Mechanisms of spindle positioning during "Caenorhabditis elgans" asymmetric cell division

Résumé : Le positionnement correct du fuseau mitotique est crucial pour les divisions cellulaires asymétriques, car il gouverne le contrôle spatial de la division cellulaire et assure la ségrégation adéquate des déterminants cellulaires. Malgré leur importance, les mécanismes contrôlant le positionnement du fuseau mitotique sont encore mal compris. Chez l'embryon au stade une-cellule du nématode Caenorhabditis elegans, le fuseau mitotique est positionné de manière asymétrique durant l'anaphase grâce à l'action de générateurs de force situés au cortex cellulaire, et dont la nature était jusqu'alors indéterminée. Ces générateurs de force corticaux exercent une traction sur les microtubules astraux et sont dépendants de deux protéines Gα et de leurs protéines associées. Cette thèse traite de la nature de la machinerie responsable pour la génération des forces de tractions, ainsi que de son lien avec les protéines Gα et associées. Nous avons combiné des expériences de coupure par faisceau laser du fuseau mitotique avec le contrôle temporel de l'inactivation de gènes ou de l'exposition à des produits pharmacologiques. De cette manière, nous avons établi que la dynéine, un moteur se déplaçant vers l'extrémité négative des microtubules, ainsi que la dynamique des microtubules, sont toutes deux requises pour la génération efficace des forces de tractions. Nous avons démontré que les protéines Gα et leurs protéines associées GPR-1/2 et LIN-5 interagissent in vivo avec LIS-1, un composant du complexe de la dynéine. De plus, nous avons découvert que les protéines Gα, GPR-1/2 et LIN-5 promeuvent la présence du complexe de la dynéine au cortex cellulaire. Nos résultats suggèrent un mécanisme par lequel les protéines Gα permettent le recrutement cortical de GPR-1/2 et LIN-5, assurant ainsi la présence de la dynéine au cortex. Conjointement avec la dynamique des microtubules, ce mécanisme permet la génération des forces de tractions afin d'obtenir une division cellulaire correcte. Comme les mécanismes contrôlant le positionnement du fuseau mitotique et les divisions cellulaires asymétriques sont conservés au cours de l'évolution, nous espérons que les mécanismes élucidés par ce travail sont d'importance générale pour la génération de la diversité cellulaire durant le développement. De plus, ces mécanismes pourraient être applicables à d'autres divisions asymétriques, comme celle des cellules souches, dont le disfonctionnement peut entraîner la génération de cellules cancéreuses. Abstract : Proper spindle positioning is crucial for asymmetric cell division, because it controls spatial aspects of cell division and the correct inheritance of cell-fate determinants. However, the mechanisms governing spindle positioning remain incompletely understood. In the Caenorhabditis elegans one-cell stage embryo, the spindle becomes asymmetrically positioned during anaphase through the action of as-yet unidentified cortical force generators that pull on astral microtubules and that depend on two Gα proteins and associated proteins. This thesis addresses the nature of the force generation machinery and the link with the Gα and associated proteins. By performing spindle-severing experiments following temporally restricted gene inactivation and drug exposure, we established that microtubule dynamics and the minus-end directed motor dynein are both required for generating efficient pulling forces. We discovered that the Gα proteins and their associated proteins GPR-1/2 and LIN-5 interact in vivo with LIS-1, a component of the dynein complex. Moreover, we uncovered that LIN-5, GPR-1/2 and the Gα proteins promote the presence of the dynein complex at the cell cortex. Our findings suggest a mechanism by which the Gα proteins enable GPR-1/2 and LIN-5 recruitment to the cortex, thus ensuring the presence of cortical dynein. Together with microtubule dynamics, this allows pulling forces to be exerted and proper cell division to be achieved. Because the mechanisms of spindle positioning and asymmetric cell division are conserved across evolution, we expect the underlying mechanism uncovered here to be of broad significance for the generation of cell diversity during development. Moreover, this mechanism could be relevant for other asymmetric cell divisions, such as stem cell divisions, whose dysfunction may lead to the generation of cancer cells.

BK DNA viral load in plasma: evidence for an association with hemorrhagic cystitis in allogeneic hematopoietic cell transplant recipients.

We performed a case-control study to determine the association of BK plasma viremia with hemorrhagic cystitis (HC) in hematopoietic cell transplant (HCT) recipients. Thirty cases of HC (14 of which occurred after platelet engraftment with documented BK viruria [BK-HC]) were compared with matched controls. Weekly plasma samples were tested for BK virus DNA by polymerase chain reaction (PCR). BK viremia detected before or during the disease was independently associated with HC (adjusted odds ratio = 30, P < .001); BK viremia was even important before clinical symptoms of HC occurred (odds ratio = 11, P < .001). Cases of HC and BK-HC had a significantly higher peak of BK plasma viral load than controls. BK virus was detected by in situ hybridization in bladder biopsies of 2 cases with severe HC and long-lasting BK viremia. BK virus seems to play a role in the development of HC and quantitative detection of BK DNA in plasma appears to be a marker of BK virus disease in HCT recipients.

