Papel de la regi��n 3'UTR en la acumulaci��n del RNA mensajero de VEGF-D en c��lulas PC12 que expresan constitutivamente el oncogen wnt-1

Tesis (Maestr��a en Ciencias con Especialidad en Biolog��a Molecular e Ingenier��a Gen��tica) UANL

Molekularbiologische Charakterisierung der Argonauten Proteine AgnA und AgnB innerhalb der RNA vermittelten Genregulation in D. discoideum

Argonauten Proteine ��bernehmen vielf��ltige Funktionen in RNA vermittelten Signalwegen zur Genregulation und sind in eukaryotischen Organismen hoch konserviert. Obwohl das Repertoire an kleinen regulatorischen RNAs in D. discoideum schon fr��h untersucht wurde und dabei sowohl siRNAs als auch miRNAs identifiziert werden konnten, war die Funktion der f��nf kodierten Argonauten Proteine zu Beginn meiner Arbeit noch v��llig unbekannt. Im Fokus meiner Untersuchung standen die zwei Homologe AgnA und AgnB. Die molekularbiologische Charakterisierung von AgnA hat gezeigt, dass das Protein eine essentielle Funktion bei der posttranskriptionellen Regulation des Retrotransposons DIRS-1 hat. AgnA wird f��r die Generierung von ��ber 90 % der DIRS-1 siRNAs ben��tigt, wobei unklar ist, ob die Slicer-Aktivit��t des Proteins relevant ist oder ob AgnA andere Proteine zur Generierung der kleinen RNAs rekrutiert. Mit Hilfe der Deep Sequencing Analyse kleiner RNAs im AgnA KO konnte die Abreicherung der DIRS-1 siRNAs best��tigt werden. Die Anreicherung von DIRS-1 sense und antisense Transkripten weist deutlich auf eine Deregulation des Retrotransposons bei Abwesenheit von AgnA hin. Der Verlust der AgnA abh��ngigen Regulationsebene ist nicht nur auf RNA- sondern auch auf DNA-Ebene nachweisbar, da im AgnA Knockout einzelstr��ngige extrachromosomale DIRS-1 Intermediate nachweisbar sind. Die Analyse dieser Strukturen mit Hilfe von Rasterkraftmikroskopie zeigt, dass die extrachromosomale DNA mit Proteinen assoziiert ist. Das Erscheinungsbild legt die Vermutung nahe, dass es sich um Virus ��hnliche Partikel handeln k��nnte. Die Transposition der DIRS-1 Elemente konnte nicht nachgewiesen werden. Sie schl��gt vermutlich fehl, da der zur Integration notwendige DNA-Doppelstrang nicht gebildet wird. Auch wenn der genaue Mechanismus der AgnA abh��ngigen DIRS-1 Regulation nicht vollst��ndig aufgekl��rt werden konnte, weisen die Ergebnisse darauf hin, dass AgnA nicht nur an der Biogenese der kleinen DIRS-1 siRNAs beteiligt ist, sondern auch weiter downstream, vermutlich innerhalb von Effektorkomplexen, als Regulator aktiv