Analysis of outcome and cancer stem cells status in patients with resectable pancreatic adenocarcinoma

RESUMO: Actualmente, a única possibilidade de cura para doentes com adenocarcinoma do pâncreas (PDAC) é a ressecção cirúrgica, no início deste estudo, perguntamo-nos se os predictores clínico-patológicos clássicos de prognostico poderiam ser validados em uma grande cohort de doentes com cancro do pâncreas ressecável e se outros predictores clínicos poderiam ter um papel na decisão de que doentes beneficiariam de ressecção cirúrgica. No capítulo 2, observamos que até 30% dos doentes morrem no primeiro ano após a ressecção cirúrgica, pelo que o nosso objectivo foi determinar factores pré-operatórios que se correlacionam com mortalidade precoce após ressecação cirúrgica com recurso a um instrumento estatisticamente validado, o Charlson-Age Comorbidity Index (CACI), determinamos que um CACI score superior a 4 foi preditivo de internamentos prolongados (p <0,001), complicações pós-operatórias (p = 0,042), e mortalidade em 1 ano pós- ressecção cirúrgica (p <0,001). Um CACI superior a 6 triplicou a mortalidade no primeiro ano pós-cirurgia e estes doentes têm menos de 50% de probabilidade de estarem vivos um ano após a cirurgia. No capítulo 3, o nosso objectivo foi identificar uma proteína de superfície que se correlacionasse estatisticamente com o prognostico de doentes com adenocarcinoma do pâncreas e permitisse a distinção de subgrupos de doentes de acordo com as suas diferenças moleculares, perguntamo-nos ainda se essa proteína poderia ser um marcador de células-estaminais. No nosso trabalho anterior observamos que as células tumorais na circulação sanguínea apresentavam genes com características bifenotípica epitelial e mesenquimal, enriquecimento para genes de células estaminais (ALDH1A1 / ALDH1A2 e KLF4), e uma super-expressão de genes da matriz extracelular (colagénios, SPARC, e DCN) normalmente identificados no estroma de PDAC. Após a avaliação dos tumores primários com RNA-ISH, muitos dos genes identificados, foram encontrados co-localizando em uma sub-população de células na região basal dos ductos pancreáticos malignos. Além disso, observamos que estas células expressam o marcador SV2A neuroendócrino, e o marcador de células estaminais ALDH1A1/2. Em comparação com tumores negativos para SV2, os doentes com tumores SV2 positivos apresentaram níveis mais baixos de CA 19-9 (69% vs. 52%, p = 0,012), tumores maiores (> 4 cm, 23% vs. 10%, p = 0,0430), menor invasão de gânglios linfáticos (69% vs. 86%, p = 0,005) e tumores mais diferenciados (69% vs. 57%, p = 0,047). A presença de SV2A foi associada com uma sobrevida livre de doença mais longa (HR: 0,49 p = 0,009) bem como melhor sobrevida global (HR: 0,54 p = 0,018). Em conjunto, esta informação aponta para dois subtipos diferentes de adenocarcinoma do pâncreas, e estes subtipos co-relacionam estatisticamente com o prognostico de doentes, sendo este subgrupo definido pela presença do clone celular SV2A / ALDH1A1/2 positivo com características neuroendócrinas. No Capítulo 4, a expressão de SV2A no cancro do pâncreas foi validado em linhas celulares primárias. Demonstramos a heterogeneidade do adenocarcinoma do pâncreas de acordo com características clonais neuroendócrinas. Ao comparar as linhas celulares expressando SV2 com linhas celulares negativas, verificamos que as linhas celulares SV2+ eram mais diferenciadas, diferindo