Functional diversity of CD8+ T-cell subsets in chronic infection

Certains pathogènes tels que le virus de l'hépatite C ainsi que le virus de l'immunodéficience humaine sont capables de détourner les mécanismes de défense du système immunitaire adaptatif afin d'établir des infections chroniques chez l'homme. La souche clone-13 du virus de la chorioméningite lymphocytaire est utilisée comme modèle d'études d'infection virale chronique chez la souris. Les raisons qui expliqueraient la persistance de certains virus ne sont pas encore bien définies. Toutefois, il a été montré qu'une exposition prolongée à un environnement inflammatoire ainsi que la présence prolongée de l'antigène sont des facteurs qui vont déclencher un procédé de différentiation particulier des lymphocytes T CD8+. Ces cellules sur-expriment alors des récepteurs inhibiteurs tels que PD-1 tandis que leur capacité à produire des cytokines diminue. Ce procédé de différentiation est appelé « exhaustion » et serait à l'origine de la génération de réponses lymphocytaires non ou peu fonctionnelles entraînant de ce fait la persistance de l'infection. Néanmoins, il a également été démontré que ces lymphocytes maintiennent des fonctions effectrices et qu'ils permettent de limiter la réplication du virus. Afin d'étudier la fonction effectrice résiduelle de ces lymphocytes T, nous avons transféré des cellules provenant de souris infectées chroniquement dans des souris receveuses naïves qui ont à leur tour été infectées avec le virus. Grâce à ces expériences, nous avons démontré que les cellules transférées contiennent des cellules qui sont capables de i) re-proliférer, ii) de protéger les souris contre une infection virale, et de iii) survivre en l'absence d'antigène. Nous avons remarqué que les cellules stimulées de façon chronique maintiennent le même phénotype lorsqu'elles sont transférées dans des souris naïves soumises à une infection virale aiguë. Nous avons de ce fait conclu que les cellules stimulées chroniquement contiennent une sous-population de cellules qui comporte des attributs de cellules T mémoire. D'autre part, nous avons pu identifier le facteur de transcription Tcf-1 comme l'élément essential pour la génération des cellules T ressemblant à des cellules mémoires. D'autre part, nous avons étudié l'impact du niveau de stimulation via le récepteur des cellules T (TCR) sur le phénotype adopté par les lymphocytes T au cours d'une infection chronique. Dans ce but, nous avons généré des souches de virus recombinants qui expriment un épitope modifié de manière à réduire le niveau de stimulation via le TCR. D'autre part, nous avons utilisé un mélange de deux souches virales de manière à moduler spécifiquement la quantité d'un épitope tout en conservant la même charge virale. Nous avons montré que la quantité d'antigène avait plus d'influence sur le phénotype des lymphocytes T que la force d'interaction entre le complexe peptide-CMH et le TCR. De plus, l'apparition de ce phénotype ne semble pas avoir d'impact sur la prolifération des cellules en réponse à une infection primaire ou secondaire. Ainsi, nous proposons un modèle par lequel le procédé d'« exhaustion » des cellules T correspond à une différentiation cellulaire particulière qui est indépendante de la capacité de prolifération des cellules. De manière générale, ces découvertes apportent de nouvelles connaissances sur les sous-catégories de lymphocytes T CD8+ qui sont générés pendant une infection virale chronique. Nous pensons que la réponse effectrice du système immunitaire est maintenue pendant de longues périodes grâce à la présence de cellules par partagent certaines caractéristiques avec des cellules mémoires. L'étude approfondie de ces cellules peut avoir des implications importantes sur l'optimisation des stratégies utilisant l'immunothérapie pour combattre les infections chroniques et cancers.

TCRgamma silencing during alphabeta T cell development depends upon pre-TCR-induced proliferation.

During thymus development, immature T cells become committed to two distinct lineages based upon expression of alphabeta or gammadelta TCR. In the alphabeta lineage, developing thymocytes progressively extinguish transcription of the TCRgamma genes by a poorly understood process known as gamma silencing. We show that alphabeta lineage thymocytes in mice lacking a functional pre-TCR undergo limited proliferation and fail to silence TCRgamma genes during development. Stimulation of pre-TCR-deficient immature thymocytes with anti-CD3 Abs does not directly down-regulate TCRgamma transcription but restores TCRgamma silencing following proliferation. Collectively our data reveal an important role for pre-TCR induced proliferation in activating the TCRgamma silencer in alphabeta lineage thymocytes, a process that may reinforce alphabeta or gammadelta lineage commitment.

Analysis of viral- and tumor antigen-specific CD4 T cell responses in healthy donors and melanoma patients