ist. AgnB ist nicht an der negativen Regulation des DIRS-1 Retrotransposons beteiligt. Im Gegenteil haben Experimente gezeigt, dass das Protein die Transkription des Elementes und die Bildung von DNA-Intermediaten eher positiv beeinflusst. Im Fall des Retrotransposons Skipper ist unklar, ob die wenigen siRNAs, die identifiziert worden sind, tats��chlich f��r die Regulation dieses Elementes genutzt werden. Der Knockout von AgnA hat eine Anreicherung der Skipper siRNAs zur Folge, wobei diese sehr variabel ist. Es konnten Skipper Transkripte nachgewiesen werden (Hinas et al., 2007), die wahrscheinlich die Vorl��ufermolek��le der siRNAs darstellen. Die Menge dieser Transkripte unterscheidet sich allerdings im Wildtyp und den untersuchten Knockout-St��mmen nicht. Bei der Untersuchung der miRNAs zeigte sich eine signifikante Anreicherung dieser regulatorischen RNAs im AgnA Knockout. Die Akkumulation kann durch die Expression von rekombinantem AgnA wieder auf Wildtyp Niveau gebracht werden. Die genaue Funktion von AgnA im miRNA Signalweg konnte aber nicht n��her spezifiziert werden. Im Fall der beiden miRNAs konnte im Rahmen dieser Arbeit nachgewiesen werden, dass sie keine 2���-O Methylierung besitzen und fast ausschlie��lich im Cytoplasma der Zelle vorliegen. Letzteres weist darauf hin, dass die untersuchten miRNAs ihre Zielgene vermutlich posttranskriptionell regulieren. Die Akkumulation von miRNAs im AgnA KO konnte ebenfalls durch Deep Sequencing Analysen verifiziert werden. Weiterhin wurden tRNA Fragmente gefunden, die im AgnA KO wesentlich st��rker vertreten sind. Northern Blot Analysen haben gezeigt, dass ein zus��tzliches Fragment der tRNA Asp akkumuliert, wenn AgnA nicht exprimiert wird. M��glicherweise ist AgnA am Umsatz der tRNA beteiligt. Die biologische Funktion der tRNA Fragmente in D. discoideum ist jedoch bisher ungekl��rt. Bei der Suche nach putativen Interaktionspartnern konnte im Fall von AgnA das Protein DDB_G0268914 mittels Massenspektrometrie als putativer Interaktionspartner identifiziert werden. Dieses Protein zeigt Homologien zu MOV10 aus H. sapiens, das ebenfalls mit Argonauten Proteinen interagiert (Hock et al., 2007) und die Replikation von Retroviren unterdr��ckt (Burdick et al., 2010). Die Interaktion zwischen AgnA und dem MOV10 Homolog konnte bisher nicht mit anderen Ans��tzen best��tigt werden. Dar��ber hinaus bleibt zu kl��ren, ob der putative Interaktionsparter ebenfalls an der Regulation des Retrotransposons DIRS-1 beteiligt ist.

