of allogeneic T cells against IN_FLT3-ITD. rnLymphocytes in umbilical cord blood predominantly exhibit a naïve phenotype. Seven UCB donations were analyzed for T-cell responses against the FLT3-ITDs of patients VE, IN, QQ, JC and FL irrespective of their HLA phenotype. ITD-reactive responses against all stimulatory FLT3-ITDs were observed in 5/7 UCB donations. The frequencies of T cells against single FLT3-ITDs in CD8+ lymphocytes were estimated to be in the range of 1.8x10-5 to 3.6x10-6, which is nearly 15-fold higher than the frequencies observed in BCs. Restricting HLA I molecules were identified in 4 of these 5 positive UCB donations. They were mostly different from those observed in the respective patients. But in one UCB donation T cells against the JC_FLT3-ITD had exactly the same peptide specificity and HLA restriction as seen before in patient JC (Graf et al., 2007). Analyses of UCB responder lymphocytes led to the identification of the 10-mer peptide YESDNEYFYV, encoded by FL_FLT3-ITD, that was recognized in association with the frequent allele HLA-A*02:01. This peptide was able to stimulate and enrich ITD-reactive T cells from UCB lymphocytes in vitro. Peptide responders not only recognized the peptide, but also COS-7 cells co-transfected with FL_FLT3-ITD and HLA-A*02:01.rnrnIn conclusion, T cells against AML- and individual-specific FLT3-ITDs were successfully generated not only from patient-derived blood, but also from allogeneic sources. Thereby, ITD-reactive T cells were detected more readily and at higher frequencies in umbilical cord blood than in buffy coat lymphocytes. It occurred that peptide specificity and HLA restriction of allogeneic, ITD-reactive T cells were identical to autologous patient-derived T cells. As shown herein, allogeneic, FLT3-ITD-reactive T cells can be used for the identification of FLT3-ITD-encoded peptides, e.g. for future therapeutic vaccination studies. In addition, these T cells or their receptors can be applied to adoptive transfer.

Analyse humaner regulatorischer T-Zellen im humanisierten Mausmodell

Regulatorische T-Zellen sind essentiell für die Aufrechterhaltung der peripheren Toleranz. Hierbei sorgen diese hocheffektiven Suppressorzellen für ein immunologisches Gleichgewicht, indem sie Immunantworten gegen Autoantigene sowie harmlose Nahrungs- und Umweltantigene verhindern. Andererseits können diese bei chronischen Infekten Immunantworten reduzieren sowie effektive Antitumor-Immunantworten hemmen. Aufgrund ethischer Erwägungen ist die Erforschung regulatorischer T-Zellen und deren Rolle bei der Tumorentwicklung weitestgehend auf Mausmodelle oder humane in vitro oder ex vivo Analysen beschränkt. Um diese Limitationen zu überwinden und translationale immunologische Experimente zu ermöglichen, wurde hier ein humanisiertes Mausmodell verwendet. T- und B-Zell-defiziente NOD-scid IL2Rgammanull (NSG) Mäuse wurden mit humanen CD34+ hämatopoetischen Stammzellen aus Nabelschnurblut rekonstituiert. Aus diesen Stammzellen entstanden in den Tieren vielfältige humane Immunzellen. Im murinen Thymus der NSG Tiere entwickelten sich CD4+ und CD8+ einzelpositive T-Zellen, welche als funktionelle Effektorpopulationen in die Peripherie auswanderten. Humane regulatorische T-Zellen (CD4+ CD25+ Foxp3+ CD127-) entwickelten sich ebenfalls im murinen Thymus der Tiere und machten ca. 10% der humanen peripheren CD4+ T-Zellen in den Mäusen aus. Diese humanen regulatorischen T-Zellen zeigten vorwiegend einen HLA-DR+ Phänotyp, welcher mit höchster Suppressivität assoziiert ist. Weiter verhielten sich die regualtorischen T-Zellen anergisch und bewiesen ihre Funktionalität unter anderem durch die Inhibition der Proliferation von Effektor-T-Zellen in vitro. rnSubkutan injizierte Tumorzellen eines humanen undifferenzierten pleomorphen Sarkoms wurden in den humanisierten Mäusen nicht abgestoßen und der Tumor konnte, trotz Infiltration humaner Immunzellen, ungehindert wachsen. Als mögliche Ursache hierfür zeigte sich die selektive Akkumulation regulatorischer T-Zellen im Tumor. Zusammen mit dem erhöhten Anteil humaner regulatorischer T-Zellen in der Peripherie, weisen diese Beobachtungen deutliche Parallelen mit Befunden aus humanen Patienten auf. Dies bietet somit erstmalig die Option in vivo die Rolle humaner regulatorischer T-Zellen im undifferenzierten pleomorphen Sarkom zu analysieren. Die hier gezeigten Daten machen deutlich, dass es das humanisierte Mausmodell ermöglicht, die Entstehung und Funktion humaner regulatorischer T-Zellen in vivo zu analysieren, deren Bedeutung in klinisch relevanten Modellen zu charakterisieren und somit innovative Therapien zu etablieren.