Résumé Des tentatives pour développer des traitements anti-cancéreux basés sur l'utilisation d'antigènes tumoraux ont commencé il y a plus de 10 ans. Depuis quelques années, un certain intérêt s'est portée sur une sous-population particulière des cellules du système immunitaire, les lymphocytes T CD4. Ces cellules jouent un rôle central dans les réponses immunitaires tant contre les virus que contre les cellules tumorales. Comme d'autres lymphocytes T, ces cellules sont activées de manière spécifique en reconnaissant un morceau d'antigène, appelé peptide. Ces peptides proviennent soit de protéines des cellules de l'hôte, soit des protéines étrangères (virus ou bactéries) soit de cellules transformées (cellules tumorales) et sont présentés aux lymphocytes T par des molécules du soi appelées CMH (complexe majeur d'histocompatibilité). Dans le cas des lymphocytes T CD4, ces molécules sont plus précisément des molécules du CMH de classe II (CMH II). Mis à part l'intérêt porté aux réponses médiées par les lymphocytes T cytotoxiques, un intérêt croissant pour les lymphocytes T CD4 s'est développé à cause de la place centrale qu'occupent ces cellules dans les réponses immunitaires. L'identification d'épitopes présentés par des molécules du CMH de classe II dérivés d'un grand nombre d'antigènes tumoraux, ainsi que le développement de techniques permettant de suivre les réponses immunitaires, offre des opportunités pour étudier de manière quantitative et qualitative les lymphocytes T CD4 spécifiques pour un antigène particulier chez des patients cancéreux. De plus, ces épitopes permettent d'induire des réponses médiées par les lymphocytes T CD4 et CD8 chez ces mêmes patients. Dans ce travail, notre premier but était de valider l'utilisation de multimères formés par des complexes peptide:molécules de CMH de class II (pCMH II) pour quantifier la réponse des cellules T CD4 dirigée contre l'épitope HA307-319 dérivé de la protéine hémaglutinine du virus de la grippe et présenté par HLA-DRB1*0401. En analysant des échantillons provenant de volontaires sains ayant reçus un vaccin contre la grippe, nous avons pu démontrer une expansion et une activation transitoires des lymphocytes T CD4 spécifiques pour le peptide HA307-319 après vaccination. De plus, les multimères pCMH II nous ont permis d'analyser plus en détails hétérogénéité des cellules T CD4 spécifiques pour le peptide HA307-319 présents dans le sang périphérique d'individus sains. Par la suite, notre but a été d'analyser les réponses des lymphocytes T CD4 spécifiques pour l'antigène Melan-A chez des patients atteints de mélanome métastatique. Nous avons tout d'abord démontré la présence de cellules T CD4 spécifiques pour l'épitope Melan-A51-73, présenté par HLA-DRBl*0401, qui avait déjà été préalablement décrit. Ensuite, nous avons décrit et caractérisé 2 nouveaux peptides issus de Melan-A qui sont présentés aux cellules T CD4 par différentes molécules du CMH de clans II. Des cellules spécifiques pour ces deux épitopes ont été trouvées chez 9/ 16 patients analysés. De plus, des multimères pCMH II chargés avec un des épitopes nous ont permis de détecter ex vivo des lymphocytes T CD4 spécifiques pour Melan-A dans le sang périphérique d'un patient atteint de mélanome. Mis ensemble, tous ces résultats suggèrent une potentielle utilisation des multimères pCMH II pour analyser en détail les lymphocytes T CD4 spécifiques d'antigènes définis. Cependant, le suivi ex vivo de telles cellules ne semble être possible que dans des cas bien particuliers. Néanmoins, les nouveaux épitopes issus de Melan-A et présentés par des molécules du CMH de classe II que nous avons décrits dans cette étude aideront à étudier plus en détails les lymphocytes T CD4 spécifiques pour Melan-A chez des patients atteints de mélanome, un sujet d'étude sur lequel peu de résultats sont à ce jour disponibles. Summary Attempts to develop cancer vaccines based on molecularly defined tumorassociated antigens were initiated more than 10 years ago. Apart from CTLmediated anti-tumor immunity, interests are. now focused on CD4 T cells that are central players of immune responses. The identification of MHC class-II-restricted epitopes from numerous tumor antigens together with the development of monitoring tools offers the opportunity to quantitatively and qualitatively study antigen-specific CD4 T lymphocytes in cancer patients and to induce both CTL and T helper responses in cancer patients. In this work, we first aimed at validating the use of peptide:MHC class II complex (pMHC II) multimers to quantitate the CD4 T cell response against the hemagglutinin-derived epitope HAso~-si9 from influenza virus presented by HLA-DRBl*0401. By analysing samples from healthy volunteers vaccinated with ananti-influenza vaccine, we could demonstrate a transient expansion and activation of HA-specific CD4 T cells after treatment. Moreover, pMHC II multimers helped us to study the heterogeneity of HAspecific CD4 T cells found in peripheral blood of healthy individuals. Then, we aimed to analyse Melan-A-specific CD4 T cell responses in metastatic melanoma patients. We first demonstrated the presence of CD4 T cells specific for the previously described Melan-A51_73 epitope presented by HLA-DRB 1 *0401 in peripheral blood of those patients. Second, we described and characterised 2 new Melan-A-derived peptides that are presented by different MHC II molecules to CD4 T cells. Specific cells for these epitopes were found in 9/ 16 rnelánoma patients analysed. In addition, pMHC II multimers loaded with one of the two epitopes allowed us to detect ex vivo Melan-A-specific CD4 T cells in peripheral blood of a melanoma patient. Together, these results suggest a potential use of pMHC II multimers in analysing in detail antigen-specific CD4 T cells. However, ex vivo monitoring of such cells will be possible only in particular conditions. Nevertheless, the new Melan-A-derived MHC II-restricted epitopes described here will help to study in more detail Melan-A-specific CD4 T cells in melanoma patients, a field where only scarce data are available.

