New roles of Rab GTPases on eye diseases: targeting VEGF secretion

RESUMO: A retina é composta, entre outras estruturas, pelo epitélio pigmentar da retina (EPR)e pela coróide. A região central da retina denomina-se mácula, e é a zona mais afetada na degenerescência macular relacionada com a idade, a forma mais comum de degenerescência da retina. Nesta doença, a secreção de fatores de crescimento pelo EPR é afetada, nomeadamente a do fator de crescimento vascular endotelial (VEGF), e pouco se sabe ainda sobre os mecanismos moleculares conducentes a esta condição. A família de proteínas Rab GTPases está envolvida nas vias intracelulares de sinalização e tráfego membranares, essenciais na transdução de sinais extracelulares em respostas biológicas. A sua crucial importância nestes mecanismos levou-nos a considerar o seu potencial envolvimento nas vias de secreção do VEGF, e a questionar-nos se teriam algum papel regulador sobre as mesmas. O principal objetivo deste trabalho é identificar Rab GTPases importantes para as vias de secreção e endocitose do VEGF no EPR. Essa identificação ajudará a esclarecer a patogénese da degenerescência macular da retina, e poderá servir para uma procura mais direcionada de novos agentes terapêuticos. A caracterização de dois modelos in vitro do EPR, células primárias isoladas de murganho e a linha celular B6-RPE07,levou-nos a concluir que são ambos semelhantes. Contudo, a linha celular foi escolhida como protótipo do EPR por permitir o acesso a um número ilimitado de células. No decurso deste trabalho, desenvolvemos e caracterizámos uma biblioteca de ferramentas moleculares que nos permitiram reduzir os níveis proteicos das proteínas Rab GTPases, com base na tecnologia de ácido ribonucleico (ARN) de interferência. O papel das proteínas Rab GTPases na secreção do VEGF no EPR foi estudado com base no silenciamento de apenas uma proteína, ou combinando várias, segundo a sua localização e funções intracelulares descritas. Este trabalho permitiu-nos concluir que as proteínas Rab GTPases são importantes intervenientes no processo de secreção de VEGF pelo EPR, e confirmar dados anteriores que relatam o envolvimento de algumas Rab GTPases endocíticas no processo. Propomos ainda um novo modelo para a interação destas proteínas no EPR, e sugerimos que a Rab10 e a Rab14 atuam negativamente sobre a Rab8, controlando o seu funcionamento. Os nossos resultados evidenciam a importância das proteínas Rab GTPases na secreção do VEGF pelas células do EPR, e servem de base a futuros estudos que melhor procurem compreender este mecanismo e de que modo a sua alteração se relaciona com a degenerescência da retina.--------ABSTRACT: Retinal pigment epithelium (RPE) and choroid are components of the mammalian retina, of which the central region is called macula. The most common form of retinaldegeneration, age-related macular degeneration (AMD), involves primarily deregulation of growth factors secretion by the RPE. Very little is known about the molecular mechanisms that lead to impairment of RPE’s homeostatic intracellular processes, namely the secretion of vascular endothelial growth factor (VEGF). Rab GTPases’ family regulates membrane targeting and traffic, being essential in the transduction of signal pathways. Given Rab proteins’ role in intracellular trafficking, we propose to identify key regulatory Rab proteins involved in either the secretory or the recycling pathways of VEGF in RPE. Understanding how Rab proteins’ function disruption could lead to retinal and choroidal pathology would ultimately contribute to find new therapeutic agents. Here, we characterized two mouse RPE in vitro cell models, primary cells and B6-RPE07 cell line, and concluded that both display important epithelial features as the RPE presents in vivo. Considering unlimited cell number and results reproducibility, we chose B6-RPE07 cells to further study Rab proteins’ function. To scrutinize the consequences of Rab proteins’ absence or diminished levels, we have developed novel molecular tools to achieve silencing of these key proteins using miRNA technology. We further addressed the effect of Rab proteins’ absence on VEGF secretion by performing an extensive screening where different Rab proteins were silenced, both individually and in multiple combinations considering their cellular/ compartment location. We conclude that Rab GTPases are important intervenients in VEGF secretion by RPE cells, confirming endocytic Rab proteins’ role in regulation of VEGF biology. We also propose a novel model for Rab proteins’ interaction in RPE. Our results suggest that Rab10 and Rab14 might influence Rab8 in a negative feedback mechanism, important for controlling VEGF secretion. Our achievements’ unravel Rab proteins’ role in VEGF secretion by RPE cells and are the basis for future studies to better understand RPE molecular secretory machinery.

