Klonierung, heterologe Expression, Kristallisation und Struktur der Perakin-Reduktase aus Rauvolfia serpentina

Die Perakin-Reduktase (PR) ist ein hochspezifisches Enzym aus dem Alkaloidstoffwechsel in Rauvolfia serpentina, dessen enzymatischer und molekularer Reaktionsmechanismus noch immer unbekannt ist. Um die dreidimensionale Struktur der PR aufzuklären, wurde in der vorliegenden Arbeit das für die PR codierende Gen erstmals identifiziert, exprimiert und das Genprodukt zur Kristallisation gebracht. Die PR ist ein 337 Aminosäure langes monomeres Protein mit einem Molekulargewicht von 37,2 kDa. Die Reinigung erfolgte über Ni2+-NTA-Affinitätschromatographie und lieferte 10 mg homogenes Protein pro Liter Bakterienkultur. Nach Expression in E. coli wurde im Enzym-Assay die NADPH2-abhängige Reduktion von Perakin zu Raucaffrinolin bestätigt und das Endprodukt massenspektrometrisch identifiziert. Durch Sequenzalignments mit anderen Proteinen wurde geschlossen, dass die PR zu der Superfamilie der Aldo/Keto-Reduktasen (AKR) gehört. Nach heterologer Expression in E. coli konnte die homogene, über reduktive Methylierung modifizierte PR mit Hilfe der Methode der Dampfdiffusion im hängenden Tropfen kristallisiert werden. In Gegenwart von 27% PEG 4000 und 100 mM Natriumcitrat (pH 5,6) bildeten sich nach 4 Tagen bei 20°C die ersten Kristalle. Die Struktur der PR konnte mit einer Auflösung von 2,0 Å durch molekularen Ersatz vollständig gelöst werden. Das Strukturmodell besitzt eine für AKRs charakteristische (α/β)8 TIM-barrel Faltung, konservierte Aminosäuren, die an der Bindung von NADPH2 beteiligt sind sowie eine katalytische Tetrade, die den Wasserstofftransfer von NADPH2 zum Kohlenstoff des Substrates vermittelt.

Untersuchung der Bindung des humanen Papillomvirus HPV16 an Heparansulfate der Zelloberfläche

In 99,7% aller Zervixkarzinome kann die DNA humaner Papillomviren (HPV) nachgewiesen werden, die somit den Hauptauslöser für eine der häufigsten Krebserkrankungen bei Frauen weltweit darstellen. HPV16 ist verantwortlich für etwa 50% aller Zervixkarzinome. Für die Infektion von Zellen mit HPV16 ist die Interaktion mit Heparansulfatproteoglykanen der Zelloberfläche essentiell. Um Aminosäuren auf der Oberfläche des majoren Kapsidproteins L1 von HPV16 zu identifizieren, die zu dieser Interaktion beitragen, wurden im Rahmen dieser Arbeit zahlreiche Punktmutanten hergestellt und analysiert. Der Austausch der drei Lysine K278, K356 und K361 zu Alaninen führte zu signifikant verminderter Zell-, Heparin- und Heparansulfatbindung, die noch weiter reduziert wurde, wenn zwei oder drei der Lysine gleichzeitig mutiert waren. Auch die Infektiosität der mutanten Pseudovirionen war stark beeinträchtigt, die Trippelmutante zeigte nur noch 5% Infektiosität. Diese Ergebnisse demonstrieren, dass die drei Lysine gemeinsam die Bindestelle für Heparansulfate bilden. Ihr Austausch zu Argininen beeinflusste die Infektiosität der Partikel hingegen nicht, was bestätigt, dass die Interaktion mit Heparansulfaten von der positiven Ladungsdichte abhängt und nicht sequenzspezifisch ist. Die drei Lysine befinden sich auf der Spitze des HPV16-Kapsomers in einer flachen Tasche, die aufgrund ihrer Struktur bereits früher als potentielle Rezeptorbindestelle vorgeschlagen wurde. Fab-Fragmente des bindungsneutralisierenden Antikörpers H16.56E, dessen Epitop in direkter Nachbarschaft der Lysine liegt, inhibierten die heparansulfatvermittelte Zellbindung viraler Partikel. Auch Epitope anderer bindungsneutralisierender Antikörper befinden sich in der Nähe. Dies untermauert die Hypothese, dass die Lysine K278, K356 und K361 die Heparansulfatbindestelle von HPV16 bilden. Der Austausch von Threoninen, die genau zwischen den Lysinen liegen, hatte keine Auswirkung auf Bindung der Partikel und Infektiosität. Sie könnten jedoch durch die Bildung von Wasserstoffbrücken die Bindung an Heparansulfat stabilisieren. Die Bedeutung der Lysine K278, K356 und K361 bei der primären Interaktion von HPV16 mit Heparansulfaten konnte durch die Computersimulation der Interaktion der Virusoberfläche mit einem Heparinmolekül bestätigt werden. Des Weiteren konnten Anforderungen ermittelt werden, die eine solche Interaktion an das Heparinmolekül stellt. Weiterhin zeigten die Ergebnisse dieser Arbeit, dass basische Aminosäuren in der interkapsomeren Grube nicht an der primären Zellbindung an Heparansulfate beteiligt zu sein scheinen, aber eine Rolle bei sekundären Interaktionen mit der Zelloberfläche spielen könnten.