Etablierung eines humanisierten Mausmodells zur In-vivo-Analyse von DC-adressierenden Nanopartikeln

In dieser Arbeit wurde zunächst ein humanisiertes Mausmodell entwickelt für die Analyse von humanen DCs in vivo. Darüber hinaus wurden erste Versuche mit Nanopartikelbeladenen DCs durchgeführt, mit der Intention, durch diese Kombination humane DCs zu untersuchen. Es wurden immunsupprimierte NOD/LtSz-scid IL2R (NSG) Mäuse verwendet und mit humanen CD34+ PBSCs transplantiert. Es wurden insgesamt 14 Modelle getestet, mit einer durchschnittlichen Humanisierungsrate von 76 %. In allen Modellen konnten ab Woche sechs nach Transplantation humane CD45+ Zellen sowie humane Bund NK-Zellen und CD14+ Monozyten gefunden werden. Darüber hinaus waren myeloide DC-Vorläuferzellen, konventionelle HLA DR CD11c DCs (cDCs) und plasmazytoide DCs (pDCs) vorhanden. Humane T-Zellen konnten nicht vor Woche 18 nach Transplantation beobachtet werden. Neben der Rekonstitution humaner DCs in peripheren Organen, wurde ebenfalls nach gewebsständigen DCs, insbesondere den Langerhans Zellen (LCs) der Epidermis geschaut. Waren humane LC vorhanden, konnten diese ab Woche zwölf nach Transplantation in der murinen Epidermis detektiert werden. Diese waren konstant bis in Woche 30 nach Transplantation nachweisbar. In Hinblick auf die Etablierung der DCs in diesem humanisierten Mausmodells wurden verschiedene Einflussgrößen getestet. IL-7 führte zu keiner veränderten Hämatopoese, wohingegen Flt3L zu einer Zunahme von CD14+ Monozyten und cDCs führte. Darüber hinaus konnte eine drastische Abnahmernhumaner B-Zellen beobachtet werden. Es zeigte sich, dass der Zeitpunkt der Flt3LrnApplikation einen entscheidenen Faktor für den Effekt von Flt3L auf die Rekonstitution humaner Zellen darstellt. Für die in dieser Arbeit durchgeführten funktionellen in vivo Studien, wurden humanisierten Mäusen alloreaktive CD8+ T-Zellen appliziert. Somit sollte die Funktionalität der rekonstituierten humanen APCs getestet werden. Es wurde deutlich, dass Monozyten und DCs ihre Funktionalität erst ab Woche 14 nach Transplantation zu entwickeln schienen,rnwohingegen B-Zellen bereits zu früheren Zeitpunkten als Zielzellen für die alloreaktiven T-Zellen dienten. Dies wurde durch den Rückgang der jeweiligen Zellen nach Applikation der T-Zellen sichtbar. Zu erwähnen ist, dass das Anwachsen einer humanen Hämatopoese stark spenderabhängig ist und somit keine allgemeingültigen Aussagen hinsichtlich der in vivo Funktion getroffen werden können. Um im Gewebe verbliebende APCs zu manipulieren gibt es verschiedene Möglichkeiten. Im Rahmen dieser Arbeit wurden auf Polystyren-basierende Nanopartikel getestet. Die verwendeten Partikel hatten eine Größe von 80 bis 160 nm und waren unfunktionalisiert oder mit Amino- bzw. Carboxy-Gruppen versehen. Zusätzlich wurden die Partikel mit BODIPY (Durchflusszytometrie und kLSM-Messungen), einem Infrarotnahem Farbstoff IR 780 (BFI-Messungen) und Platin (in vivo Messungen) beladen. Der Carboxy-funktionalisierte Partikel zeigte den geringsten Einfluss auf die Vitalität von humanen DCs, wohingegen der Amino-funktionalisierte Partikel bei steigender Konzentration toxisch wirkte. Bei unfunktionalisierten Partikeln stieg die Toxizität bei zunehmender Konzentration. Hinsichtlich der Expression diverser DC spezifischer Oberflächenmoleküle nach Beladung mit Nanopartikeln zeigte sich, dass allein der unfunktionalisierte, mit Lutensol AT50 hergestellte Partikel zu einer leichten Hochregulation von MHC-Klasse-II Molekülen führte. Die Expression von CD86 wurde im Gegenzug nur durch die Beladung mit den Amino-, bzw. Carboxy funktionalisierten Partikeln und dem unfunktionalisierten, mit SDS hergestellten Partikel leicht gesteigert. Trotz der teilweise leicht veränderten Expression von Oberflächenmarkern, konnte mit Hilfe von IFN-g ELISpots keine Beeinflussungrnder Funktion als APCs von Nanopartikel-beladenen DCs beobachtet werden. In den in vivo Untersuchungen zeigten alle vier Partikel eine konstante Zirkulation imrnOrganismus und konnten bis 96 h nach Applikation nachgewiesen werden. Alle Partikel konnten primär in der Leber detektiert werden, wobei der unfunktionalisierte, mit Lutensol AT50 hergestelle Partikel das weiteste Verbreitungsmuster zeigte. Erste Versuche im humanisierten Mausmodell zeigten keine Beeinflussung der Verteilung und Kinetik von Nanopartikeln durch die humane Hämatopoese. Mit dem in dieser Arbeit etablierten humanisierten Mausmodell ist es möglich, die Entwicklung, Differenzierung, Aktivierung und Funktionalität humaner DCs in vivo zu untersuchen. Darüber hinaus kann das gezielte Adressieren von DCs in vivo analysiert werden, was sowohl die Möglichkeit der Manipulation von DCs zur Vermeidung einer akuten GvHD bietet als auch Verwendung in anderen DC-vermittelten Therapien (z.B.Vakzinationsstudien) findet.