A cell therapy approach for erythropoietin delivery using encapsulated human primary fibroblasts

Summary Cell therapy has emerged as a strategy for the treatment of various human diseases. Cells can be transplanted considering their morphological and functional properties to restore a tissue damage, as represented by blood transfusion, bone marrow or pancreatic islet cells transplantation. With the advent of the gene therapy, cells also were used as biological supports for the production of therapeutic molecules that can act either locally or at distance. This strategy represents the basis of ex vivo gene therapy characterized by the removal of cells from an organism, their genetic modification and their implantation into the same or another individual in a physiologically suitable location. The tissue or biological function damage dictates the type of cells chosen for implantation and the required function of the implanted cells. The general aim of this work was to develop an ex vivo gene therapy approach for the secretion of erythropoietin (Epo) in patients suffering from Epo-responsive anemia, thus extending to humans, studies previously performed with mouse cells transplanted in mice and rats. Considering the potential clinical application, allogeneic primary human cells were chosen for practical and safety reasons. In contrast to autologous cells, the use of allogeneic cells allows to characterize a cell lineage that can be further transplanted in many individuals. Furthermore allogeneic cells avoid the potential risk of zoonosis encountered with xenogeneic cells. Accordingly, the immune reaction against this allogeneic source was prevented by cell macro- encapsulation that prevents cell-to-cell contact with the host immune system and allows to easy retrieve the implanted device. The first step consisted in testing the survival of various human primary cells that were encapsulated and implanted for one month in the subcutaneous tissue of immunocompetent and naturally or therapeutically immunodepressed mice, assuming that xenogeneic applications constitute a stringent and representative screening before human transplantation. A fibroblast lineage from the foreskin of a young donor, DARC 3.1 cells, showed the highest mean survival score. We have then performed studies to optimize the manufacturing procedures of the encapsulation device for successful engraftment. The development of calcifications on the polyvinyl alcohol (PVA) matrix serving as a scaffold for enclosed cells into the hollow fiber devices was reported after one month in vivo. Various parameters, including matrix rinsing solutions, batches of PVA and cell lineages were assessed for their respective role in the development of the phenomenon. We observed that the calcifications could be totally prevented by using ultra-pure sterile water instead of phosphate buffer saline solution in the rinsing procedure of the PVA matrix. Moreover, a higher lactate dehydrogenase activity of the cells was found to decrease calcium depositions due to more acidic microenvironment, inhibiting the calcium precipitation. After the selection of the appropriate cell lineage and the optimization of encapsulation conditions, a retroviral-based approach was applied to DARC 3.1 fibroblasts for the transduction of the human Epo cDNA. Various modifications of the retroviral vector and the infection conditions were performed to obtain clinically relevant levels of human Epo. The insertion of a post-transcriptional regulatory element from the woodchuck hepatitis virus as well as of a Kozak consensus sequence led to a 7.5-fold increase in transgene expression. Human Epo production was further optimized by increasing the multiplicity of infection and by selecting high producer cells allowing to reach 200 IU hEpo/10E6 cells /day. These modified cells were encapsulated and implanted in vivo in the same conditions as previously described. All the mouse strains showed a sustained increase in their hematocrit and a high proportion of viable cells were observed after retrieval of the capsules. Finally, in the perspective of human application, a syngeneic model using encapsulated murine myoblasts transplanted in mice was realized to investigate the roles of both the host immune response and the cells metabolic requirements. Various loading densities and anti-inflammatory as well as immunosuppressive drugs were studied. The results showed that an immune process is responsible of cell death in capsules loaded at high cell density. A supporting matrix of PVA was shown to limit the cell density and to avoid early metabolic cell death, preventing therefore the immune reaction. This study has led to the development of encapsulated cells of human origin producing clinically relevant amounts of human EPO. This work resulted also to the optimization of cell encapsulation technical parameters allowing to begin a clinical application in end-stage renal failure patients. Résumé La thérapie cellulaire s'est imposée comme une stratégie de traitement potentiel pour diverses maladies. Si l'on considère leur morphologie et leur fonction, les cellules peuvent être transplantées dans le but de remplacer une perte tissulaire comme c'est le cas pour les transfusions sanguines ou les greffes de moelle osseuse ou de cellules pancréatiques. Avec le développement de la thérapie génique, les cellules sont également devenues des supports biologiques pour la production de molécules thérapeutiques. Cette stratégie représente le fondement de la thérapie génique ex vivo, caractérisée par le prélèvement de cellules d'un organisme, leur modification génétique et leur implantation dans le même individu ou dans un autre organisme. Le choix du type de cellule et la fonction qu'elle doit remplir pour un traitement spécifique dépend du tissu ou de la fonction biologique atteintes. Le but général de ce travail est de développer .une approche par thérapie génique ex vivo de sécrétion d'érythropoïétine (Epo) chez des patients souffrant d'anémie, prolongeant ainsi des travaux réalisés avec des cellules murines implantées chez des souris et des rats. Dans cette perpective, notre choix s'est porté sur des cellules humaines primaires allogéniques. En effet, contrairement aux cellules autologues, une caractérisation unique de cellules allogéniques peut déboucher sur de nombreuses applications. Par ailleurs, l'emploi de cellules allogéniques permet d'éviter les riques de zoonose que l'on peut rencontrer avec des cellules xénogéniques. Afin de protéger les cellules allogéniques soumises à une réaction immunitaire, leur confinement dans des macro-capsules cylindriques avant leur implantation permet d'éviter leur contact avec les cellules immunitaires de l'hôte, et de les retrouver sans difficulté en cas d'intolérance ou d'effet secondaire. Dans un premier temps, nous avons évalué la survie de différentes lignées cellulaires humaines primaires, une fois encapsulées et implantées dans le tissu sous-cutané de souris, soit immunocompétentes, soit immunodéprimées naturellement ou par l'intermédiaire d'un immunosuppresseur. Ce modèle in vivo correspond à des conditions xénogéniques et représente par conséquent un environnement de loin plus hostile pour les cellules qu'une transplantation allogénique. Une lignée fibroblastique issue du prépuce d'un jeune enfant, nommée DARC 3 .1, a montré une remarquable résistance avec un score de survie moyen le plus élevé parmi les lignées testées. Par la suite, nous nous sommes intéressés aux paramètres intervenant dans la réalisation du système d'implantation afin d'optimaliser les conditions pour une meilleure adaptation des cellules à ce nouvel environnement. En effet, en raison de l'apparition, après un mois in vivo, de calcifications au niveau de la matrice de polyvinyl alcohol (PVA) servant de support aux cellules encapsulées, différents paramètres ont été étudiés, tels que les procédures de fabrication, les lots de PVA ou encore les lignées cellulaires encapsulées, afin de mettre en évidence leur rôle respectif dans la survenue de ce processus. Nous avons montré que l'apparition des calcifications peut être totalement prévenue par l'utilisation d'eau pure au lieu de tampon phosphaté lors du rinçage des matrices de PVA. De plus, nous avons observe qu'un taux de lactate déshydrogénase cellulaire élevé était corrélé avec une diminution des dépôts de calcium au sein de la matrice en raison d'un micro-environnement plus acide inhibant la précipitation du calcium. Après sélection de la lignée cellulaire appropriée et de l'optimisation des conditions d'encapsulation, une modification génétique des fibroblastes DARC 3.1 a été réalisée par une approche rétrovirale, permettant l'insertion de l'ADN du gène de l'Epo dans le génome cellulaire. Diverses modifications, tant au niveau génétique qu'au niveau des conditions d'infection, ont été entreprises afin d'obtenir des taux de sécrétion d'Epo cliniquement appropriés. L'insertion dans la séquence d'ADN d'un élément de régulation post¬transcriptionnelle dérivé du virus de l'hépatite du rongeur (« woodchuck ») ainsi que d'une séquence consensus appelée « Kozak » ont abouti à une augmentation de sécrétion d'Epo 7.5 fois plus importante. De même, l'optimisation de la multiplicité d'infection et la sélection plus drastique des cellules hautement productrices ont permis finalement d'obtenir une sécrétion correspondant à 200 IU d'Epo/10E6 cells/jour. Ces cellules génétiquement modifiées ont été encapsulées et implantées in vivo dans les mêmes conditions que celles décrites plus haut. Toutes les souris transplantées ont montré une augmentation significative de leur hématocrite et une proportion importante de cellules présentait une survie conservée au moment de l'explantation des capsules. Finalement, dans la perspective d'une application humaine, un modèle syngénique a été proposé, basé sur l'implantation de myoblastes murins encapsulés dans des souris, afin d'investiguer les rôles respectifs de la réponse immunitaire du receveur et des besoins métaboliques cellulaires sur leur survie à long terme. Les cellules ont été encapsulées à différentes densités et les animaux transplantés se sont vus administrer des injections de molécules anti-inflammatoires ou immunosuppressives. Les résultats ont démontré qu'une réaction immunologique péri-capsulaire était à la base du rejet cellulaire dans le cas de capsules à haute densité cellulaire. Une matrice de PVA peut limiter cette densité et éviter une mort cellulaire précoce due à une insuffisance métabolique et par conséquent prévenir la réaction immunitaire. Ce travail a permis le développement de cellules encapsulées d'origine humaine sécrétant des taux d'Epo humaine adaptés à des traitements cliniques. De pair avec l'optimalisation des paramètres d'encapsulation, ces résultats ont abouti à l'initiation d'une application clinique destinée à des patients en insuffisance rénale terminale.

