Studi funzionali e strutturali sul wildtype e sul mutante γM23-K della ATP sintasi di Rhodobacter capsulatus: ruolo dell'ADP e della forza protonmotiva nell'attivazione dell’enzima e nell'accoppiamento dell'idrolisi di ATP alla traslocazione protonica

Nel presente lavoro di tesi sono state messe a confronto le ATP sintasi wild-type e γM23-K in cromatofori del batterio fotosintetico Rhodobacter capsulatus sotto gli aspetti funzionale e regolatorio. Si pensava inizialmente che la mutazione, in base a studi riportati in letteratura condotti sull’omologa mutazione in E. coli, avrebbe indotto disaccoppiamento intrinseco nell’enzima. Il presente lavoro ha chiarito che il principale effetto della mutazione è un significativo aumento dell’affinità dell’enzima per l’ADP inibitorio, che ne determina il ridotto livello di ATP idrolisi e la rapidissima reinattivazione in seguito ad attivazione da forza protonmotiva. Il residuo 23 della subunità γ si trova posizionato in prossimità della regione conservata DEELSED carica negativamente della subunità β, e l’introduzione nel mutante di una ulteriore carica positiva potrebbe determinare una maggiore richiesta di energia per indurre l’apertura del sito catalitico. Un’analisi quantitativa dei dati di proton pumping condotta mediante inibizione parziale dell’idrolisi del wildtype ha inoltre mostrato come il grado di accoppiamento del mutante in condizioni standard non differisca sostanzialmente da quello del wild-type. D’altro canto, è stato recentemente osservato come un disaccoppiamento intrinseco possa venire osservato in condizioni opportune anche nel wild-type, e cioè a basse concentrazioni di ADP e Pi. Nel presente lavoro di tesi si è dimostrato come nel mutante l’osservazione del fenomeno del disaccoppiamento intrinseco sia facilitata rispetto al wild-type. È stato proprio nell’ambito delle misure condotte sul mutante che è stato possibile dimostrare per la prima volta il ruolo fondamentale della componente elettrica della forza protonmotiva nel mantenere lo stato enzimatico ad elevato accoppiamento. Tale ruolo è stato successivamente messo in luce anche nel wild-type, in parte anche grazie all’uso di inibitori specifici di F1 e di FO. Il disaccoppiamento intrinseco nel wild-type è stato ulteriormente esaminato anche nella sua dipendenza dalla rimozione di ADP e Pi; in particolare, oltre all’amina fluorescente ACMA, è stata utilizzata come sonda di ΔpH anche la 9-aminoacridina e come sonda di Δψ l’Oxonolo VI. In entrambi i casi il ruolo accoppiante di questi due ligandi è stato confermato, inoltre utilizzando la 9-aminoacridina è stato possibile calibrare il segnale di fluorescenza con salti acido-base, dando quindi una base quantitativa ai dati ottenuti. Noi riteniamo che il più probabile candidato strutturale coinvolto in questi cambiamenti di stato enzimatici sia la subunità ε, di cui è noto il coinvolgimento in processi di regolazione e in cambiamenti strutturali indotti da nucleotidi e dalla forza protonmotiva. In collaborazione con il Dipartimento di Chimica Fisica dell’Università di Friburgo è in atto un progetto per studiare i cambiamenti strutturali presumibilmente associati al disaccoppiamento intrinseco tramite FRET in singola molecola di complessi ATP-sintasici marcati con fluorofori sia sulla subunità ε che sulla subunità γ. Nell’ambito di questa tesi sono stati creati a questo fine alcuni doppi mutanti cisteinici ed è stato messo a punto un protocollo per la loro marcatura con sonde fluorescenti.

Analisi della rete di trasporto di Manduria: implementazione di un modello di simulazione

Il sistema viabile rappresenta una parte fondamentale nella dinamica dei trasporti al servizio della mobilità di trasporti e merci. La mobilità, ha fatto registrare ritmi di crescita sostenuti nel corso degli anni. Le trasformazioni sociali, del mercato del lavoro, lo sviluppo produttivo e commerciale, la posizione baricentrica tra le province jonca salentina e brindisina fanno di Manduria, una realtà dove è necessario prestare attenzione al sistema dei trasporti. Tuttavia la rete statale di vecchio stampo che risulta utilizzata, soprattutto da quote di mobilità interprovinciale per questioni di economicità del percorso e dal momento che manca una rete viaria ordinaria funzionale e scorrevole che colleghi in modo capillare il territorio fanno si che la Strada Statale 7ter risulti congestionata in maniera diffusa. La Superstrada di nuova costruzione sarebbe potuta essere un importante arteria stradale allacciandosi alla SS Taranto Brindisi Lecce collegando il sud della provincia Jonica in modo capillare ai comuni della provincia Taranto e Lecce, la quale non è stata ultimata ed avrebbe rappresentato una valida alternativa alla statale esistenti. Oltre a favorire i collegamenti tra il territorio jonico, brindisino e quello salentino, tale intervento sarebbe stato necessario per ridurre la componente di traffico di attraversamento di una serie di centri urbani, tra cui il Comune di Manduria. In questa tesi, sulla base dei dati raccolti dall’ultimo censimento nell’ambito provinciale e del Comune di Manduria, verrà implementato il funzionamento del Piano del Traffico stradale del Comune di Manduria e verranno condotte delle simulazioni, con l’ausilio del software di pianificazione di sistemi di trasporto stradale Omnitrans, versione demo, scaricabile gratuitamente dal sito www.omnitrans-international.com. Si ricercheranno stime sul funzionamento della rete, valutando la congestione del traffico ed eventualmente in termini di aumento della sicurezza e riduzione dell’inquinamento atmosferico.