Madeira para peletes ou para construção/incorporação em habitações: qual a melhor opção na perspetiva da redução da emissão de GEE?

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Energia e Bioenergia

Rede de mobilidade suave de Azeitão – integração na estrutura ecológica municipal e contributo para uma infraestrutura verde local

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Engenharia do Ambiente

Microencapsulação de bactérias lácticas com potencial probiótico para produção de pasta de azeitona

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Tecnologia e Segurança Alimentar/Qualidade Alimentar

Avaliação in vitro e in vivo da atividade antimalárica dos trioxolanos NAC89, LDC67 e LC50 em estirpes sensíveis e resistentes à artemisinina e ao artesunato.

A malária mantem-se como uma das doenças mais importantes do mundo, causando a morte de mais de 1 milhão de pessoas anualmente e elevada morbilidade. Face à propagação da resistência do Plasmodium falciparum à maioria dos medicamentos antimaláricos disponíveis, a Organização Mundial de Saúde (OMS), desde 2006, recomenda a utilização de terapias combinadas com artemisinina (ACTs) como tratamento de primeira linha para a malária não complicada. Em 2008, relatórios clínicos revelaram a falha terapêutica dos ACTs na fronteira Tailândia-Camboja e uma vez que não existem alternativas para o tratamento da malária é fundamental manter linhas de investigação sobre novos e eficazes fármacos. A partir da artemisinina (ART) surgiram novos peróxidos designados trioxolanos que apresentam como farmacóforo a função 1,2,4-trioxano. A acessibilidade, a preparação relativamente económica e a estabilidade da função 1,2,4-trioxano permite a síntese de derivados com estruturas diversas, alargando a possibilidade de desenvolvimento de novos fármacos. Foram realizados testes in vitro de triagem com o MARK III (OMS micro-ensaio), com controlos positivos (artemisinina e dihidroartemisinina) e controlo negativo (sem fármaco). Foram efetuados ensaios diversos com 3 compostos, aqui denominados NAC89, LCD67 e LC50 em culturas da estirpe de P. falciparum (Dd2) para avaliação da atividade antimalárica dos compostos, bem como ensaios utilizando o modelo de malária de murino, Plasmodium chabaudi, com 4 estirpes, denominadas AS-3CQ, AS-ATN, respectivamente sensível e resistente ao artesunato (ATN) e AS-30CQ e AS-ART respectivamente sensível e resistente à (ART). Também foi avaliada a citotoxicidade dos compostos, utilizando células HepG2 de hepatoma humano pelo ensaio com método colorimétrico metil-tiazol-tetrazólico (MTT). No modelo murino compararam-se também duas vias de administração dos novos compostos, sendo uma por via subcutânea nos 3 compostos e outra por via tópica apenas para LC50. A verificação de cura foi efetuada por observação microscópica de esfregaços sanguíneos corados pelo método de Giemsa e determinação da parasitemia. Os resultados observados foram: a) baixa citotoxicidade dos três compostos; b) o composto LC50 eliminou a parasitémia nos ensaios in vitro em cultivos de P. falciparum bem como eliminou P. chabaudi nos tratamentos por via subcutânea e tópica na dose de 50 mg/kg e na dose de 10 mg/Kg na via subcutânea; c) o NAC89 mostrou boa atividade no mesmo ensaio in vivo, na dose de 10 mg/Kg e 50 mg/Kg por via subcutânea; d) fraca atividade para LCD67 na dose de 50 mg/Kg. O LC50 e o NAC89 foram muito eficazes contra parasitas resistentes ao ATN e à ART sugerindo novos mecanismos de ação. Assim, este trabalho de investigação trouxe resultados promissores na àrea de potenciais novos antimaláricos.

Síntese e caracterização de polímeros electrocrómicos para possíveis aplicações em embalagens inteligentes

Dissertação apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa para obtenção do Grau de Mestre em Tecnologia e Segurança Alimentar

Aspectos epidemiológicos e clínicos dos acidentes ofídicos ocorridos nos municípios do Estado do Amazonas