de linhas celulares SV2 negativas no que respeita a mutação KRAS, proliferação e a resposta à quimioterapia. No capítulo 5, perguntamo-nos se o clone celular SV2 positivo poderia explicar a resistência a quimioterapia observada em doentes. Observamos um aumento absoluto de clones celulares expressando SV2A, em múltiplas linhas de evidência - doentes, linhas de células primárias e xenotransplantes. Embora, tenhamos sido capazes de demonstrar que o adenocarcinoma do pâncreas é uma doença heterogénea, consideramos que a caracterização genética destes clones celulares expressando SV2A é de elevada importância. Pretendemos colmatar esta limitação com as seguintes estratégias: Após o tratamento com quimioterapia neoadjuvante na nossa coorte, realizamos microdissecação a laser das amostras primarias em parafina, de forma a analisar mutações genéticas observadas no adenocarcinoma pancreático; em segundo lugar, pretendemos determinar consequências de knockdown da expressão de SV2A em nossas linhas celulares seguindo-se o tratamento com gemicitabina para determinação do papel funcional de SV2A; finalmente, uma vez que os nossos esforços anteriores com um promotor - repórter e SmartFlare ™ falharam, o próximo passo será realizar RNA-ISH PrimeFlow™ seguido de FACS e RNA-seq para caracterização deste clone celular. Em conjunto, conseguimos provar com várias linhas de evidência, que o adenocarcinoma pancreático é uma doença heterogénea, definido por um clone de células que expressam SV2A, com características neuroendócrinas. A presença deste clone no tecido de doentes correlaciona-se estatisticamente com o prognostico da doença, incluindo sobrevida livre de doença e sobrevida global. Juntamente com padrões de proliferação e co-expressão de ALDH1A1/2, este clone parece apresentar um comportamento de células estaminais e está associado a resistência a quimioterapia, uma vez que a sua expressão aumenta após agressão química, quer em doentes, quer em linhas de células primárias.----------------------------- ABSTRACT: Currently, the only chance of cure for patients with pancreatic adenocarcinoma is surgical resection, at the beginning of my thesis studies, we asked if the classical clinicopathologic predictors of outcome could be validated in a large cohort of patients with early stage pancreatic cancer and if other clinical predictors could have a role on deciding which patients would benefit from surgery. In chapter 2, we found that up to 30% of patients die within the first year after curative intent surgery for pancreatic adenocarcinoma. We aimed at determining pre-operative factors that would correlate with early mortality following resection for pancreatic cancer using a statistically validated tool, the Charlson-Age Comorbidity Index (CACI). We found that a CACI score greater than 4 was predictive of increased length of stay (p<0.001), post-operative complications (p=0.042), and mortality within 1-year of pancreatic resection (p<0.001). A CACI score of 6 or greater increased 3-fold the odds of death within the first year. Patients with a high CACI score have less than 50% likelihood of being alive 1 year after surgery. In chapter 3 we aimed at identifying a surface protein that correlates with patient’s outcome and distinguishes sub-groups of patients according to their molecular differences and if this protein could be a cancer stem cell marker. The most abundant class of circulating tumor