Diffuse large B-cell lymphoma of Waldeyer's ring has distinct clinicopathologic features: a GELA study.

BACKGROUND: Diffuse large B-cell lymphomas (DLBCLs) arising in specific extranodal sites have peculiar clinicopathologic features. PATIENTS AND METHODS: We analyzed a cohort of 187 primary Waldeyer's ring (WR) DLBCLs retrieved from GELA protocols using anthracyclin-based polychemotherapy. RESULTS: Most patients (92%) had stage I-II disease. A germinal center B-cell-like (GCB) immunophenotype was observed in 61%, and BCL2 expression in 55%, of WR DLBCLs. BCL2, BCL6, IRF4 and MYC breakpoints were observed in, respectively, 3 of 42 (7%), 9 of 36 (25%), 2 of 26 (8%) and 4 of 40 (10%) contributive cases. A variable follicular pattern was evidenced in 30 of 68 (44%) large biopsy specimens. The 5-year progression-free survival (PFS) and the overall survival (OS) of 153 WR DLBCL patients with survival information were 69.5% and 77.8%, respectively. The GCB immunophenotype correlated with a better OS (P = 0.0015), while BCL2 expression predicted a worse OS (P = 0.037), an effect overcome by the GCB/non-GCB classification. Compared with matched nodal DLBCLs, WR DLBCLs with no age-adjusted international prognostic index factor disclosed a better 5-year PFS rate (77.5% versus 70.7%; P = 0.03). CONCLUSIONS: WR DLBCLs display distinct clinicopathologic features compared with conventional DLBCLs, with usual localized-stage disease, common follicular features and a high frequency of GCB immunophenotype contrasting with a low rate of BCL2 rearrangements. In addition, they seem to be associated with a better outcome than their nodal counterpart.

Pretherapeutic gamma-glutamyltransferase is an independent prognostic factor for patients with renal cell carcinoma.