Analysis of the influence of epitope flanking regions on MHC class I restricted antigen presentation

Peptides presented by MHC class I molecules for CTL recognition are derived mainly from cytosolic proteins. For antigen presentation on the cell surface, epitopes require correct processing by cytosolic and ER proteases, efficient TAP transport and MHC class I binding affinity. The efficiency of epitope generation depends not only on the epitope itself, but also on its flanking regions. In this project, the influence of the C-terminal region of the model epitope SIINFEKL (S8L) from chicken ovalbumin (aa 257-264) on antigen processing has been investigated. S8L is a well characterized epitope presented on the murine MHC class I molecule, H-2Kb. The Flp-In 293Kb cell line was transfected with different constructs each enabling the expression of the S8L sequence with different defined C-terminal flanking regions. The constructs differed at the two first C-terminal positions after the S8L epitope, so called P1’ and P2’. At these sites, all 20 amino acids were exchanged consecutively and tested for their influence on H-2Kb/S8L presentation on the cell surface of the Flp-In 293Kb cells. The detection of this complex was performed by immunostaining and flow cytometry. The prevailing assumption is that proteasomal cleavages are exclusively responsible for the generation of the final C-termini of CTL epitopes. Nevertheless, recent publications showed that TPPII (tripeptidyl peptidase II) is required for the generation of the correct C-terminus of the HLA-A3-restricted HIV epitope Nef(73-82). With this background, the dependence of the S8L generation on proteasomal cleavage of the designed constructs was characterized using proteasomal inhibitors. The results obtained indicate that it is crucial for proteasomal cleavage, which amino acid is flanking the C-terminus of an epitope. Furthermore, partially proteasome independent S8L generation from specific S8L-precursor peptides was observed. Hence, the possibility of other existing endo- or carboxy-peptidases in the cytosol that could be involved in the correct trimming of the C-terminus of antigenic peptides for MHC class I presentation was investigated, performing specific knockdowns and using inhibitors against the target peptidases. In parallel, a purification strategy to identify the novel peptidase was established. The purified peaks showing an endopeptidase activity were further analyzed by mass spectrometry and some potential peptidases (like e.g. Lon) were identified, which have to be further characterized.

Zur Struktur und Funktion der Typ-3-Kupferproteine sowie der Lichtsammlerkomplexe LHCI und LHCII

In der vorliegenden Arbeit wurden die bioinformatischen Methoden der Homologie-Modellierung und Molekularen Modellierung dazu benutzt, die dreidimensionalen Strukturen verschiedenster Proteine vorherzusagen und zu analysieren. Experimentelle Befunde aus Laborversuchen wurden dazu benutzt, die Genauigkeit der Homologie-Modelle zu erhöhen. Die Ergebnisse aus den Modellierungen wurden wiederum dazu benutzt, um neue experimentelle Versuche vorzuschlagen. Anhand der erstellten Modelle und bekannten Kristallstrukturen aus der Protein-Datenbank PDB wurde die Struktur-Funktionsbeziehung verschiedener Tyrosinasen untersucht. Dazu gehörten sowohl die Tyrosinase des Bakteriums Streptomyces als auch die Tyrosinase der Hausmaus. Aus den vergleichenden Strukturanalysen der Tyrosinasen resultierten Mechanismen für die Monophenolhydroxylase-Aktivität der Tyrosinasen sowie für den Import der Kupferionen ins aktive Zentrum. Es konnte der Beweis geführt werden, daß die Blockade des CuA-Zentrums tatsächlich der Grund für die unterschiedliche Aktivität von Tyrosinasen und Catecholoxidasen ist. Zum ersten Mal konnte mit der Maus-Tyrosinase ein vollständiges Strukturmodell einer Säugetier-Tyrosinase erstellt werden, das dazu in der Lage ist, die Mechanismen bekannter Albino-Mutationen auf molekularer Ebene zu erklären. Die auf der Basis des ermittelten 3D-Modells gewonnenen Erkenntnisse über die Wichtigkeit bestimmter Aminosäuren für die Funktion wurde durch gerichtete Mutagenese an der rekombinant hergestellten Maus-Tyrosinase getestet und bestätigt. Weiterhin wurde die Struktur der Tyrosinase des Krebses Palinurus elephas durch eine niedrigaufgelöste 3D-Rekonstruktion aus elektronenmikroskopischen Bildern aufgeklärt. Der zweite große Themenkomplex umfasst die Strukturanalyse der Lichtsammlerkomplexe LHCI-730 und LHCII. Im Falle des LHCII konnte der Oligomerisierungszustand der LHCMoleküle mit diskreten Konformationen des N-Terminus korreliert werden. Auch hier kam eine Kombination von Homologie-Modellierung und einer experimentellen Methode, der Elektronen-Spin-Resonanz-Messung, zum Einsatz. Die Änderung des Oligomerisierungszustands des LHCII kontrolliert den Energiezufluß zu den Photosystemen PS I und PS II. Des Weiteren wurde ein vollständiges Modell des LHCI-730 erstellt, um die Auswirkungen gerichteter Mutagenese auf das Dimerisierungsverhalten zu untersuchen. Auf Basis dieses Modells wurden die Wechselwirkungen zwischen den Monomeren Lhca1 und Lhca4 evaluiert und potentielle Bindungspartner identifiziert.