cells identified in our previous work was found to have biphenotypic features of epithelial to mesenchymal transition, enrichment for stem-cell associated genes (ALDH1A1/ALDH1A2 and KLF4), and an overexpression of extracellular matrix genes (Collagens, SPARC, and DCN) normally found in the stromal microenvironment of PDAC primary tumors. Upon evaluation of matched primary tumors with RNA-ISH, many of the genes identified were found to co-localize in a sub-population of cells at the basal region of malignant pancreatic ducts. In addition, these cells expressed the neuroendocrine marker SV2A, and the stem cell marker ALDH1A1/2. Compared to SV2 negative tumors, patients with SV2 positive tumors were more likely to present with lower CA 19-9 (69% vs. 52%, p = 0.012), bigger tumors (size > 4 cm, 23% vs. 10%, p= 0.0430), less nodal involvement (69% vs. 86%, p = 0.005) and lower histologic grade (69% vs. 57%, p = 0.047). The presence of SV2A expressing cells was associated with an improved disease free survival (HR: 0.49 p=0.009) and overall survival (HR: 0.54 p=0.018) and correlated linearly with ALDH1A2. Together, this information points to two different sub-types of pancreatic adenocarcinoma, and these sub-types correlated with patients’ outcome and were defined by the presence of a SV2A/ ALDH1A1/2 expressing clone with neuroendocrine features. In Chapter 4, SV2A expression in cancer was validated in primary cell lines. We were able to demonstrate pancreatic adenocarcinoma heterogeneity according to neuroendocrine clonal features. When comparing SV2 expressing cell lines with SV2 negative cell lines, we found that SV2+ cell lines were more differentiated and differ from SV2 negative cell lines regarding KRAS mutation, proliferation and response to chemotherapy. In Chapter 5 we aimed at determining if this SV2 positive clone could explain chemoresistance observed in patients. We found an absolute increase in SV2A expressing cells, with multiple lines of evidence, in patients, primary cell lines and xenografts. Although, we have been able to show evidence that pancreatic adenocarcinoma is a heterogeneous disease, our findings warrant further investigation. To further characterize SV2A expressing clones after treatment with neoadjuvant chemotherapy in our cohort, we have performed laser capture microdissection of the paraffin embedded tissue in this study and will analyze the tissue for known genetic mutations in pancreatic adenocarcinoma; secondly, we want to know what will happen after knocking down SV2A expression in our cell lines followed by treatment with gemcitabine to determine if SV2A is functionally important; finally, since our previous efforts with a promoter – reporter and SmartFlare™ have failed, we will utilize a novel PrimeFlow™ RNA-ISH assay followed by FACS and RNA sequencing to further characterize this cellular clone. Overall our data proves, with multiple lines of evidence, that pancreatic adenocarcinoma is a heterogeneous disease, defined by a clone of SV2A expressing cells, with neuroendocrine features. The presence of this clone in patients’ tissue correlates with patient’s disease free survival and overall survival. Together with patterns of proliferation and ALDH1A1/2 co-expression, this clone seems to present a stem-cell-like behavior and is associated with chemoresistance, since it increases after chemotherapy, both in patients and primary cell lines.