BACKGROUND: Gamma-glutamyltransferase (GGT) regulates apoptotic balance and promotes cancer progression and invasion. Higher pretherapeutic GGT serum levels have been associated with worse outcomes in various malignancies, but there are no data for renal cell carcinoma (RCC). METHODS: Pretherapeutic GGT serum levels and clinicopathological parameters were retrospectively evaluated in 921 consecutive RCC patients treated with nephrectomy at a single institution between 1998 and 2013. Gamma-glutamyltransferase was analysed as continuous and categorical variable. Associations with RCC-specific survival were assessed with Cox proportional hazards models. Discrimination was measured with the C-index. Decision-curve analysis was used to evaluate the clinical net benefit. The median postoperative follow-up was 45 months. RESULTS: Median pretherapeutic serum GGT level was 25 U l(-1). Gamma-glutamyltransferase levels increased with advancing T (P<0.001), N (P=0.006) and M stages (P<0.001), higher grades (P<0.001), and presence of tumour necrosis (P<0.001). An increase of GGT by 10 U l(-1) was associated with an increase in the risk of death from RCC by 4% (HR 1.04, P<0.001). Based on recursive partitioning-based survival tree analysis, we defined four prognostic categories of GGT: normal low (<17.5 U l(-1)), normal high (17.5 to <34.5 U l(-1)), elevated (34.5 to <181.5 U l(-1)), and highly elevated (⩾181.5 U l(-1)). In multivariable analyses that adjusted for the effect of standard features, both continuously and categorically coded GGT were independent prognostic factors. Adding GGT to a model that included standard features increased the discrimination by 0.9% to 1.8% and improved the clinical net benefit. CONCLUSIONS: Pretherapeutic serum GGT is a novel and independent prognostic factor for patients with RCC. Stratifying patients into prognostic subgroups according to GGT may be used for patient counselling, tailoring surveillance, individualised treatment planning, and clinical trial design.

LKB1 and AMPK differentially regulate pancreatic β-cell identity.

Fully differentiated pancreatic β cells are essential for normal glucose homeostasis in mammals. Dedifferentiation of these cells has been suggested to occur in type 2 diabetes, impairing insulin production. Since chronic fuel excess ("glucotoxicity") is implicated in this process, we sought here to identify the potential roles in β-cell identity of the tumor suppressor liver kinase B1 (LKB1/STK11) and the downstream fuel-sensitive kinase, AMP-activated protein kinase (AMPK). Highly β-cell-restricted deletion of each kinase in mice, using an Ins1-controlled Cre, was therefore followed by physiological, morphometric, and massive parallel sequencing analysis. Loss of LKB1 strikingly (2.0-12-fold, E<0.01) increased the expression of subsets of hepatic (Alb, Iyd, Elovl2) and neuronal (Nptx2, Dlgap2, Cartpt, Pdyn) genes, enhancing glutamate signaling. These changes were partially recapitulated by the loss of AMPK, which also up-regulated β-cell "disallowed" genes (Slc16a1, Ldha, Mgst1, Pdgfra) 1.8- to 3.4-fold (E<0.01). Correspondingly, targeted promoters were enriched for neuronal (Zfp206; P=1.3×10(-33)) and hypoxia-regulated (HIF1; P=2.5×10(-16)) transcription factors. In summary, LKB1 and AMPK, through only partly overlapping mechanisms, maintain β-cell identity by suppressing alternate pathways leading to neuronal, hepatic, and other characteristics. Selective targeting of these enzymes may provide a new approach to maintaining β-cell function in some forms of diabetes.-Kone, M., Pullen, T. J., Sun, G., Ibberson, M., Martinez-Sanchez, A., Sayers, S., Nguyen-Tu, M.-S., Kantor, C., Swisa, A., Dor, Y., Gorman, T., Ferrer, J., Thorens, B., Reimann, F., Gribble, F., McGinty, J. A., Chen, L., French, P. M., Birzele, F., Hildebrandt, T., Uphues, I., Rutter, G. A. LKB1 and AMPK differentially regulate pancreatic β-cell identity.

Combined Electrostatic and Covalent Polymer Networks for Cell Microencapsulation

Two types of hydrogel microspheres have been developed. Fast ionotropic gelation of sodium alginate (Na-alg) in the presence of calcium ions was combined with slow covalent cross-linking of poly(ethylene glycol) (PEG) derivatives. For the first type, the fast obtainable Ca-alg hydrogel served as spherical matrix for the simultaneously occurring covalent cross-linking of multi-arm PEG derivative. A two-component interpenetrating network was formed in one step upon extruding the mixture of the two polymers into the gelation bath. For the second type, heterobifunctional PEG was grafted onto Na-alg prior to gelation. Upon extrusion of the polymer solution into the gelation bath, fast Ca-alg formation ensured the spherical shape and was accompanied by cross-linker-free covalent cross-linking of the PEG side chains. Thus, one-component hydrogel microspheres resulted. We present the physical properties of the hydrogel microspheres and demonstrate the feasibility of cell microencapsulation for both types of polymer networks.

Correlation of Der p 2 T-cell responses with clinical characteristics of children allergic to house dust mite.