CD137-selektierte leukämiereaktive T-Zellen gesunder Spender zur adoptiven Immuntherapie stammzelltransplantierter Leukämiepatienten = CD137-selected leukaemia-reactive T Cells from healthy donors for adoptive immunotherapy in stem-cell-transplanted leukaemia-patients

Bei stammzelltransplantierten Patienten, die ein Rezidiv ihrer Leukämie erleiden, kann eine Donor-Lymphozyten-Infusion (DLI) dauerhafte vollständige Leukämieremissionen induzieren. T-Zellen in der DLI vermitteln sowohl den potentiell kurativen Graft-versus-Leukaemia (GVL) Effekt, als auch die potentiell lebensbedrohliche Graft-versus-Host Disease (GVHD). Hingegen könnte die Infusion von leukämiereaktiven T-Zellen einen selektiven GVL Effekt und einen Langzeitschutz vor Rezidiven durch eine spezifisch gegen die Leukämie gerichtete Immunantwort und Immunität vermitteln. Unsere Arbeitsgruppe hat Protokolle zur in vitro Generierung leukämiereaktiver T-Zellen entwickelt, die hohe zytotoxische Aktivität gegen akute myeloische Leukämie-Blasten (AML) bei minimaler Reaktion auf mögliche GVHD Zielstrukturen zeigen. Für die klinische Anwendung sind diese Protokolle jedoch zu aufwändig, wobei vor allem eine erhebliche Verkürzung der Kulturzeit auf wenige Wochen erforderlich ist. Diese Verkürzung der in vitro Kulturzeit könnte das Wachstum von T-Zellen vom central memory oder frühen effector memory Phänotyp fördern, für die eine bessere in vivo Effektorfunktion und längere Persistenz im Rezipienten verglichen mit T-Zellen aus Langzeitkultur gezeigt werden konnte. Der Aktivierungsmarker und Kostimulations-Rezeptor CD137 kann zur Erkennung und Isolation antigenspezifischer T-Zellen genutzt werden, ohne dass dafür das von den T-Zellen erkannte Peptidepitop bekannt sein muss. Eine CD137-vermittelte Anreicherung mit Hilfe von clinical grade Materialien könnte verwendet werden, um DLI-Produkte mit leukämiespezifischen T-Zellen herzustellen, die sich sowohl durch eine effizientere T-Zell Generierung durch in vitro Selektion und Kostimulation, als auch durch eine verbesserte Spezifität des T-Zell-Produkts auszeichnen. Lymphozyten-Leukämie Cokulturen (mixed lymphocyte leukaemia cultures) wurden mit CD8 T-Zellen gesunder Spender und HLA-identischen oder einzel-HLA-mismatch AML-Blasten angesetzt und wöchentlich restimuliert. Nach zwei Wochen wurden die T-Zellen 12 Stunden nach Restimulation über den Marker CD137 positiv isoliert und anschließend separat weiterkultiviert. Die isolierten Fraktionen und unseparierten Kontrollen wurden im ELISPOT-Assay und im Chrom-Freisetzungstest an Tag 5 nach der Restimulation getestet. Es wurden keine konsistent nachweisbaren Vorteile im Hinblick auf Wachstum und Funktion der isolierten CD137-positiv Fraktion im Vergleich zur unseparierten Kontrolle gefunden. Verschiedene Isolationsmethoden, Patient-Spender-Systeme, Methoden zur Restimulation, Temperaturbedingungen, Zytokinkombinationen und Methoden der Zytokinzugabe sowie zusätzliche Feeder-Zellen oder AML-Blasten konnten Wachstum, funktionelle Daten und die deutlichen Zellverluste während der Isolation nicht entscheidend beeinflussen. Vitalfärbungen zeigten, dass aktivierungsinduzierter Zelltod CD137-positiver Zellen zu diesen Ergebnissen beitragen könnte. Im Gegensatz zur Stimulation mit AML-Blasten wurden erfolgreiche CD137-Anreicherungen für peptidstimulierte T-Zellen publiziert. Unterschiedliche CD137-Expressionskinetiken, aktivierungsinduzierter Zelltod und regulatorische T-Zellen sind mögliche Faktoren aufgrund derer die CD137-Anreicherung in diesem spezifischen Kontext ungeeinet sein könnte. Der stimulatorische Effekt eines CD137-Signals auf AML-reaktive CD8 T-Zellen wurde mit Hilfe von CD3/CD28 und CD3/CD28/CD137 Antikörper-beschichteten magnetischen beads untersucht. Für Nierenzellkarzinom-reaktive T-Zellen war die Stimulation mit CD3/CD28/CD137 beads genauso effektiv wie mit Tumorzellen und effektiver als mit CD3/CD28 beads. Beide Arten von beads waren für eine Stimulation während der ersten Wochen der Zellkultur geeignet, sodass ein zusätzliches CD137-Signal für die länger anhaltende Expansion tumorreaktiver T-Zellen zur klinischen Anwendung nützlich sein könnte. Die bead-Expansion veränderte die IFN-Sekretion im ELISPOT nicht, aber verursachte eine mäßige Verschlechterung der Zytotoxizität im Chrom-Freisetzungstest. Im Gegensatz dazu zeigten bei AML-reaktiven T-Zellen beide Arten von beads einen nicht apoptosevermittelten, dosisabhängigen zellschädigenden Effekt, der zu einer raschen Abnahme der Zellzahl in Kulturen mit beads führte. Unerwünschte Effekte auf die T-Zell-Funktionalität durch bead-Stimulation sind in der Literatur beschrieben, dennoch gibt es aktuell keine Veröffentlichungen, die eine fundierte Erklärung für den Effekt auf AML-reaktive T-Zellen bieten könnten. Abgesehen von Literaturdaten, die darauf hindeuten, dass CD137 ein vielversprechendes Kandidatenmolekül für die Anreicherung und Expansion von AML-reaktiven T-Zellen sein könnte, zeigen die eigenen Daten sowohl zur CD137-Isolation als auch zur bead-Stimulation, dass für diese spezielle Anwendung CD137 ein ungeeigneter Aktivierungsmarker und Kostimulations-Ligand ist.