No Amazonas, o acidente ofídico é um problema de saúde pública pouco conhecido. Por este motivo, foi realizado um estudo descritivo dos acidentes ofídicos atendidos nas Unidades de Saúde de 34 municípios, um distrito e dois pelotões de fronteira do Estado do Amazonas. As características mais comuns encontradas dentre os pacientes foram: agricultor (50,4%), do sexo masculino (81,3%), em idade produtiva (72,1%), picado no membro inferior (88,5%), por jararaca (48,6%) ou surucucu (46,8%), na zona rural de seu município (70,2%) e que só recebeu atendimento médico em tempo superior a seis horas, após acidente (57,3%). As manifestações locais mais freqüentes foram: edema (76,9%), dor (68,7%), eritema (10,2%) e hemorragia (9,3%). Hemorragia (18,8%) foi a manifestação sistêmica mais freqüente. O antiveneno foi administrado em apenas 65,9% dos pacientes. A via mais utilizada foi a endovenosa (52,3%), sendo relevante o uso de vias não mais recomendadas (47,7%). O antiveneno administrado, na maioria dos pacientes, foi o antibotrópico (66,7%). As complicações mais freqüentes foram abcesso (13,7%), necrose (12,3%), infecção secundária (8,3%), insuficiência renal (2,5%) e gangrena (2,5%). Os procedimentos médicos mais usados para o tratamento das complicações foram: drenagem (52,6%), debridamento (28,9%), amputação (10,5%), limpeza cirúrgica (5,3%) e diálise peritoneal (2,6%). A letalidade foi de 1%.

Caracterização preliminar da bioenergética do efluxo pelo sistema AcrAB-TolC EM Escherichia Coli

A resistência aos antibióticos em bactérias Gram-negativas pode ser aumentada pela extrusão de antibióticos através de sistemas de efluxo. Em Escherichia coli, o principal sistema de efluxo é o AcrAB-TolC o qual tem como principal fonte energética a força proto-motriz. Este trabalho pretendeu estudar alguns aspectos essenciais da bioenergética na actividade de efluxo de E. coli usando três estirpes bem caracterizadas genotipica e fenotipicamente. Foi utilizado um método fluorimétrico semi-automático no qual a fluorescência do fluorocromo brometo de etídeo, substrato de bombas de efluxo foi seguida, permitindo a medição em tempo real da actividade de efluxo e acumulação de fluorocromo (inibição do efluxo). A utilização de brometo de etídeo é particularmente vantajosa pois emite baixa fluorescência no exterior da célula bacteriana tornando-se extremamente fluorescente no seu interior. Este método é uma nova aplicação do termociclador em tempo real RotorGeneTM 3000 que permite o cálculo da cinética de transporte reflectindo o balanço entre acumulação de substrato por difusão passiva através da membrana e a sua extrusão/efluxo, proporcionando uma detecção rápida e económica de inibidores de efluxo. Os resultados obtidos mostram, para todas as estirpes, que a GLU e o pH afectam a acumulação e o efluxo do brometo de etídeo. De todos os inibidores de vias biossintéticas testados, o ortovanadato de sódio, foi o que demonstrou maior actividade inibitória, a qual é revertida na presença de GLU. Em conclusão, este estudo mostra que a actividade de efluxo de E. coli depende não só da fosforilação oxidativa por via da força proto-motriz mas também da energia proveniente da hidrólise de ATP pelas ATPases. O ortovanadato de sódio tem potencial para ser um novo inibidor de bombas de efluxo de largo espectro. A tecnologia utilizada neste trabalho demonstrou ser apropriada para a caracterização bioenergética da actividade de bombas de efluxo e permite a selecção de novos inibidores de bombas de efluxo em bactérias.

Infecção por chlamydia trachomatis: conhecimentos, atitudes e práticas de uma população de estudantes universitários das áreas da saúde

A infecção sexualmente transmissível (IST), causada por Chlamydia trachomatis, é considerada mundialmente como um importante problema de saúde pública, porque pode causar infertilidade e morbilidade a longo termo, existindo a possibilidade de transmissão ao recém-nascido de mãe infectada. Os indivíduos entre os 15 e os 24 anos de idade são os que se encontram em maior risco. Para além das suas consequências, a presença desta infecção sem tratamento pode potenciar até dez vezes a transmissão do vírus da imunodeficiência humana adquirida. Contribuindo a consciencialização sobre os vários aspectos da saúde sexual e o conhecimento sobre este agente e suas sequelas para que os jovens em risco se protejam e admitindo o Plano Nacional de Saúde lacunas no conhecimento dos profissionais da área sobre este tema, o presente trabalho teve como objectivos: 1) estudar o conhecimento sobre a infecção por C. trachomatis, sinais, sintomas, sequelas e vias de transmissão das IST; 2) conhecer as atitudes e práticas associadas à transmissão de IST e 3) avaliar a prevalência da infecção por C. trachomatis e Neisseria gonorrhoeae numa população de estudantes universitários das áreas da Saúde. Para tal, utilizou-se um questionário, cuja avaliação sugeriu que estes jovens possuem um baixo conhecimento sobre os sinais, sintomas e sequelas deste agente e das outras IST, sendo preocupante verificar que existem estudantes que não reconhecem os diferentes tipos de relação sexual como vias de transmissão destas infecções. A pesquisa dos microrganismos citados, efectuou-se através da aplicação de uma técnica de biologia molecular em amostras de urina e a presença de anticorpos anti-C. trachomatis efectuou-se através uma técnica de imunofluorescência indirecta no soro. Não foram identificados casos de infecção activa, mas registou-se uma taxa de 14,4% de títulos reactivos de anticorpos anti-C. trachomatis, o que indica uma percentagem considerável desta população já foi infectada por este agente. Estudos futuros semelhantes a este, em diferentes populações, são necessários para avaliar a prevalência global de infecção por C. trachomatis em Portugal, assim como para relacionar as atitudes e práticas com a transmissão das IST e com o conhecimento entre a população portuguesa. Medidas básicas de prevenção como a informação à população parecem ser urgentemente necessárias.