HelF und sein Interaktionspartner Xrn1: zwei Regulatoren der RNA-Interferenz in D. discoideum

Hauptziel dieser Arbeit ist die Identifizierung, Verifizierung und Charakterisierung von Interaktionspartnern von HelF, einem Negativregulator der RNA-Interferenz in Dictyostelium discoideum (Popova et al. 2006). Es ist gelungen, die Interaktion von HelF und der 5��� 3��� Exonuklease Xrn1 nachzu-weisen, aber alle anderen Versuchen, bisher unbekannte Protein-Interaktionspartner zu identifizieren, schlugen fehl. Xrn1 ist in den Organismen D. melanogaster (Orban und Izaurralde 2005), C. elegans (Newbury und Woollard 2004) und A. thaliana (Gazzani et al. 2004) bereits als Regulator der RNA-Interferenz bekannt. Mit Aufreinigungen nach der TAP-Methode und mit dem Nanotrap wurde ebenfalls versucht, RNA-Interaktionspartner von HelF zu identifizieren. Es konnten in einigen Aufreinigungen putative, f��r HelF spezifische RNAs identifiziert werden, doch entweder es handelte sich nachweislich nicht um RNA oder die Reproduktion der Daten schlug trotz mehrfacher Versuche fehl. Bez��glich der zellul��ren Lokalisation von HelF und Xrn1 konnte gezeigt werden, dass HelF zus��tzlich zur bekannten Lokalisation in Foci im Nukleus (Popova et al. 2006) vermutlich auch im Cytoplasma und dort angeordnet in mehreren Granula zu finden ist. Xrn1 ist nahezu ausschlie��lich im Cytoplasma lokalisiert, wo es in mehreren Foci organisiert ist. Es wird vermutet, dass es sich bei diesen Foci um Processing-Bodies (P-Bodies) handelt und dass m��glicherweise Xrn1 und HelF in eben diesen P-Bodies co-lokalisieren. In der Entwicklung vom Einzeller zum mehrzelligen Organismus zeigen die Xrn1KO- und die HelFKO-Mutante jeweils einen eindeutigen Ph��notyp, der vom Wildtyp abweicht. Die Ph��notypen der beiden Mutanten unterscheiden sich deutlich voneinander. Beim Mischen von HelF-Knockout-Zellen mit gr��n fluoreszierenden Wildtyp-Zellen zeigt sich, dass beide St��mme innerhalb des sich entwickelnden Organismus an definierten Stellen lokalisieren. Entgegen den Erwartungen befinden sich die Zellen der Mutante in den Stadien ���Finger��� und ���Slug��� nicht haupts��chlich im vorderen Teil des Organismus, sondern sind auch im hinteren Teil, der sp��ter die Sporenmasse bildet, vertreten. Dies l��sst vermuten, dass HelF-Knockout-Mutanten in gleichem Ma��e wie Wildtypzellen als Sporen in die n��chste Generation ��bergehen. Weitere Mix-Experimente, in denen HelFKO-Zellen und Xrn1KO-Zellen mit gr��n fluoreszierenden Wildtypzellen gemischt wurden, belegen eindeutig, dass beide Knockoutmutanten in Konkurrenz zum Wildtyp bei der Generierung von Sporen und somit beim ��bergang in die n��chste Generation benachteiligt sind. Dies steht im Gegensatz zu den Ergebnissen der vorher beschriebenen Mix-Experimente, in denen der Organismus als Ganzes betrachtet wurde. Weiterhin konnte herausgefunden werden, dass Xrn1 ebenso wie HelF (Popova et al. 2006) eine Rolle als Negativregulator in der RNA-Interferenz innehat. Fraglich ist aber, ob HelF wie bisher angenommen auch Einfluss auf den Weg der Generierung von miRNAs nimmt, da in HelFKO f��r keinen der beiden miRNA-Kandidaten eine Hoch- bzw. Runterregulierung der reifen miRNAs im Vergleich zum Wildtyp beobachtet werden kann. Im Xrn1KO hingegen ist die reife miRNA ddi-mir-1176 im Vergleich zum Wildtyp hochreguliert. In Bezug auf die Generierung von siRNAs konnte herausgefunden werden, dass Xrn1 und HelF im Fall der Generierung von Skipper siRNAs regulierend eingreifen, dass aber nicht alle siRNAs von der negativen Regulierung durch HelF und Xrn1betroffen sind, was am Beispiel der DIRS-1-siRNAs belegt werden kann. Das von B. Popova entwickelte Modell (Popova 2005) bez��glich der Rolle von HelF in der RNA-Interferenz wurde basierend auf den neu gewonnenen Daten weiterentwickelt und um Xrn1 erg��nzt, um die Funktionen von HelF und Xrn1 als Antagonisten der RNA-Interferenz n��her zu beleuchten. Literatur: Gazzani, S., T. Lawrenson, et al. (2004). "A link between mRNA turnover and RNA interference in Arabidopsis." Science 306(5698): 1046-8. Newbury, S. and A. Woollard (2004). "The 5'-3' exoribonuclease xrn-1 is essential for ventral epithelial enclosure during C. elegans embryogenesis." Rna 10(1): 59-65. Orban, T. I. and E. Izaurralde (2005). "Decay of mRNAs targeted by RISC requires XRN1, the Ski complex, and the exosome." Rna 11(4): 459-69. Popova, B. (2005). HelF, a suppressor of RNAi mediated gene silencing in Dictyostelium discoideum. Genetik. Kassel, Universit��t Kassel. PhD: 200. Popova, B., M. Kuhlmann, et al. (2006). "HelF, a putative RNA helicase acts as a nuclear suppressor of RNAi but not antisense mediated gene silencing." Nucleic Acids Res 34(3): 773-84.