Expression profiling und rationale Expressionsoptimierung am Beispiel eines prokaryontischen Wirt-,Vektor-Systems

Durch globale Expressionsprofil-Analysen auf Transkriptom-, Proteom- oder Metabolom-Ebene können biotechnologische Produktionsprozesse besser verstanden und die Erkenntnisse für die zielgerichtete, rationale Optimierung von Expressionssystemen genutzt werden. In der vorliegenden Arbeit wurde die Überexpression einer Glukose-Dehydrogenase (EC 1.1.5.2), die von der Roche Diagnostics GmbH für die diagnostische Anwendung optimiert worden war, in Escherichia coli untersucht. Die Enzymvariante unterscheidet sich in sieben ihrer 455 Aminosäuren vom Wildtyp-Enzym und wird im sonst isogenen Wirt-/Vektor-System in signifikant geringeren Mengen (Faktor 5) gebildet. Das prokaryontische Expressionssystem wurde auf Proteom-Ebene charakterisiert. Die 2-dimensionale differenzielle Gelelektrophorese (DIGE) wurde zuvor unter statistischen Aspekten untersucht. Unter Berücksichtigung von technischen und biologischen Variationen, falsch-positiven (α-) und falsch-negativen (β-) Fehlern sowie einem daraus abgeleiteten Versuchsdesign konnten Expressionsunterschiede als signifikant quantifiziert werden, wenn sie um den Faktor ≥ 1,4 differierten. Durch eine Hauptkomponenten-Analyse wurde gezeigt, dass die DIGE-Technologie für die Expressionsprofil-Analyse des Modellsystems geeignet ist. Der Expressionsstamm für die Enzymvariante zeichnete sich durch eine höhere Variabilität an Enzymen für den Zuckerabbau und die Nukleinsäure-Synthese aus. Im Expressionssystem für das Wildtyp-Enzym wurde eine unerwartet erhöhte Plasmidkopienzahl nachgewiesen. Als potenzieller Engpass in der Expression der rekombinanten Glukose-Dehydrogenase wurde die Löslichkeitsvermittlung identifiziert. Im Expressionsstamm für das Wildtyp-Enzym wurden viele Proteine für die Biogenese der äußeren Membran verstärkt exprimiert. Als Folge dessen wurde ein sog. envelope stress ausgelöst und die Zellen gingen in die stationäre Wuchsphase über. Die Ergebnisse der Proteomanalyse wurden weiterführend dazu genutzt, die Produktionsleistung für die Enzymvariante zu verbessern. Durch den Austausch des Replikationsursprungs im Expressionsvektor wurde die Plasmidkopienzahl erhöht und die zelluläre Expressionsleistung für die diagnostisch interessantere Enzymvariante um Faktor 7 - 9 gesteigert. Um die Löslichkeitsvermittlung während der Expression zu verbessern, wurde die Plasmidkopienzahl gesenkt und die Coexpression von Chaperonen initiiert. Die Ausbeuten aktiver Glukose-Dehydrogenase wurden durch die Renaturierung inaktiven Produkts aus dem optimierten Expressionssystem insgesamt um einen Faktor von 4,5 erhöht. Somit führte im Rahmen dieser Arbeit eine proteombasierte Expressionsprofil-Analyse zur zielgerichteten, rationalen Expressionsoptimierung eines prokaryontischen Modellsystems.

Gamma-secretase modulators and inhibitors in Alzheimer's disease: influence of genetic background on efficacy and mechanism of action

According to the amyloid hypothesis, Alzheimer’s disease (AD) is caused by aberrant production or clearance of the amyloid-β (Aβ) peptides, and in particular of the longer more aggregation-prone Aβ42. The Aβ peptides are generated through successive proteolytic cleavage of the amyloid precursor protein (APP) by the β-site APP cleaving enzyme (BACE) and γ-secretase. γ-secretase produces Aβ peptides with variable C-termini ranging from Aβ34 to Aβ48, presumably by sequential trimming of longer into shorter peptides. γ-secretase is a multiprotein complex consisting of at least four different proteins and the presenilin proteins (PS1 or PS2) contain the catalytic center of the complex. In 2001 several non-steroidal anti-inflammatory drugs were identified as the founding members of a new class of γ-secretase modulators (GSMs) that can selectively reduce production of Aβ42. Concomitantly, these GSMs increase Aβ38 production indicating closely coordinated generation of Aβ42 and Aβ38 and a potential precursor-product relationship between these peptides. GSMs seem to exert their activity by direct modulation of γ-secretase. Support for this hypothesis is drawn from the finding that some PS mutations associated with early-onset familial AD (FAD) can modulate the cellular response to GSMs and to γ-secretase inhibitors (GSIs), which inhibit production of all Aβ peptides and are known to directly interact with PS. A particularly interesting FAD PS mutation is PS1-ΔExon9, a complex deletion mutant that blocks endoproteolysis of PS1 and renders cells completely non-responsive to GSMs. Studies presented in this thesis show that the diminished response of PS1-ΔExon9 to GSMs is mainly caused by its lack of endoproteolytic cleavage. Furthermore, we were able to demonstrate that a reduced response to GSMs and GSIs is not limited to PS1-ΔExon9 but is a common effect of aggressive FAD-associated PS1 mutations. Surprisingly, we also found that while the Aβ42 response to GSMs is almost completely abolished by these PS1 mutations, the accompanying Aβ38 increase was indistinguishable to wild-type PS1. Finally, the reduced response to GSIs was confirmed in a mouse model with transgenic expression of an aggressive FAD-associated PS1 mutation as a highly potent GSI failed to reduce Aβ42 levels in brain of these mice. Taken together, our findings provide clear evidence for independent generation of Aβ42 and Aβ38 peptides, and argue that the sequential cleavage model might be an oversimplification of the molecular mechanism of γ-secretase. Most importantly, our results highlight the significance of genetic background in drug discovery efforts aimed at γ-secretase, and indicate that the use of cellular models with transgenic expression of FAD-associated PS mutations might confound studies of the potency and efficacy of GSMs and GSIs. Therefore, such models should be strictly avoided in the ongoing preclinical development of these promising and potentially disease-modifying therapeutics for AD.