Generation and characterisation of acute myeloid leukaemia-reactive CD4 + T cells and their potential to eliminate human leukaemia blasts in NSG mice

Acute myeloid leukaemia (AML) is a cancer of the haematopoietic system, which can in many cases only be cured by haematopoietic stem cell transplantation (HSCT) and donor lymphocyte infusion (DLI) (Burnett et al., 2011). This therapy is associated with the beneficial graft-versus-leukaemia (GvL) effect mediated by transplanted donor T and NK cells that either recognise mismatch HLA molecules or polymorphic peptides, so-called minor histocompatibility antigens, leukaemia-associated or leukaemia-specific antigens in the patient and thus eliminate remaining leukaemic blasts. Nevertheless, the mature donor-derived cells often trigger graft-versus-host disease (GvHD), leading to severe damages in patients’ epithelial tissue, mainly skin, liver and intestine (Bleakley & Riddell, 2004). Therefore, approaches for the selective mediation of strong GvL effects are needed, also in order to prevent relapse after transplantation. One promising opportunity is the in vitro generation of AML-reactive CD4+ T cells for adoptive transfer. CD4+ T cells are advantageous compared to CD8+ T cells, as HLA class II molecules are under non-inflammatory conditions only expressed on haematopoietic cells; a fact that would minimise GvHD (Klein & Sato, 2000). In this study, naive CD4+ T cells were isolated from healthy donors and were successfully stimulated against primary AML blasts in mini-mixed lymphocyte/leukaemia cell cultures (mini-MLLC) in eight patient/donor pairs. After three to seven weekly restimulations, T cells were shown to produce TH1 type cytokines and to be partially of monoclonal origin according to their TCR Vβ chain usage. Furthermore, they exhibited lytic activity towards AML blasts, which was mediated by the release of granzymes A and B and perforin. The patient/donor pairs used in this study were fully HLA-class I matched, except for one pair, and also matched for HLA-DR and -DQ, whereas -DP was mismatched in one or both alleles, reflecting the actual donor selection procedure in the clinic (Begovich et al., 1992). Antibody blocking experiments suggested that the generated CD4+ T cells were directed against the HLA-DP mismatches, which could be confirmed by the recognition of donor-derived lymphoblastoid cell lines (LCLs) electroporated with the mismatched DP alleles. Under non-inflammatory conditions primary fibroblasts did not express HLA-DP and were thus not recognised, supporting the idea of a safer application of CD4+ T cells regarding induction of GvHD. For the assessment of the biological significance of these T cells, they were adoptively transferred into NSG mice engrafted with human AML blasts, where they migrated to the bone marrow and lymphoid tissue and succeeded in eliminating the leukaemic burden after only one week. Therefore, AML-reactive CD4+ T cells expanded from the naive compartment by in vitro stimulation with primary leukaemia blasts appear to be a potent tool for DLI in HSCT patients and promise to mediate specific GvL effects without causing GvHD.