Aumento de capital social por "conversão" de créditos sobre a sociedade, nomeadamente de créditos resultantes de prestações suplementares

Na presente dissertação abordaremos o mecanismo do aumento de capital realizado com recurso a créditos sobre a sociedade, nomeadamente, resultantes de prestações suplementares. Este tema afigura-se-nos de particular interesse e considerável relevância não só teoricamente, como face ao momento histórico que vivemos. De facto, o modelo comummente adoptado pelas sociedades comerciais passava pelo recurso a elevados níveis de endividamento, sendo utilizados capitais externos como modo preferencial de financiamento. Dadas as recentes e generalizadas dificuldades de tesouraria e acesso a crédito, as estruturas financeiras das sociedades tiveram de ser repensadas, sendo os mecanismos de autofinanciamento cada vez mais bem vistos. A questão ora em análise afigura-se ainda como merecedora do nosso interesse e análise pelo facto de cruzar vários institutos jurídicos, uns regulados pelo direito civil (extinção e transmissão de obrigações) e outros pelo direito societário (aumento de capital e prestações suplementares), e versar também sobre outras áreas do saber como a contabilidade empresarial. Cumprindo a função de autofinanciamento da sociedade temos os aumentos de capital e as prestações suplementares. Mediante o aumento de capital social realizado com créditos sobre a própria sociedade, sejam estes créditos de terceiros, sejam créditos de sócios decorrentes da realização de prestações suplementares, realiza-se um financiamento com recurso a capitais próprios da sociedade que, desonerando-a de uma dívida, contribui para a sanidade financeira da mesma. Este é, pois, um mecanismo jurídico de grande relevância prática com evidentes vantagens tanto para os sócios – na medida em que fortalece a possibilidade de realização do objecto social - como para os credores – pois confere maior certeza de satisfação dos seus direitos de crédito. Assim, ao longo deste estudo, procuraremos demonstrar as vantagens e benefícios deste mecanismo que justificam amplamente, em nosso entender, que lhe seja dado o devido tratamento legislativo. Iniciaremos o nosso percurso com uma breve análise do conceito estruturante de todo o nosso direito societário, o capital social. Sendo este nuclear ao pensamento jus-societário português e ao tema que ora nos propomos tratar, afigura-se-nos como imperativa a sua devida definição e caracterização para posterior discussão das questões parcelares e particulares que encerra. Feita a sua análise, estaremos em condições de gizar os principais traços de dois dos modos de financiamento das sociedades, abordando primeiramente o elemento central da nossa exposição, o aumento de capital. Não gozando as prestações suplementares do mesmo regime que o capital social e não o integrando ou modificando, pelas suas características intrínsecas, cumprem funções similares a este e são, consequentemente, afins do aumento de capital social. Daí a sua inserção sistemática na presente no âmbito das “vicissitudes da vida das sociedades – modos de financiamento”. A abordagem e tratamento pormenorizado das prestações suplementares tem aqui lugar por força não só da sua função de autofinanciamento das sociedades, paralela à dos aumentos de capital, mas também e essencialmente por força do facto de da sua realização resultarem créditos sobre a sua sociedade que poderão ser objecto de entradas em futuros aumentos de capital. . Sendo a particularidade do mecanismo em causa o tipo de entrada com que é realizado – os créditos – múltiplas questões se levantam e merecem análise e reflexão. Seguir-se-á, então, o estudo da obrigação central e fundacional da posição jurídica de sócio e, consequentemente, da vida das sociedades comerciais, a obrigação de entrada. Aqui, demonstraremos a admissibilidade da realização de aumentos de capital com entradas constituídas por créditos, o que despoleta a questão central da nossa problemática – como se extingue a obrigação de entrada nos aumentos de capital realizados com créditos quando a lei societária proíbe determinante e expressamente a sua extinção por compensação? Aqui chegados, far-se-á uma incursão pelos principais ordenamentos jurídicos europeus, num breve estudo de direito comparado que nos permita iluminar a questão, que entre nós tem sido negligenciada pela doutrina, jurisprudência e, principalmente, pelo legislador. De facto, são poucas as vozes que entre nós versam sobre a incongruência entre a praxis recorrente de realização de aumentos de capital mediante conversão de crédito em capital e a proibição do 27.º n.º 5 do Código das Sociedades Comerciais. Não sendo admitida a compensação, cumpre analisar as várias causas de extinção das obrigações previstas no Código Civil que, à partida, poderão operar a extinção da obrigação de entrada.

A avaliação da comunicação da criança com perturbação do espetro do autismo: perspetiva de pais e de profissionais

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Morfologia Polínica de Populações Amazônicas de Elaeis oleifera

Elaeis oleifera (Kunth) Cortés - Arecaceae (caiaué) apresenta características vantajosas para a hibridação com o dendê E. guineensis que variam entre populações. Com o objetivo de contribuir para a discriminação de populações amazônicas, caracterizou-se a morfologia do pólen de dez populações de caiaué (Acajatuba, Amatari, Autazes, BR-174, Careiro, Manicoré, Maués, Moura, Novo Aripuanã e Tefé). Utilizou-se o método da acetólise para eliminação do conteúdo celular e observou-se o tamanho, forma, abertura e superfície dos grãos de pólen. A população Novo Aripuanã apresentou maior tamanho médio dos grãos de pólen (49,0 μm) e as populações Amatari, BR-174 e Moura os menores (42,5 a 44,0 μm). Os grãos de pólen são elípticos ou piriformes, com abertura monocolpada e superfície microrreticulada. Observou-se, também, anormalidades morfológicas em alguns grãos. A morfologia polínica separou as populações amazônicas em três grupos e, quando associada a outras análises (isoenzimas e DNA), pode representar uma ferramenta importante na discriminação de populações.