Ursachen der unterschiedlichen Oligomerisierung von Lichtsammelproteinen

Die verschiedenen Lichtsammelproteine (Lhc-Proteine) höherer Pflanzen unterscheiden sich im Oligomerisierungsverhalten. Im Photosystem II existieren 6 Lhc-Proteine, die entweder die monomeren Lichtsammelkomplexe (LHC) CP24 (Lhcb6), CP26 (Lhcb5) und CP29 (Lhcb4) oder den trimeren LHCII (Lhcb1, Lhcb2 und Lhcb3) bilden. Im Photosystem I sind laut Kristallstruktur vier Lhc-Proteine lokalisiert, die als Heterodimere organisiert vorliegen. Der schwerpunktmäßig untersuchte LHCI-730 setzt sich aus Lhca1 und Lhca4 zusammen, während der LHCI-680 aus Lhca2 und Lhca3 besteht. Das Ziel der Arbeit bestand in der Identifizierung der für das unterschiedliche Oligomerisierungsverhalten verantwortlichen Proteinbereiche und Aminosäuren. Die für diese Arbeit generierten Consensussequenzalignments verschiedener Lhca- und Lhcb-Proteine vieler Arten unterstützen die Folgerungen aus Strukturdaten und anderen Sequenzalignments, dass den LHCs eine gemeinsame Monomerstruktur zu Grunde liegt. Die Helices 1 und 3 weisen weitgehend sehr hohe Sequenzidentitäten auf, während die N- und C-Termini, die zwei Schleifenregionen und die Helix 2 nur schwach konserviert sind. Falls die Bereiche mit hoher Sequenzübereinstimmung für das Zustandekommen ähnlicher monomerer LHC-Strukturen verantwortlich sind, könnten in den schwach konservierten Domänen die Ursachen für das unterschiedliche Oligomerisierungsverhalten lokalisiert sein. Aufgrund dessen wurden die schwach konservierten Domänen des monomerisierenden Lhcb4, des mit dem Lhca1 dimerisierenden Lhca4 und des Trimere bildenden Lhcb1 gegen die entsprechenden Domänen der anderen Proteine ausgetauscht und bezüglich ihres Oligomerisierungsverhaltens untersucht. Im Lhca4 konnten mit der Helix 2 und der stromalen Schleife zwei für eine Heterodimerisierung essentielle Domänen gefunden werden. Im Lhcb1 waren neben dem N-Terminus auch die 2. Helix und die stromale Schleifendomäne unentbehrlich für eine Trimerisierung. Zusätzlich waren Dimerisierung und Trimerisierung bei Austausch der luminalen Schleife beeinträchtigt. Ein geringer Beitrag zur Lhcb1-Trimerisierung konnte auch für den C-Terminus belegt werden. Ein zusätzliches Ziel der Arbeit sollte der Transfer der Oligomerisierungseigenschaften durch umfangreichen Domänentausch von einem auf ein anderes Protein sein. Der Transfer der Fähigkeit zur Dimerbildung durch Substitution gegen essentielle Lhca4-Domänen (50% luminale Schleife, 100% Helix 2 und 100% stromale Schleife) gelang beim Lhcb4, nicht aber beim Lhcb1. Der Transfer der Trimerisierungsfähigkeit auf Lhca4 und Lhcb4 scheiterte. Eine Lhca1-Mutante mit allen für eine Dimerisierung essentiellen Lhca4-Domänen, die durch Interaktion einzelner Moleküle untereinander multimere LHCs bilden sollte, war bereits in ihrer Monomerbildung beeinträchtigt. Eine Übertragung der Oligomerisierungsfähigkeit auf andere Proteine durch massiven Domänentransfer gestaltete sich somit schwierig, da vermutlich im mutierten Protein immer noch ursprüngliche Tertiärstrukturanteile enthalten waren, die nicht mit den transferierten Proteinbestandteilen kompatibel sind. Bei zukünftigen Experimenten zur Klärung der Transferierbarkeit der Oligomerisierungseigenschaft sollten deswegen neben dem unberücksichtigten 1. Teil der luminalen Schleife auch wenig konservierte Aminosäuren in der 1. und 3. Helix Beachtung finden. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war es, die LHCI-730-Dimerisierung im Detail zu untersuchen. Mutationsanalysen bestätigten den von früheren Untersuchungen bekannten Einfluss des Isoleucins 103 und Histidins 99. Letzteres geht möglicherweise durch sein gebundenes Chlorophyll eine Interaktion mit dem Lhca1 ein. Das Phenylalanin 95 stellte sich ebenfalls als ein wichtiger Interaktionspartner heraus und könnte in Wechselwirkung mit einem zwischen Lhca1 und Lhca4 lokalisierten Phosphatidylglycerin treten. Das ebenfalls an der Dimerbildung beteiligte Serin 88 des Lhca4 könnte auf Grund der räumlichen Nähe bei Modellierungen direkt mit dem am C-Terminus des Lhca1 lokalisierten Glycin 190 interagieren. Darüber hinaus wurde ein in der luminalen Lhca4-Schleife lokalisiertes Phenylalanin 84 als Interaktionspartner des Tryptophans 185 im C-Terminus von Lhca1 identifiziert. Der simultane Austausch des Isoleucins 109 und Lysins 110 in der stromalen Schleife des Lhca4, konnte deren Einfluss auf die Dimerisierung belegen. Nachdem bislang an der Dimerbildung beteiligte Aminosäuren am N- und C-Terminus des Lhca1 und Lhca4 identifiziert werden konnten, wurden in dieser Arbeit viele an einer Dimerbildung beteiligten Proteinbereiche und Aminosäuren in der Helix 2 und den Schleifenregionen des Lhca4 identifiziert. Um alle an der Lhca1-Lhca4-Interaktion beteiligten Aminosäuren aufzuklären, müssten durch Mutationsanalysen die in der stromalen Lhca4-Schleife vermuteten Interaktionspartner des für die Dimerisierung wichtigen Tryptophans 4 am N-Terminus von Lhca1 identifiziert, und die in der Helix 3 des Lhca1 vermuteten Interaktionspartner der Helix 2 des Lhca4 ermittelt werden.