Identifizierung und Charakterisierung von Zielantigenen alloreaktiver zytotoxischer T-Zellen mittels cDNA-Bank-Expressionsklonierung in akuten myeloischen Leukämien

Allogene hämatopoetische Stammzelltransplantationen (HSZTs) werden insbesondere zur Behandlung von Patienten mit Hochrisiko-Leukämien durchgeführt. Dabei bewirken T-Zellreaktionen gegen Minorhistokompatibilitätsantigene (mHAgs) sowohl den therapeutisch erwünschten graft-versus-leukemia (GvL)-Effekt als auch die schädigende graft-versus-host (GvH)-Erkrankung. Für die Identifizierung neuer mHAgs mittels des T-Zell-basierten cDNA-Expressionsscreenings waren leukämiereaktive T-Zellpopulationen durch Stimulation naïver CD8+-T-Lymphozyten gesunder HLA-Klasse I-identischer Buffy Coat-Spender mit Leukämiezellen von Patienten mit akuter myeloischer Leukämie (AML) generiert worden (Albrecht et al., Cancer Immunol. Immunother. 60:235, 2011). Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde mit diesen im AML-Modell des Patienten MZ529 das mHAg CYBA-72Y identifiziert. Es resultiert aus einem bekannten Einzelnukleotidpolymorphismus (rs4673: CYBA-242T/C) des Gens CYBA (kodierend für Cytochrom b-245 α-Polypeptid; syn.: p22phox), der zu einem Austausch von Tyrosin (Y) zu Histidin (H) an Aminosäureposition 72 führt. Das mHAg wurde von T-Lymphozyten sowohl in Assoziation mit HLA-B*15:01 als auch mit HLA-B*15:07 erkannt. Eine allogene T-Zellantwort gegen CYBA-72Y wurde in einem weiteren AML-Modell (MZ987) beobachtet, die ebenso wie in dem AML-Modell MZ529 polyklonal war. Insgesamt konnte bei drei von fünf getesteten HLA-B*15:01-positiven Buffy Coat-Spendern, die homozygot für CYBA-72H (H/H) waren, eine CYBA-72Y-spezifische T-Zellantwort generiert werden. Das von den T-Lymphozyten übereinstimmend in niedrigster Konzentration erkannte Peptid umfasste die Aminosäuren 69 - 77, wobei das homologe Peptid aus CYBA-72H auch in hohen Konzentrationen keine Reaktivität auslöste. Eine reziproke Immunogenität des mHAg ist bislang nicht belegt. T-Lymphozyten gegen CYBA-72Y erkannten Leukämiezellen bei acht von zwölf HLA-B*15:01-positiven Patienten (FAB-Subtypen: M1, M2, M4, M5). Da das Gen CYBA für eine Komponente des mikrobiziden Oxidasesystems von phagozytierenden Zellen kodiert, ist es überwiegend in Zellen des hämatopoetischen Systems exprimiert. Von Leukozytensubtypen, aufgereinigt aus HLA-B*15:01-positiven Buffy Coat-Spendern mit CYBA-242T-Allel, wurden Monozyten und daraus abgeleitete dendritische Zellen durch CYBA-72Y-reaktive T-Lymphozyten sehr stark, untransformierte B-Zellen in weit geringerem Maße und Granulozyten sowie T-Lymphozyten nicht erkannt. Das für CYBA-72Y kodierende Allel CYBA-242T wurde bei 56% aller getesteten gesunden Spender und Malignompatienten (n=481) nachgewiesen. Unter Berücksichtigung der Häufigkeit des präsentierenden HLA-Allels ist davon auszugehen, dass etwa 4,5% der Kaukasier das mHAg CYBA-72Y zusammen mit HLA-B*15:01 tragen. Nach bisherigen Beobachtungen führt ein immunogener CYBA-72Y-Mismatch bei allogenen HSZTs nicht notwendigerweise zu einer schweren GvH-Erkrankung. Das hier beschriebene mHAg CYBA-72Y erscheint potenziell geeignet, im Rahmen einer allogenen HSZT die präferenzielle Elimination der Empfänger-Hämatopoese unter Einschluss von myeloischen Leukämiezellen zu bewirken. Jedoch sind weiterführende Untersuchungen erforderlich, um die therapeutische Relevanz des Antigens zu belegen.