Chemische und enzymatische Synthese von orthogonal stabil gesch��tzten Kohlenhydrat-Scaffolds f��r kombinatorische Anwendungen

Auf der Suche nach potenten pharmakologischen Wirkstoffen hat die Kombinatorische Chemie in der letzten Dekade eine gro��e Bedeutung erlangt, um innerhalb kurzer Zeit ein breites Spektrum von Verbindungen f��r biologische Tests zu erzeugen. Kohlenhydrate stellen als Scaffolds interessante Kandidaten f��r die kombinatorische Synthese dar, da sie mehrere Derivatisierungspositionen in stereochemisch definierter Art und Weise zur Verf��gung stellen. So ist die r��umlich eindeutige Pr��sentation angebundener pharmakophorer Gruppen m��glich, wie es f��r den Einsatz als Peptidmimetika w��nschenswert ist. Zur gezielten Derivatisierung einzelner Hydroxylfunktionen ist der Einsatz eines orthogonalen Schutz-gruppenmusters erforderlich, das gegen��ber den im Lauf der kombinatorischen Synthese herrschenden Reaktionsbedingungen hinreichend stabil ist. Weiterhin ist ein geeignetes Ankersystem zu finden, um eine Festphasensynthese und damit eine Automatisierung zu erm��glichen.Zur Minimierung der im Fall von Hexosen wie Galactose ben��tigten f��nf zueinander orthogonal stabilen Schutzgruppen wurde bei der vorliegenden Arbeit von Galactal ausgegangen, bei dem nur noch drei Hydroxylfunktionen zu differenzieren sind. Das Galactose-Ger��st kann anschlie��end wiederhergestellt werden. Die Differenzierung wurde ��ber den Einsatz von Hydrolasen durch regioselektive Acylierungs- und Deacylierungs-reaktionen erreicht, wobei auch immobilisierte Enzyme Verwendung fanden. Dabei konnte ein orthogonales Schutzgruppenmuster sequentiell aufgebaut werden, das auch die n��tigen Stabilit��ten gegen��ber sonstigen, teilweise geeignet modifizierten Reaktionsbedingungen aufweist. F��r die Anbindung an eine Festphase wurde ein metathetisch spaltbarer Anker entwickelt, der ��ber die anomere Position unter Wiederherstellung des Galactose-Ger��sts angebunden wurde. Auch ein oxidativ spaltbares und ein photolabiles Ankersystem wurden erprobt.

Monitoring the extracellular matrix mineralization processes in biological scaffolds using bioreactors, x-ray ��ct technology and 3-d modeling methods (monitoraggio dei processi di mineralizzazione della matrice extracellulare in scaffolds biologici, utilizzando bioreattore, tecnologia ��ct a raggi x e metodi di modellizzazione 3d)