Comparative genomics and phylogenetics of the vertebrate CYP3 family

CYP3A verstoffwechselt mehr als 50% aller gegenwärtig in der Therapie eingesetzten Wirkstoffe, die häufig an klinisch relevanten Arzneimitttel-Wechselwirkungen beteiligt sind. Das Verständnis über die Bedeutung und die Regulation von einzelnen CYP3A Genen in der Pharmakologie und Physiologie ist unvollständig. Wir untersuchten die Evolution des CYP3 Genlokus über einen Zeitraum von 450 Millionen Jahre mittels genomischer Sequenzen von 16 Tierarten. Neue CYP3 Unterfamilien (CYP3B, C und D) entstanden über eine beschleunigte Evolution aus CYP3A Vorstufen von Clupeocephala Spezies. Ausgeprägte funktionelle Unterschiede traten zwischen CYP3A in Säugern und Clupeocephala CYP3 auf. Alle amnioten CYP3A Gene entwickelten sich aus zwei CYP3A Urgenen. Aufgrund der Entstehung von Säugern mit Plazenta ging eines von ihnen verloren während das andere eine neue genomische Umgebung infolge einer Translokation erlangte. In Primaten unterzog sich CYP3A mit mehreren Genduplikationen, Deletionen, Pseudogenisierung und Genkonversionen einer raschen evolutionären Veränderung. Die Entwicklung von CYP3A in Schmalnasenaffen (Alte Welt Affen, große Menschenaffen und Menschen) unterschieden sich wesentlich von Neue Welt Primaten (z.B. gewöhnlichen Krallenaffen) und Feuchtnasenaffen (z.B. Galago). Stellvertretend für die CYP3A Protein-codierende Sequenz entdeckten wir zwei frühe Episoden von besonders starker positiver Selektion: (1) auf CYP3A7 in der frühen hominoiden Evolution, welche im fetalen Zeitraum von einer Einschränkung der hepatischen Expression begleitet war, und (2) auf humanes CYP3A4 im Anschluss an die Teilung der Abstammungslinie in Schimpansen und Mensch. In Übereinstimmung mit diesen Befunden beeinflussen drei von vier positiv ausgewählten Aminosäuren, die in früheren biochemischen CYP3A Studien untersucht wurden, die Aktivität und Regioselektivität. Es ist somit naheliegend, dass CYP3A7 und CYP3A4 katalytische Funktionen erworben haben können, die besonders wichtig waren für die Evolution von Hominoiden und Menschen. Die Charakterisierung von CYP3A Promotoren in Primaten zeigte eine Anreicherung von ER6 Elementen in CYP3A Promotoren von Primaten und einen Trend in Richtung Erhöhung der ER6 Enstehung entlang den Abstammungslinien, die zu humanen und Schimpansen CYP3A4 führten. Die steigende Anzahl an ER6 Elementen kann durch die ausgeprägte CYP3A4 Induzierbarkeit und Expressionsvariabilität im Menschen verursacht sein.

Charakterisierung redundanter Kerntransportsignale des minoren Kapsidproteins L2 humaner Papillomviren