Safety and therapeutic efficacy of adoptive p53-specific T cell antigen receptor (TCR) gene transfer

Immunotherapy with T cells genetically modified by retroviral transfer of tumor-associated antigen (TAA)-specific T cell receptors (TCR) is a promising approach in targeting cancer. Therefore, using a universal TAA to target different tumor entities by only one therapeutic approach was the main criteria for our TAA-specific TCR. Here, an optimized (opt) αβ-chain p53(264-272)-specific and an opt single chain (sc) p53(264-272)-specific TCR were designed, to reduce mispairing reactions of endogenous and introduced TCR α and TCR β-chains, which might lead to off-target autoimmune reactions, similar to Graft-versus-host disease (GvHD). rnIn this study we evaluated the safety issues, which rise by the risk of p53TCR gene transfer-associated on/off-target toxicities as well as the anti-tumor response in vivo in a syngeneic HLA-A*0201 transgenic mouse model. We could successfully demonstrate that opt sc p53-specific TCR-redirected T cells prevent TCR mispairing-mediated lethal off-target autoimmunity in contrast to the parental opt αβ-chain p53-specific TCR. Since the sc p53-specific TCR proofed to be safe, all further studies were performed using sc p53-specific TCR redirected T cells only. Infusion of p53-specific TCR-redirected T cells in Human p53 knock-in (Hupki) mice after lymphodepletion-preconditioning regimen with either sublethal body irradiation (5Gy) or chemotherapy (fludarabine and cyclophosphamide) in combination with vaccination (anti-CD40, CpG1668 and p53(257-282) peptide) did not result in a depletion of hematopoietic cells. Moreover, adoptive transfer of high numbers of p53-specific TCR-redirected T cells in combination with Interleukin 2 (IL-2) also did not lead to toxic on-target reactions. The absence of host tissue damage was confirmed by histology and flow cytometry analysis. Furthermore, p53-specific TCR-redirected T cells were able to lyse p53+A2.1+ tumor cells in vitro. However, in vivo studies revealed the potent suppressive effect of the tumor microenvironment (TME) mediated by tumor-infiltrating myeloid-derived suppressor cells (MDSC). Accordingly, we could improve an insufficient anti-tumor response in vivo after injection of the sc p53-specific TCR-redirected T cells by additional depletion of immunosuppressive cells of the myeloid lineage.rnTogether, these data suggest that the optimized sc p53(264-272)-specific TCR may represent a safe and efficient approach for TCR-based gene therapy. However, combinations of immunotherapeutic strategies are needed to enhance the efficacy of adoptive cell therapy (ACT)-mediated anti-tumor responses.

Analyse der Wirkung des Naturstoffes Oxacyclododecindion in einem chronisch-inflammatorischen Krankheitsmodell

Die medikamentöse Standardtherapie entzündlich-rheumatischer Erkrankungen wie der rheumatoider Arthritis (RA) und des systemischen Lupus erythematodes (SLE) sind oft unzureichend und erlauben keine nebenwirkungsarme beziehungsweise -freie Behandlung. Daher ist es von großem Interesse für diese Indikationsgebiete, wirkungsvolle Substanzen zu entwickeln, die für eine Langzeittherapie geeignet sind. Naturstoffe wie Oxacyclododecindion (Oxa) können dabei als mögliche Leitstruktur dienen. Oxa wurde bereits in in-vitro Untersuchungen als ein potenter Inhibitor der Expression von proinflammatorischen und profibrotischen Genen identifiziert. rnZiel dieser Arbeit war es in in-vivo Modellen der RA und des SLEs das therapeutische Potential des Naturstoffes Oxa aufzuklären. Da eine Etablierung der Kollagen-induzierten Arthritis im untersuchten murinen RA-Modell, dem HLA-DR4.AE° Stamm, nicht möglich war, wurden die Untersuchungen ausschließlich im MRL Faslpr Mausstamm, einem anerkannten SLE-Modell durchgeführt. MRL Faslpr Mäuse entwickeln wie SLE-Patienten unter anderem eine schwerwiegende Glomerulonephritis. rnIn den Nieren weiblicher MRL Faslpr Mäuse konnte die Oxa-Behandlung die Expression zahlreicher proinflammatorischer Mediatoren beeinflussen, die in Zusammenhang mit der Pathogenese des humanen SLE gebracht werden. So reduziert der Naturstoff die Expression von Zytokinen wie TNFα, IFNγ und IL6 als auch Chemokinen wie CCL2, CSF-1 und RANTES auf mRNA- und Proteinebene. Dabei war die Wirkung von Oxa in den in-vivo Analysen ähnlich gut wie die des potenten Glukokortikoids Dexamethason. Die Reduktion chemotaktischer Moleküle durch die Oxa-Behandlung führte nachweislich zu einer reduzierten Akkumulation von Immunzellen. Die anti-inflammatorischen und immunmodulatorischen Effekte von Oxa waren so ausgeprägt, dass klinisch-pathologische Marker der Glomerulonephritis, wie die Ablagerung von Immunkomplexen, die vermehrte Bildung von Kollagenfasern und die Ausscheidung von Proteinen im Urin gemildert wurden. Weiterführende Untersuchungen im SLE Modell konnten neue Zielmoleküle von Oxa identifizieren, wie KIM1 und zahlreiche SLE-assoziierte microRNAs (miR 19a, 29c und 369). Diese Befunde legen nahe, dass Oxa eine vielversprechende anti-entzündliche und -fibrotische Verbindung darstellt. rnDie Entschlüsselung des Wirkmechanismus von Oxa steht erst am Anfang. Die Analysen im Rahmen dieser Arbeit zeigten jedoch, dass Oxa einen Einfluss auf die Phosphorylierung und somit Aktivierung der p38 MAPK sowie auf die mRNA-Stabilität von proinflammatorischen Zytokinen wie TNFα zu haben scheint.rn