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José Anastácio da Cunha e o projeto MAT² : no trilho de uma história extraordinária

A ideia de que as Matemáticas de Portugal (e de Espanha) atravessaram, depois de um período áureo nos Descobrimentos, um longo deserto onde não foi possível florescerem Mestres, nem escolas, nem cultura científica, nem investigação de relevo foi, durante muito tempo, reiteradamente veiculada, inclusivé através de alguns dos nossos mais referenciados historiadores da Matemática, como é o caso de Gomes Teixeira ou de Rey Pastor. Mas a verdade é que o estudo da História das Matemáticas em Portugal tem, na última década, vivido um interesse crescente onde sobressaem, em particular, uma leitura menos enviesada sobre, por exemplo, o papel educativo dos Jesuítas ou a publicação das obras completas de Pedro Nunes. Está-se assim a contribuir para uma compreensão mais completa da História geral de Portugal, de que a História da Ciência e da Cultura faz parte. José Anastácio da Cunha (1744-1787) foi figura de proa no século XVIII português. Sabíamo-lo matemático que, sem nunca ter saído de Portugal, havia sido capaz de antecipar, em mais de 50 anos, os esforços de matemáticos franceses e alemães para fundar a Matemática com rigor. Sabíamo-lo também autor de uma vasta e diversificada obra de inegável importância matemática mas, igualmente, autor de textos poéticos. Agora, com o projecto que denominámos de MAT2, centramo-nos em José Anastácio da Cunha e pretendemos, se possível, ir ainda mais além. Partimos de uma descoberta, árdua mas com final feliz, em um Arquivo de família: o da Casa de Mateus. Sentimo-nos, com esta “sorte”, privilegiados e gratos por nos ter sido gentilmente concedido o acesso a um vasto conjunto de documentos únicos (diários de viagens, notas de aulas e correspondência) que incluem memórias autógrafas e inéditas de Anastácio da Cunha. Organizámo-nos, cientes do trabalho árduo que temos pela frente, multi e interdisciplinarmente englobando a Matemática (nas suas múltiplas especializações) e a História (incluindo a da Matemática) mas também contando com a Física, a Informática, os estudos militares ou a Arquivística e as Humanidades; reunimos académicos, mais e menos veteranos, com investigadores jovens e juntámos valências nacionais e estrangeiras. No presente artigo daremos conta do percurso trilhado, até agora, pelo projecto MAT2.

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Modelagem Sísmica via métodos das diferenças finitas: caso da bacia do Amazonas

Este trabalho tem por objetivo apresentar os resultados da modelagem sísmica em meios com fortes descontinuidades de propriedades físicas, com ênfase na existência de difrações e múltiplas reflexões, tendo a Bacia do Amazonas como referência à modelagem. As condições de estabilidade e de fronteiras utilizadas no cálculo do campo de ondas sísmicas foram analisadas numericamente pelo método das diferenças finitas, visando melhor compreensão e controle da interpretação de dados sísmicos. A geologia da Bacia do Amazonas é constituída por rochas sedimentares depositadas desde o Ordoviciano até o Recente que atingem espessuras da ordem de 5 km. Os corpos de diabásio, presentes entre os sedimentos paleozóicos, estão dispostos na forma de soleiras, alcançam espessuras de centenas de metros e perfazem um volume total de aproximadamente 90000 Km³. A ocorrência de tais estruturas é responsável pela existência de reflexões múltiplas durante a propagação da onda sísmica o que impossibilita melhor interpretação dos horizontes refletores que se encontram abaixo destas soleiras. Para representar situações geológicas desse tipo foram usados um modelo (sintético) acústico de velocidades e um código computacional elaborado via método das diferenças finitas com aproximação de quarta ordem no espaço e no tempo da equação da onda. A aplicação dos métodos de diferenças finitas para o estudo de propagação de ondas sísmicas melhorou a compreensão sobre a propagação em meios onde existem heterogeneidades significativas, tendo como resultado boa resolução na interpretação dos eventos de reflexão sísmica em áreas de interesse. Como resultado dos experimentos numéricos realizados em meio de geologia complexa, foi observada a influência significativa das reflexões múltiplas devido à camada de alta velocidade, isto provocou maior perda de energia e dificultou a interpretação dos alvos. Por esta razão recomenda-se a integração de dados de superfície com os de poço, com o objetivo de obter melhor imagem dos alvos abaixo das soleiras de diabásio.

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