Das minore Kapsidprotein L2 humaner Papillomviren wird im Laufe des HPV-Lebenszyklus zweimal in den Zellkern importiert und akkumuliert dort an den Nukleären Domänen 10 (ND10). Der erste Kernimport erfolgt in der frühen Phase der Infektion zusammen mit der Virus-DNA. Für den Zusammenbau von Virionen wird neu synthetisiertes L2-Protein ein weiteres Mal in den Kern transportiert. Im Rahmen dieser Arbeit konnte die Domäne von L2 identifiziert werden, die für den Kernimport von HPV16 L2 absolut notwendig ist. Dabei gelang es diesen Bereich auf 25 Aminosäuren einzuengen. Sowohl während der frühen Phase der Infektion als auch während der Morphogenese scheint die zentrale, basische Aminosäureregion 291-315 (mNLS) hauptverantwortlich für die Interaktion mit Kernimportrezeptoren zu sein. Möglicherweise leisten dabei flankierende Sequenzen einen Beitrag zur Stabilisierung der notwendigen Konformation. Des Weiteren gelang die Identifizierung der Aminosäuren, die für die Funktionalität des mNLS essentiell sind. Hierbei handelt es sich um ein zentrales Arginin-Motiv, bestehend aus vier dicht beieinander liegenden Argininen, dessen Mutation den Kernimport von L2 während Infektion und Morphogenese verhindert. Untersuchungen mit HPV16 und HPV18 L2-Proteinen verdeutlichten, dass es möglicherweise ein universelles Motiv zu sein scheint und in verschiedenen HPV-Typen konserviert ist. Flankiert wird dieses Arginin-Motiv von konservierten Serinen und Threoninen. Wie die Analyse von Punktmutationen zeigte, sind diese Aminosäuren für den Kernimport von L2 ohne Bedeutung. Interessanterweise verhinderte aber die Mutation TS295/6A die Kolokalisation von L2 mit ND10 im Zellkern. L2wt rekrutiert den transkriptionellen Regulator Daxx. Auch diese Funktion ging bei der Mutante TS295/6A verloren. Diese Ergebnisse zeigen, dass nicht nur die ND10-Lokalisationsdomäne (AS 390-420) in L2 sondern auch weitere Aminosäuren oder Domänen für die Assoziation mit ND10 und die Rekrutierung von Daxx verantwortlich sein könnten. Auf der Suche nach zellulären Faktoren, die eine Rolle im mNLS-vermittelten Kernimport spielen, wurde zunächst die Bedeutung von Hsc70 untersucht. Während der Morphogenese maskiert Hsc70 den C-Terminus von L2 und verhindert damit unerwünschte Interaktionen mit Mikrotubuli im Zytoplasma. Es existieren aber weitere noch unbekannte Hsc70-Bindedomänen in L2, die möglicherweise den Kernimport ebenfalls beeinflussen können. Wie die Untersuchungen deutlich machten, ist der zentrale, basische Bereich von L2 aber nicht mit Hsc70 assoziiert und der mNLS-vermittelte Kernimport findet unabhängig von Hsc70 statt. In einem siRNA-Screen wurde anschließend die Rolle von Karyopherinen während der Infektion untersucht. Sowohl Kapß2-siRNA als auch Kapß3-siRNA waren in der Lage unabhängig voneinander die Infektion von HPV16-Pseudovirionen zu reduzieren. Für beide Karyopherine konnte in der Vergangenheit in vitro die Interaktion mit HPV16 L2 nachgewiesen werden. Das L2-Protein ist das einzige virale Protein, das während der Infektion die Virus-DNA in den Kern begleitet (Day et al., 2004). Demzufolge ist es auch das einzige virale Protein, das mit Importinen während der Infektion interagiert. Möglicherweise sind also beide Karyopherine in der Lage sein L2 während der Infektion in den Kern zu importieren. Abschließend wurden Präzipitationsversuche durchgeführt, die zur Identifizierung möglicher Bindungspartner des mNLS führen sollten. In diesen Versuchen konnte eine erhöhte Bindungsaffiniät zu den beiden Importinen Kapß1 und Kapß2 festgestellt werden. Möglicherweise ist das L2-Protein mit seiner mNLS in der Lage mehrere Importrezeptoren zu binden und für den Kernimport zu nutzen. Eines dieser Importine ist Kapß2. Dieser Importrezeptor scheint sowohl bei der Infektion als auch während der Morphogenese den Kernimport von L2 durch die Bindung an das mNLS zu vermitteln.

Speziation mikrobiologisch alkylierter, leichtflüchtiger Selenverbindungen in Abhängigkeit der geochemischen Verfügbarkeit des Selens

Selen kann in verschiedenen Oxidationszuständen (+6, +4, ±0, -2) in unterschiedlichen Umweltkompartimenten auftreten. Verbundenen damit sind verschiedene Eigenschaften, wie z. B. die Wasserlöslichkeit, die in direktem Zusammenhang mit der Migrationsfähigkeit sowie der Bioverfügbarkeit steht. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden die Verfügbarkeit anorganischer Selenspezies und damit die Mobilisierbarkeit dieser in verschiedenen Laborexperimenten untersucht. Hierbei wurde an Goethit adsorbiertes Selenit sowohl mit einer Reinkultur des aktiv methylierenden Pilzes Alternaria alternata als auch mit einer angereicherten Umweltmischkultur inkubiert und die mikrobiologische Zugänglichkeit anhand der Bildung leichtflüchtiger, alkylierter Selenmetabolite wie z. B. Dimethylselenid und Dimethyldiselenid beobachtet. Zur Analyse dieser wurde eine cryotrapping-cryofocussing-GC-ICP-MS-Kopplung etabliert. Die Anteile der methylierten Selenverbindungen stiegen bei Verwendung von A. alternata mit der Inkubationszeit auf 10 % des gelösten Selens und 1 % des Gesamtselens an. Dieser Trend konnte während der Inkubation der Umweltmischkultur nicht beobachtet werden. Hier lagen die Anteile über den gesamten Untersuchungszeitraum bei ca. 0,5 % des gelösten bzw. 0,1 % des Gesamtselens, inklusive eines leichten Abwärtstrends, welcher wahrscheinlich durch die Nutzung der Alkylselenide als Kohlenstoffquelle hervorgerufen wurde. Weiterhin wurde das reduzierte Eisenselenidmineral Ferroselit eingesetzt, um dessen Stabilität gegenüber der Aktivität des sulfatreduzierenden Bakteriums Desulfovibrio gigas zu untersuchen. Mit zunehmender Inkubationszeit und damit verbundener, zunehmender Reduktion des im Nährmedium vorhandenen Sulfates konnte ein Anstieg leichtflüchtiger Organoselenverbindungen in der Gasphase der Kulturansätze festgestellt werden, die im unteren Nanogrammbereich lagen. Einhergehend damit wurde auch die Zunahme der Gehalte an gelöstem Selen und somit die biologisch bedingte Rücklösung aus der Mineral- in die Wasserphase beobachtet. Es konnte gezeigt werden, dass die Aktivität von Mikroorganismen einen deutlichen Einfluss auf die Stabilität von Oberflächenkomplexen des Selenits als auch von mineralischen Selenidspezies hat.