Narcolepsy: autoimmunity, effector T cell activation due to infection, or T cell independent, major histocompatibility complex class II induced neuronal loss?

Human narcolepsy with cataplexy is a neurological disorder, which develops due to a deficiency in hypocretin producing neurons in the hypothalamus. There is a strong association with human leucocyte antigens HLA-DR2 and HLA-DQB1*0602. The disease typically starts in adolescence. Recent developments in narcolepsy research support the hypothesis of narcolepsy being an immune-mediated disease. Narcolepsy is associated with polymorphisms of the genes encoding T cell receptor alpha chain, tumour necrosis factor alpha and tumour necrosis factor receptor II. Moreover the rate of streptococcal infection is increased at onset of narcolepsy. The hallmarks of anti-self reactions in the tissue--namely upregulation of major histocompatibility antigens and lymphocyte infiltrates--are missing in the hypothalamus. These findings are questionable because they were obtained by analyses performed many years after onset of disease. In some patients with narcolepsy autoantibodies to Tribbles homolog 2, which is expressed by hypocretin neurons, have been detected recently. Immune-mediated destruction of hypocretin producing neurons may be mediated by microglia/macrophages that become activated either by autoantigen specific CD4(+) T cells or superantigen stimulated CD8(+) T cells, or independent of T cells by activation of DQB1*0602 signalling. Activation of microglia and macrophages may lead to the release of neurotoxic molecules such as quinolinic acid, which has been shown to cause selective destruction of hypocretin neurons in the hypothalamus.

Humoral immune response to ADAMTS13 in acquired thrombotic thrombocytopenic purpura

The apparently spontaneous development of autoantibodies to ADAMTS13 in previously healthy individuals is a major cause of thrombotic thrombocytopenic purpura (TTP). Epitope mapping studies have shown that in most patients antibodies directed towards the spacer domain of ADAMTS13 are present. A single antigenic surface comprising Arg(660) , Tyr(661) and Tyr(665) that contributes to the productive binding of ADAMTS13 to unfolded von Willebrand factor is targeted by anti-spacer domain antibodies. Antibodies directed to the carboxyl-terminal CUB1-2 and TSP2-8 domains have also been observed in the plasma of patients with acquired TTP. As yet it has not been established whether this class of antibodies modulates ADAMTS13 activity. Inspection of the primary sequence of human monoclonal anti-ADAMTS13 antibodies suggests that the variable heavy chain germline gene segment VH1-69 is frequently incorporated. We suggest a model in which 'shape complementarity' between the spacer domain and residues encoded by the VH1-69 gene segment explain the preferential use of this variable heavy chain gene segment. Finally, a model is presented for the development of anti-ADAMTS13 antibodies in previously healthy individuals that incorporates the recent identification of HLA DRB1*11 as a risk factor for acquired TTP.

Effect of immune pressure on hepatitis C virus evolution: insights from a single-source outbreak

The host's immune response to hepatitis C virus (HCV) can result in the selection of characteristic mutations (adaptations) that enable the virus to escape this response. The ability of the virus to mutate at these sites is dependent on the incoming virus, the fitness cost incurred by the mutation, and the benefit to the virus in escaping the response. Studies examining viral adaptation in chronic HCV infection have shown that these characteristic immune escape mutations can be observed at the population level as human leukocyte antigen (HLA)-specific viral polymorphisms. We examined 63 individuals with chronic HCV infection who were infected from a single HCV genotype 1b source. Our aim was to determine the extent to which the host's immune pressure affects HCV diversity and the ways in which the sequence of the incoming virus, including preexisting escape mutations, can influence subsequent mutations in recipients and infection outcomes. Conclusion: HCV sequences from these individuals revealed 29 significant associations between specific HLA types within the new hosts and variations within their viruses, which likely represent new viral adaptations. These associations did not overlap with previously reported adaptations for genotypes 1a and 3a and possibly reflected a combination of constraint due to the incoming virus and genetic distance between the strains. However, these sites accounted for only a portion of the sites in which viral diversity was observed in the new hosts. Furthermore, preexisting viral adaptations in the incoming (source) virus likely influenced the outcomes in the new hosts.