BACKGROUND: An understanding of the mechanisms responsible for the development and maintenance of allergic inflammation and their clinical implications is needed to develop specific and successful treatment for allergy. OBJECTIVES: To characterize in vitro T-cell responses to Der p 2, one of the major allergens of house dust mite (HDM), and investigate potential correlations between clinical and laboratory parameters. METHODS: Forty-two patients monosensitized to HDM and 10 age-matched, healthy children were studied. Dendritic cells pulsed with Der p 2 were used to stimulate autologous CD14(-) cells. Der p 2-specific T-cell activation markers, proliferation, and cytokine production profiles were examined. RESULTS: Der p 2-specific T-cell activation markers, proliferation, and T(H)2 cytokine production were significantly higher in HDM patients compared with healthy controls. Moreover, a significant correlation between proliferation and T(H)2 cytokine production was observed. Within the allergic group, skin reaction to HDM was significantly stronger in patients with a Der p 2-specific T-cell response. Levels of HDM-specific IgE directly correlated with interleukin 5 and interleukin 13 levels and with skin prick test results and, ultimately, with the patient's family history of allergy. Furthermore, the presence of atopic march correlated with T-cell proliferation. CONCLUSION: We found that, in HDM patients, Der p 2-specific T(H)2 responses, promoted by autologous dendritic cells in vitro, correlate with clinical parameters.

Examining chemical compound biodegradation at low concentrations through bacterial cell proliferation.

We show proof of principle for assessing compound biodegradation at 1-2 mg C per L by measuring microbial community growth over time with direct cell counting by flow cytometry. The concept is based on the assumption that the microbial community will increase in cell number through incorporation of carbon from the added test compound into new cells in the absence of (as much as possible) other assimilable carbon. We show on pure cultures of the bacterium Pseudomonas azelaica that specific population growth can be measured with as low as 0.1 mg 2-hydroxybiphenyl per L, whereas in mixed community 1 mg 2-hydroxybiphenyl per L still supported growth. Growth was also detected with a set of fragrance compounds dosed at 1-2 mg C per L into diluted activated sludge and freshwater lake communities at starting densities of 10(4) cells per ml. Yield approximations from the observed community growth was to some extent in agreement with standard OECD biodegradation test results for all, except one of the examined compounds.

Activation mechanisms of the protease MALT1 and cleavage of one of its targets - the ribonuclease Regnase-1- in lymphocytes and lymphoma cell lines

Persistent infection induces an adaptive immune response that is mediated by T and B lymphocytes. Upon triggering with an antigen, these cells become activated and turn into fast expanding cells able to efficiently defend the host. Lymphocyte activation is controlled by a complex composed of CARMA1, BCL10 and MALT1 which regulates the NF-KB signaling pathway upon antigen triggering. Abnormally high expression or activity of either one of these three proteins can favor the development of lymphomas, while genetic defects in the pathway are associated with immunodeficiency. MALT1 was identified as a paracaspase sharing homology with other cysteine proteases, namely caspases and metacaspases. In order to be active, caspases need to dimerize. Based on their sequence similarity with MALT1, we hypothesized that dimerization might also be a mechanism of activation employed by MALT1. To address this assumption, we performed a bioinformatics modelling based on the crystal structures of several caspases. Our model suggested that the MALT1 caspase-like domain can indeed form dimers. This finding was later confirmed by several published crystal structures of MALT1. In the dimer interface of our model, we noticed the presence of charged amino acids that could potentially form salt bridges and thereby hold both monomers together. Mutation of one of these residues, E549, into alanine completely blocked the catalytic activity of MALT1. Additionally, we provided evidence for a role of E549 in promoting the MALTl-dependent growth of cells derived from diffuse large B cell lymphoma (DLBCL) of the aggressive B cell-like type (ABC). To our initial surprise, the E549A mutation showed only a partial defect in dimerization, indicating that additional residues are essential to form a stable dimer. The MALT1 crystal structures revealed a key function for E549 in stabilizing the catalytic site of the protease via its interaction with an arginine which is located next to the catalytic active cysteine. In an additional study, we discovered that MALT1 monoubiquitination is required for the catalytic activity of the protease. Interestingly, we found that the MALT1 dimer interface mutant E549A could not be monoubiquitinated. Based on these findings, we suggest that correct formation of the dimer interface is a prerequisite for monoubiquitination. In a second project, we discovered a novel target of the protease MALT1, the ribonuclease Regnase¬la It was described that the RNase activity of Regnase-1 negatively regulates immune responses. We could show that in ABC DLBCL cell lines, Regnase-1 is not only cleaved by MALT1 but also phosphorylated, at least in part, by the inhibitor of KB kinase (IKK). Both regulations appear to restrain the RNase function of Regnase-1 and thereby allow the production of pro-survival proteins. In conclusion, our studies further highlight and explain the importance of the catalytic activity of MALT1 for the activation of lymphocytes and provide additional knowledge for the development of specific drugs targeting the catalytic activity of MALT1 for immunomodulation and treatment of lymphomas.  SUMMARY IN FRENCH PhD Thesis Katrin Cabalzar 2 SUMMARY IN FRENCH Une infection persistante induit une réponse immunitaire adaptative par l'intermédiaire des lymphocytes T et B. Quand elles reconnaissent l'antigène, ces cellules sont activées et se multiplient très rapidement pour défendre efficacement l'hôte. L'activation des lymphocytes est transmise par un complexe composé de trois protéines, CARMA1, BCL10 et MALT1, qui régule la voie de signalisation NF-KB lorsque l'antigène est reconnu. L'expression ou l'activité anormalement élevée de l'une de ces trois protéines peut favoriser le développement de lymphomes, tandis que des défauts génétiques de cette voie de signalisation sont associés à l'immunodéficience. MALT1 a été identifiée comme étant une paracaspase qui partage des séquences homologues avec d'autres protéases à cystéine, comme les caspases et les métacaspases. Pour être actives, les caspases ont besoin de dimériser. Etant donné leur similarité de séquence avec MALT1, nous avons supposé que la dimérisation pouvait aussi être un mécanisme d'activation utilisé par MALT1. Pour vérifier cette hypothèse, nous avons conçu un modèle bioinformatique à partir des structures cristallographiques de plusieurs caspases. Et notre modèle a suggéré que le domaine catalytique de MALT1 était effectivement capable de former des dimères. Cette découverte a été confirmée plus tard par des publications qui montrent des structures cristallographiques dimériques de MALT1. Dans l'interface du dimère de notre modèle, nous avons remarqué la présence d'acides aminés chargés qui pouvaient former des liaisons ioniques et ainsi réunir les deux monomères. La mutation de l'un de ces résidus, E549, pour une alanine, a complètement inhibé l'activité catalytique de MALT1. De plus, nous avons mis en évidence un rôle d'E549 dans la croissance dépendante de MALT1, des cellules dérivées de lymphomes B diffus à grandes cellules (DLBCL) de sous-type cellules B actives (ABC). Dans un premier temps nous avons été surpris de constater que cette mutation révélait seulement un défaut partiel de dimérisation, ce qui indique que des acides aminés supplémentaires sont indispensables pour former un dimère stable. Les structures cristallographiques de MALT1 ont révélé un rôle primordial d'E549 dans la stabilisation du site catalytique de la protéase via son interaction avec une arginine qui se trouve à côté de la cystéine du site actif. Dans une autre étude, nous avons découvert que la monoubiquitination de MALT1 est requise pour l'activité catalytique de la protéase. A remarquer que nous avons trouvé que le mutant E549A de l'interface dimère de MALT1 n'a pas pu être monoubiquitiné. Sur la base de ces résultats, nous suggérons que la formation correcte de l'interface du dimère est une condition préalable pour la monoubiquitination. Dans un second projet, nous avons découvert une nouvelle cible de la protéase MALT1, la ribonucléase Regnase-1. Il a été décrit que l'activité RNase de Regnase-1 régulait négativement les réponses immunitaires. Nous avons pu montrer que dans les lignées cellulaires ABC DLBCL, la Regnase-1 n'était pas seulement clivée par MALT1 mais également phosphorylée, au moins en partie, par la kinase de l'inhibiteur de KB (IKK). Les deux régulations semblent supprimer la fonction RNase de Regnase-1 et permettre ainsi la stabilisation de certains ARN messagers et la production de protéines favorisant la survie. En conclusion, nos études mettent en évidence le rôle-clé de la dimérisation de MALT1 et expliquent l'importance de l'activité catalytique de MALT1 pour l'activation des lymphocytes. Ainsi, nos résultats apportent des connaissances supplémentaires pour le développement de médicaments spécifiques ciblant l'activité catalytique de MALT1, qui pourraient être utiles pour modifier les réponses immunitaires et traiter des lymphomes.