Al fine di migliorare le tecniche di coltura cellulare in vitro, sistemi a bioreattore sono sempre maggiormente utilizzati, e.g. ingegnerizzazione del tessuto osseo. Spinner Flasks, bioreattori rotanti e sistemi a perfusione di flusso sono oggi utilizzati e ogni sistema ha vantaggi e svantaggi. Questo lavoro descrive lo sviluppo di un semplice bioreattore a perfusione ed i risultati della metodologia di valutazione impiegata, basata su analisi ��CT a raggi-X e tecniche di modellizzazione 3D. Un semplice bioreattore con generatore di flusso ad elica �� stato progettato e costruito con l'obiettivo di migliorare la differenziazione di cellule staminali mesenchimali, provenienti da embrioni umani (HES-MP); le cellule sono state seminate su scaffold porosi di titanio che garantiscono una migliore adesione della matrice mineralizzata. Attraverso un microcontrollore e un'interfaccia grafica, il bioreattore genera tre tipi di flusso: in avanti (senso orario), indietro (senso antiorario) e una modalit�� a impulsi (avanti e indietro). Un semplice modello �� stato realizzato per stimare la pressione generata dal flusso negli scaffolds (3���10-2 Pa). Sono stati comparati tre scaffolds in coltura statica e tre all���interno del bioreattore. Questi sono stati incubati per 21 giorni, fissati in paraformaldehyde (4% w/v) e sono stati soggetti ad acquisizione attraverso ��CT a raggi-X. Le immagini ottenute sono state poi elaborate mediante un software di imaging 3D; �� stato effettuato un sezionamento ���virtuale��� degli scaffolds, al fine di ottenere la distribuzione del gradiente dei valori di grigio di campioni estratti dalla superficie e dall���interno di essi. Tale distribuzione serve per distinguere le varie componenti presenti nelle immagini; in questo caso gli scaffolds dall���ipotetica matrice cellulare. I risultati mostrano che sia sulla superficie che internamente agli scaffolds, mantenuti nel bioreattore, �� presente una maggiore densit�� dei gradienti dei valori di grigio ci�� suggerisce un migliore deposito della matrice mineralizzata. Gli insegnamenti provenienti dalla realizzazione di questo bioreattore saranno utilizzati per progettare una nuova versione che render�� possibile l���analisi di pi�� di 20 scaffolds contemporaneamente, permettendo un���ulteriore analisi della qualit�� della differenziazione usando metodologie molecolari ed istochimiche.

Protein crosslinking studies suggest that Rhizobium meliloti C4-dicarboxylic acid transport protein D, a sigma 54-dependent transcriptional activator, interacts with sigma 54 and the beta subunit of RNA polymerase.

Rhizobium meliloti C4-dicarboxylic acid transport protein D (DCTD) activates transcription by a form of RNA polymerase holoenzyme that has sigma 54 as its sigma factor (referred to as E sigma 54). DCTD catalyzes the ATP-dependent isomerization of closed complexes between E sigma 54 and the dctA promoter to transcriptionally productive open complexes. Transcriptional activation probably involves specific protein-protein interactions between DCTD and E sigma 54. Interactions between sigma 54-dependent activators and E sigma 54 are transient, and there has been no report of a biochemical assay for contact between E sigma 54 and any activator to date. Heterobifunctional crosslinking reagents were used to examine protein-protein interactions between the various subunits of E sigma 54 and DCTD. DCTD was crosslinked to Salmonella typhimurium sigma 54 with the crosslinking reagents succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate and N-hydroxysulfosuccinimidyl-4-azidobenzoate. Cys-307 of sigma 54 was identified by site-directed mutagenesis as the residue that was crosslinked to DCTD. DCTD was also crosslinked to the beta subunit of Escherichia coli core RNA polymerase with succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate, but not with N-hydroxysulfosuccinimidyl-4-azidobenzoate. These data suggest that interactions of DCTD with sigma 54 and the beta subunit may be important for transcriptional activation and offer evidence for interactions between a sigma 54-dependent activator and sigma 54, as well as the beta subunit of RNA polymerase.

Promoter architecture in the flagellar regulon of Bacillus subtilis: high-level expression of flagellin by the sigma D RNA polymerase requires an upstream promoter element.

Flagellin is one of the most abundant proteins in motile bacteria, yet its expression requires a low abundance sigma factor (sigma 28). We show that transcription from the Bacillus subtilis flagellin promoter is stimulated 20-fold by an upstream A+T-rich region [upstream promoter (UP) element] both in vivo and in vitro. This UP element is contacted by sigma 28 holoenzyme bound at the flagellin promoter and binds the isolated alpha 2 subassembly of RNA polymerase. The UP element increases the affinity of RNA polymerase for the flagellin promoter and stimulates transcription when initiation is limited by the rate of RNA polymerase binding. Comparison with other promoters in the flagellar regulon reveals a bipartite architecture: the -35 and -10 elements confer specificity for sigma 28, while promoter strength is determined largely by upstream DNA sequences.