Hepatite D

O vírus da hepatite D (VHD), também chamado de vírus delta, é um pequeno vírus contendo RNA circular. O VHD causa infecção, quando há coinfecção com o vírus da hepatite B (VHB) em indivíduos normais ou superinfecção em portadores crônicos do VHB. Três genótipos já foram clonados e seqüenciados. A infecção apresenta distribuição mundial, sendo a região ocidental da Amazônia brasileira considerada área de alta endemicidade. Estima-se que 18 milhões de pessoas encontram-se infectadas pelo vírus entre os 350 milhões de portadores crônicos do VHB no mundo. As vias de transmissão do VHD e os fatores de risco mostram-se similares aos da infecção pelo VHB. O diagnóstico se faz pela identificação imuno-histológica do HDAg no fígado e pelo encontro das frações IgM e IgG anti-HD no soro por radioimunoensaio ou ELISA. O curso clínico da infecção pelo VHD mostra-se variável. Os pacientes podem apresentar formas fulminantes de hepatite. As formas crônicas associam-se a achados histopatológicos graves no fígado, com curso rápido e progressivo, evoluindo para cirrose, insuficiência hepática e morte. O interferon alfa constitui a única opção terapêutica com algum efeito benéfico no tratamento da hepatite. O transplante hepático encontra indicação nos casos terminais de cirrose. A profilaxia indireta da infecção pelo VHD tornou-se possível com o advento da vacina contra o vírus da hepatite B.

Lean no sistema de gestão de conservação e manutenção de auto-estradas

Dissertação para obtenção do Grau Mestre em Engenharia Civil – Perfil de Construção

Miocardiopatia dilatada em pacientes com infecção chagásica crônica: relato de dois casos fatais autóctones do Rio Negro, Estado do Amazonas

Dois casos fatais de miocardiopatia chagásica crônica dilatada são relatados pela primeira vez em pacientes autóctones do rio Negro, Estado do Amazonas. Ambos os casos, um homem de 45 anos de idade e uma mulher de 44, nasceram e viveram toda a vida na região do Rio Negro, no norte do estado do Amazonas, tendo sido picados numerosas vezes por triatomineos silvestres em piaçabais da área. Os pacientes que tiveram as reações sorológicas positivas para anticorpos anti-Trypanosoma cruzi (imunofluorescência, ELISA e Wertern blot) desenvolveram nos últimos 5-7 anos um quadro de insuficiência cardíaca progressivo, com aumento global da área cardíaca, bloqueios atrioventricular e de ramo esquerdo e extrassístoles ventriculares, faleceram de insuficiência cardíaca irreversível. Um dos casos em que foi feita a biópsia cardíaca cirúrgica pós-mortem, mostrou na histopatologia, miocardite crônica com infiltrado mononuclear difuso, com áreas de adensamento celular, fibrose, dissociação, fragmentação e hialinização de fibras cardíacas, sugestivo de miocardite chagásica crônica e o PCR in situ foi positivo para Trypanosoma cruzi.

Métodos de auscultação não destrutivos aplicados na avaliação da capacidade de carga de infraestruturas ferroviárias

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Engenharia Civil – Perfil Estruturas e Geotecnia

Caracterização do papel do gene bola: consequências na motilidade bacteriana e formação de biofilmes

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Microbiologia Médica

Medidas de acalmia de tráfego em áreas urbanas consolidadas: Um caso no concelho do Seixal

Dissertação de Mestrado em Metropolização, Planeamento Estratégico e Sustentabilidade