Immune pathomechanism of drug hypersensitivity reactions

Drug hypersensitivity research has progressed enormously in recent years, and a greater understanding of mechanisms has contributed to improved drug safety. Progress has been made in genetics, enabling personalized medicine for certain drugs, and in understanding drug interactions with the immune system. In a recent meeting in Rome, the clinical, chemical, pharmacologic, immunologic, and genetic aspects of drug hypersensitivity were discussed, and certain aspects are briefly summarized here. Small chemicals, including drugs, can induce immune reactions by binding as a hapten to a carrier protein. Park (Liverpool, England) demonstrated (1) that drug haptens bind to protein in patients in a highly restricted manner and (2) that irreversibly modified carrier proteins are able to stimulate CD4(+) and CD8(+) T cells from hypersensitive patients. Drug haptens might also stimulate cells of the innate immune system, in particular dendritic cells, and thus give rise to a complex and complete immune reaction. Many drugs do not have hapten-like characteristics but might gain them on metabolism (so-called prohaptens). The group of Naisbitt found that the stimulation of dendritic cells and T cells can occur as a consequence of the transformation of a prohapten to a hapten in antigen-presenting cells and as such explain the immune-stimulatory capacity of prohaptens. The striking association between HLA-B alleles and the development of certain drug reactions was discussed in detail. Mallal (Perth, Australia) elegantly described a highly restricted HLA-B∗5701-specific T-cell response in abacavir-hypersensitive patients and healthy volunteers expressing HLA-B∗5701 but not closely related alleles. Expression of HLA-B∗1502 is a marker known to be necessary but not sufficient to predict carbamazepine-induced Stevens-Johnson syndrome/toxic epidermal necrolysis in Han Chinese. The group of Chen and Hong (Taiwan) described the possible "missing link" because they showed that the presence of certain T-cell receptor (TCR) clonotypes was necessary to elicit T-cell responses to carbamazepine. The role of TCRs in drug binding was also emphasized by Pichler (Bern, Switzerland). Following up on their "pharmacological interactions of drugs with immune receptors" concept (p-i concept), namely that drugs can bind directly to TCRs, MHC molecules, or both and thereby stimulate T cells, they looked for drug-binding sites for the drug sulfamethoxazole in drug-specific TCRs: modeling revealed up to 7 binding sites on the CDR3 and CDR2 regions of TCR Vα and Vβ. Among many other presentations, the important role of regulatory T cells in drug hypersensitivity was addressed.

Etiology and pathogenesis of adverse drug reactions

In clinical routine, adverse drug reactions (ADR) are common, and they should be included in the differential diagnosis in all patients undergoing drug treatment. Only part of those ADR are immune-mediated hypersensitivity reactions and thus true drug allergies. Far more common are non-immune-mediated ADR, e.g. due to the pharmacological properties of the drug or to the individual predisposition of the patient (enzymopathies, cytokine dysbalance, mast cell hyperreactivity). In true drug allergiesT cell- and immunoglobulin E (lgE)-mediated reactions dominate the clinical presentation. T cell-mediated ADR usually have a delayed appearance and include skin eruptions in most cases. Nevertheless, it should not be forgotten that they may involve systemic T cell activation and thus take a severe, sometimes lethal turn. Clinical danger signs are involvement of mucosal surfaces, blistering within the exanthematous skin areas and systemic symptoms, e.g. fever or malaise. Drug presentation via antigen-presenting cells to T cells can either involve the classical pathway of haptenization of endogenous proteins or be directly mediated via noncovalent binding to immune receptors (MHC molecules or T cell receptors), the so-called p-i concept. Flare-up reactions during the acute phase of T cell-mediated ADR should not be mistaken for true drug allergies, as they only occur in the setting of a highly activated T cell pool. IgE-mediated ADR are less frequent and involve mast cells and/or basophils as peripheral effector cells. Recent data suggest that certain patients with drug allergy have a preexistent sensitization although they have never been exposed to the culprit drug, probably due to cross-reactivity. Thus, allergic drug reactions on first encounter are possible. In general, the extent of cross-reactivity is higher in IgE-compared to T cell-mediated ADR. Based on a specific ethnic background and only for severe T cell-mediated ADR to certain drugs, a strong HLA association has been established recently.