Escherichia coli alpha-Hämolysin: Untersuchungen zur Struktur und Porenbildung

Escherichia coli α-Hämolysin (HlyA) ist ein Prototyp der RTX-Toxine, die zu den α-porenbildenden Toxinen gehören. HlyA bildet Poren in einer Vielzahl eukaryontischer Zielzellen. Das 107 kDa große Protein besteht aus 1024 Aminosäuren, die gemeinsam mit den Proteinen für posttranslationale Modifikation und Sekretion in einem Operon codiert werden. Die N-terminale Hälfte von HlyA besteht aus mehreren amphipathischen α –Helices, die mit der Porenbildung assoziiert werden, gefolgt von der Calcium-bindenden RTX-Domäne in der C-terminalen Hälfte des Moleküls. Über den porenbildenen Mechanismus ist wenig bekannt. Die vorliegende Arbeit fokussierte sich auf die Frage, ob dieser Prozess eine Oligomerisierung mehrerer HlyA-Moleküle beinhaltet, oder ob die membranschädigende Struktur von einem Monomer gebildet wird. Drei unabhängige biochemische Methoden wurden in dem Versuch eingesetzt, HlyA-Oligomere in permeabilisierten Membranen zu detektieren. In allen drei Ansätzen wurden negative Ergebnisse erreicht, was das Konzept bestätigt, dass die Pore von HlyA von einem Monomer gebildet wird. PCR-basierte Cysteinsubstitutionen wurden durchgeführt, um den N-terminus von HlyA zu charakterisieren. Einzelne Cysteinreste wurden an 21 Positionen innerhalb der Aminosäuresequenz 13-55 eingeführt, und mit dem umgebungssensitiven Fluorophor Badan markiert. Spektrofluorimetrische Messungen zeigten, dass alle untersuchten Aminosäuren innerhalb dieser Domäne unabhängig von der porenbildenden Aktivität in die Membran inserieren. Deletionen der Aminosäuren 1-50 hatten keinen Einfluß auf die lytische Aktivität, während die Deletion der Aminosäuren 1-100 in einer fast vollständig inaktiven Toxinmutante resultierte. Die Einführung von Prolinen durch PCR-basierte Mutagenese wurde durchgeführt, um die Beteiligung vorhergesagter α-Helices innerhalb der N-terminalen Hälfte von HlyA an der hämolytischen Aktivität zu untersuchen. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Struktur von mindestens vier vorhergesagten Helices bedeutend für die hämolytische Aktivität ist.

Die Identifizierung und Charakterisierung von HLA-Klasse-I-restringierten Minorhistokompatibilitätsantigenen und Leukämie-assoziierten Antigenen mittels cDNA-Expressionsklonierung

Die allogene hämatopoetische Stammzelltransplantation (allo-HSCT) bietet bei einem hohen Anteil akuter Leukämien die einzige kurative Behandlungsmöglichkeit. Um die mit ihr assoziierte Morbidität und Mortalität zu senken und ihre Effektivität zu steigern, soll die GvL (graft-versus-leukemia)-Reaktion als eigentliches Therapieziel gegenüber der unerwünschten GvHD (graft-versus-host disease) möglichst selektiv verstärkt werden. Wesentliche Mediatoren beider Effekte sind alloreaktive T-Zellen. Bei HLA-Übereinstimmung zwischen Spender und Empfänger sind so genannte Minorhistokompatibilitätsantigene (mHAgs) und Leukämie-assoziierte Antigene (LAA) die mutmaßlichen Zielstrukturen beider Reaktionen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden in dem Leukämie-Modell der Patientin MZ201 [akute myeloische Leukämie (AML) vom Subtyp FAB M5] mittels T-Zell-basierter cDNA-Expressionsklonierung zwei neue Antigene identifiziert, die von allogenen, AML-reaktiven CD8+ T-Lymphozyten aus Blut eines HLA-passenden gesunden Spenders erkannt wurden. Es handelt sich zum einen um das HLA-B*5601-restringierte mHAg PLAUR-317P, das aus einem Polymorphismus des Gens PLAUR (plasminogen activator, urokinase receptor) resultiert. Das von den T-Zellen am Besten erkannte Peptid enthält die Aminosäuren 316 - 327. PLAUR wird in lymphohämatopoetischen Zellen und in verschiedenen Malignomen überexprimiert und ist dabei mit schlechterer Prognose und vermehrter Gewebeinvasivität assoziiert. Etwa 30% getesteter Individuen tragen das Allel PLAUR-317P. Zum anderen handelt es sich um ein Epitop aus der Signalregion des Chemokins CXCL3 [chemokine (C-X-C motif) ligand 3], das von CD8+ T-Zellen des gleichen Spenders auf Leukämiezellen der Patientin MZ201 in Assoziation mit HLA-A*0201 erkannt wurde. Auch CXCL3 wird vorwiegend in Zellen der Myelopoese exprimiert. Aufgrund ihres Expressionsmusters sind beide Antigene potentielle Zielstrukturen für die Elimination der Empfänger-Hämatopoese unter Einschluss der Leukämieblasten im Rahmen der allo-HSCT. Weiterführende Untersuchungen müssen zeigen, ob diese Antigene tatsächlich in vivo GvL-Reaktionen hervorrufen. Die Kenntnis eines repräsentativen Spektrums solcher Antigene würde verbesserte Spenderselektionen erlauben und neue Wege des adoptiven T-Zelltransfers erschließen helfen.