Moesin interacts with the cytoplasmic region of intercellular adhesion molecule-3 and is redistributed to the uropod of T Lymphocytes during cell polarization

During activation, T lymphocytes become motile cells, switching from a spherical to a polarized shape. Chemokines and other chemotactic cytokines induce lymphocyte polarization with the formation of a uropod in the rear pole, where the adhesion receptors intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), ICAM-3, and CD44 redistribute. We have investigated membrane-cytoskeleton interactions that play a key role in the redistribution of adhesion receptors to the uropod. Immunofluorescence analysis showed that the ERM proteins radixin and moesin localized to the uropod of human T lymphoblasts treated with the chemokine RANTES (regulated on activation, normal T cell expressed, and secreted), a polarization-inducing agent; radixin colocalized with arrays of myosin II at the neck of the uropods, whereas moesin decorated the most distal part of the uropod and colocalized with ICAM-1, ICAM-3, and CD44 molecules. Two other cytoskeletal proteins, ß-actin and ¿-tubulin, clustered at the cell leading edge and uropod, respectively, of polarized lymphocytes. Biochemical analysis showed that moesin coimmunoprecipitates with ICAM-3 in T lymphoblasts stimulated with either RANTES or the polarization- inducing anti-ICAM-3 HP2/19 mAb, as well as in the constitutively polarized T cell line HSB-2. In addition, moesin is associated with CD44, but not with ICAM-1, in polarized T lymphocytes. A correlation between the degree of moesin-ICAM-3 interaction and cell polarization was found as determined by immunofluorescence and immunoprecipitation analysis done in parallel. The moesin-ICAM-3 interaction was specifically mediated by the cytoplasmic domain of ICAM-3 as revealed by precipitation of moesin with a GST fusion protein containing the ICAM-3 cytoplasmic tail from metabolically labeled Jurkat T cell lysates. The interaction of moesin with ICAM-3 was greatly diminished when RANTES-stimulated T lymphoblasts were pretreated with the myosin-disrupting drug butanedione monoxime, which prevents lymphocyte polarization. Altogether, these data indicate that moesin interacts with ICAM-3 and CD44 adhesion molecules in uropods of polarized T cells; these data also suggest that these interactions participate in the formation of links between membrane receptors and the cytoskeleton, thereby regulating morphological changes during cell locomotion.