Carbohydrate-based scaffolds in drug discovery

Carbohydrates have been proven as valuable scaffolds to display pharmocophores and the resulting molecules have demonstrated useful biological activity towards various targets including the somatostatin receptors (SSTR), integrins, HIV-1 protease, matrix metalloproteinases (MMP), multidrug resistance-associated protein (MRP), and as RNA binders. Carbohydrate-based compounds have also shown antibacterial and herbicidal activity.

Multifunctional bioactive glass scaffolds coated with layers of poly(d,l-lactide-co-glycolide) and poly(n-isopropylacrylamide-co-acrylic acid) microgels loaded with vancomycin

A new family of multifunctional scaffolds, incorporating selected biopolymer coatings on basic Bioglass�� derived foams has been developed. The polymer coatings were investigated as carrier of vancomycin which is a suitable drug to impart antibiotic function to the scaffolds. It has been proved that coating with PLGA (poly(lactic-co-glycolic acid)) with dispersed vancomycin-loaded microgels provides a rapid delivery of drug to give antibacterial effects at the wound site and a further sustained release to aid mid to long-term healing. Furthermore, the microgels also improved the bioactivity of the scaffolds by acting as nucleation sites for the formation of HA crystals in simulated body fluid. �� 2013 Elsevier B.V. All rights reserved.

Vaisseau sanguin reconstruit par g��nie tissulaire : D��veloppement d'une nouvelle approche pour la reconstruction de la media et interaction avec les microparticules

La media vasculaire est au coeur des processus physiopathologiques qui entra��nent le d��veloppement de l���ath��roscl��rose. L���utilisation d���une media reconstruite par g��nie tissulaire permet d�����tudier les cellules musculaires lisses (CML) humaines dans un environnement plus physiologique que les cellules en culture monocouche. Les travaux pr��sent��s dans cette th��se sont orient��s autour de la media vasculaire reconstruite par g��nie tissulaire comme mod��le d�����tude pharmacologique et proth��se vasculaire autologue. La premi��re partie des travaux porte sur l�����tude des interactions de cette tunique avec les microparticules (MP) circulantes. D���abord, nous avons montr�� que la pr��sence de l���adventice modifie la r��ponse de la media aux MP produites in vitro �� partir des lymphocytes T. Ensuite, l�����tude de l���effet des MP isol��es du s��rum de patients en choc septique sur la media humaine a d��montr�� que ces MP sont en mesure d���augmenter la contraction de la media par un m��canisme impliquant une diminution du NO et une augmentation de l���expression de l���ARN messager de l���interleukine-10. L���incubation de la media reconstruite avec cette cytokine anti-inflammatoire bloque l���hypor��activit�� induite par les lipopolysaccharides. Le m��me ph��nom��ne a ��t�� reproduit in vivo, chez le rongeur. Ces r��sultats sugg��rent que les SMP auraient un effet protecteur sur la fonction vasculaire, en potentialisant la contraction de la media. Ensuite, nous avons optimis�� l���approche de reconstruction de proth��ses vasculaires par auto-assemblage propos��e initialement pour l���adapter au contexte particulier des CML. L���objectif principal ��tait de permettre l�����tude physiopathologique de la media �� partir de toutes les lign��es de CML; ind��pendamment de leur capacit�� de synth��se de matrice extracellulaire. Pour ce faire, nous avons d��velopp�� un ��chafaudage de matrice extracellulaire produit par auto-assemblage �� partir de fibroblastes humains. L���utilisation de cet ��chafaudage g��n��re une media plus r��sistante et plus contractile que la technique initiale. Enfin, une anisotropie a ��t�� cr����e dans cet ��chafaudage pour permettre une orientation physiologique des CML. La media reconstruite devient ainsi plus r��sistante et plus contractile. Ces am��liorations permettent de reconstruire des media �� partir des cellules de plus de patients et m��neront �� des ��tudes pharmacologiques plus repr��sentatives de la population. Cet ��chafaudage facilitera la translation clinique de ce mod��le de media reconstruite par g��nie tissulaire.

Stereoselective Synthesis Of Aryl Cyclopentene Scaffolds By Heck-matsuda Desymmetrization Of 3-cyclopentenol.

A new enantioselective Heck-Matsuda desymmetrization reaction was accomplished by using 3-cyclopentenol to produce chiral five-membered 4-aryl cyclopentenol scaffolds in good yields and high ee's, together with some 3-aryl-cyclopentanones as minor products. Mechanistically, the hydroxyl group of 3-cyclopentenol acts as a directing group and is responsible for the cis- arrangement in the formation of the 4-aryl-cyclopentenols.

The Putative Leishmania Telomerase Rna (leishter) Undergoes Trans-splicing And Contains A Conserved Template Sequence.

Telomerase RNAs (TERs) are highly divergent between species, varying in size and sequence composition. Here, we identify a candidate for the telomerase RNA component of Leishmania genus, which includes species that cause leishmaniasis, a neglected tropical disease. Merging a thorough computational screening combined with RNA-seq evidence, we mapped a non-coding RNA gene localized in a syntenic locus on chromosome 25 of five Leishmania species that shares partial synteny with both Trypanosoma brucei TER locus and a putative TER candidate-containing locus of Crithidia fasciculata. Using target-driven molecular biology approaches, we detected a ���2,100 nt transcript (LeishTER) that contains a 5' spliced leader (SL) cap, a putative 3' polyA tail and a predicted C/D box snoRNA domain. LeishTER is expressed at similar levels in the logarithmic and stationary growth phases of promastigote forms. A 5'SL capped LeishTER co-immunoprecipitated and co-localized with the telomerase protein component (TERT) in a cell cycle-dependent manner. Prediction of its secondary structure strongly suggests the existence of a bona fide single-stranded template sequence and a conserved C[U/C]GUCA motif-containing helix II, representing the template boundary element. This study paves the way for further investigations on the biogenesis of parasite TERT ribonucleoproteins (RNPs) and its role in parasite telomere biology.

Intranasal vaccination with messenger RNA as a new approach in gene therapy: Use against tuberculosis

Background: mRNAs are highly versatile, non-toxic molecules that are easy to produce and store, which can allow transient protein expression in all cell types. The safety aspects of mRNA-based treatments in gene therapy make this molecule one of the most promising active components of therapeutic or prophylactic methods. The use of mRNA as strategy for the stimulation of the immune system has been used mainly in current strategies for the cancer treatment but until now no one tested this molecule as vaccine for infectious disease. Results: We produce messenger RNA of Hsp65 protein from Mycobacterium leprae and show that vaccination of mice with a single dose of 10 mu g of naked mRNA-Hsp65 through intranasal route was able to induce protection against subsequent challenge with virulent strain of Mycobacterium tuberculosis. Moreover it was shown that this immunization was associated with specific production of IL-10 and TNF-alpha in spleen. In order to determine if antigen presenting cells (APCs) present in the lung are capable of capture the mRNA, labeled mRNA-Hsp65 was administered by intranasal route and lung APCs were analyzed by flow cytometry. These experiments showed that after 30 minutes until 8 hours the populations of CD11c(+), CD11b(+) and CD19(+) cells were able to capture the mRNA. We also demonstrated in vitro that mRNA-Hsp65 leads nitric oxide (NO) production through Toll-like receptor 7 (TLR7). Conclusions: Taken together, our results showed a novel and efficient strategy to control experimental tuberculosis, besides opening novel perspectives for the use of mRNA in vaccines against infectious diseases and clarifying the mechanisms involved in the disease protection we noticed as well.