Isolierung und Identifizierung von wachstumsfördernden Substanzen für das weinrelevante Bakterium Oenococcus oeni aus Fruchtsäften und Blattextrakten

Neben Tomatensaft wurde eine Vielzahl von Säften und Blattextrakten als Medienzusätze auf Wachstumsförderung bei 30 verschiedenen Oenococcus oeni-Stämmen getestet. Es zeigte sich eine breite Wachstumsförderung bei allen Zusätzen mit Ausnahme von Zitronensaft, sodass die Wachstumsfaktoren keine tomatenspezifischen Inhaltsstoffe sein können und eher ubiquitär in der Pflanzenwelt vorkommen. Das Ausmaß der Wachstumsförderung war stammabhängig sehr unterschiedlich und Tomatensaft stellte keineswegs für alle Stämme den optimalen Medienzusatz dar. Durch Schälen der Früchte war eine für die Analytik hilfreiche Abtrennung schalenspezifischer Inhaltsstoffe möglich, wobei auch die Schalenextrakte großes Potential für die Suche nach Wachstumsfaktoren offenbarten und die Wichtigkeit einer Auftrennung der Frucht in die verschiedenen Fruchtbereiche betonte. Aus Tomatensaft konnte analytisch der anorganische Wachstumsfaktor Mangan identifiziert werden. Die größten Zelldichten der Oenokokken-Stämme wurden hierbei bei 67 µM und 34 mM Manganzusatz erreicht. Bei 13 von 20 getesteten Oenokokkenstämmen konnte bei Zusatz von 34 mM Mangan der Tomatensaft ersetzt werden, bei 4 Stämmen (z. B. Stamm B2) fehlten jedoch noch weitere Wachstumsfaktoren und bei 3 Stämmen (z. B. Stamm B120) kam es zu einem verfrühten Absterben. Da weitere Mineralstoffe sowie veraschte Säfte und Blattextrakte keinen positiven Einfluß auf die Oenokokken-Zelldichte hatten, wurde mittels semipräparativer HPLC nach zusätzlichen organischen Wachstumsfaktoren für den Stamm B2 gesucht. Hierzu wurde der nachfolgende Wachstums-Assay miniaturisiert und erfolgreich auf Microtiterplatten etabliert. Es gelang die Isolierung und Identifizierung eines wachstumsfördernden Trisaccharides aus Mangoschalen-Extrakt, das aus den Zuckern Glucose, Rhamnose und Arabinose bestand. Von den monomeren Zuckern erhöhte lediglich die Arabinose die Zelldichte, das Optimum lag bei 1,5 g/l. Auch aus Zitronenmesokarp-Extrakt war die Isolierung eines wachstumsfördernden arabinosehaltigen Disaccharides möglich, die Menge reichte jedoch noch nicht für eine genaue Identifizierung aus. Desweiteren erwies sich 1,5 g/l Cystein als wachstumsstimulierend. Ein Zusatz aller gefundenen Wachstumsfaktoren (34 mM Mangan, 1,5 g/l Arabinose und 1,5 g/l Cystein) ersetzte den Tomatensaft bei weiteren Oenokokken-Stämmen (z.B. Stamm B120) komplett, wobei bei allen Stämmen sogar eine schnellere Anzucht erfolgte. Neben dem Tomatensaft war auch der Zusatz von Hefeextrakt zum Grundmedium nicht mehr nötig, sodass ein neues vereinfachtes Medium für die Anzucht von Oenokokken mit komplexen Nährstoffansprüchen vorgeschlagen werden konnte. Lediglich beim Stamm B2 zeigte sich noch ein OD-Unterschied von 0,2 in der stationären Phase, der nach Adsorptionsversuchen an Polyvinylpolypyrrolidon auf noch unidentifizierte Polyphenole im Tomatensaft zurückzuführen ist. Aus grünem Tee erwies sich das Polyphenol Epigallocatechingallat (EGCG) konzentrationsabhängig sowohl als Hemmstoff (>550 mg/l EGCG) als auch Wachstumsfaktor (400-500 mg/l EGCG) für den Oenokokken-Stamm B2. Der hemmende als auch der fördernde Einfluss auf das Wachstum wurde mittels Sytox/DAPI-Färbung bestätigt. Der sogenannte „Tomatensaft-Faktor“ ist also nicht eine spezielle Substanz, sondern das synergistische Zusammenwirken mehrerer einfacher Substanzen wie Mineralstoffe, Aminosäuren, Kohlenhydrate und Polyphenole. Auch sind die Oenokokken-Stämme bezüglich ihres Nährstoffbedarfes sehr unterschiedlich, sodass für jeden Stamm einzeln das optimale Substratspektrum ermittelt werden muss.

Phylogenomische Analysen bei Metazoen - Zur Stellung der Xenoturbellida und Syndermata

Im Rahmen der vorliegenden Dissertation wurde die phylogenetischen Stellungen der Xenoturbellida (Deuterostomia) und der Syndermata (Protostomia) mit phylogenomischen Techniken untersucht. Auf methodischer Ebene konnte gezeigt werden, dass ribosomale Proteine aufgrund ihres mittleren bis hohen Konservierungsgrades, ihrer Häufigkeit in kleineren EST-Projekten, damit verbunden ihrer Häufigkeit in Datenbanken und ihres phylogenetischen Informationsgehalts nützliche Werkzeuge für phylogenetische Fragestellungen sind. Es konnte durch phylogenetische Rekonstruktionen und Hypothesentests auf Basis eines 11.912 Aminosäuren langen Datensatzes gezeigt werden, dass die Xenoturbellida innerhalb der Deuterostomia eine Schwestergruppenbeziehung zu den Ambulacraria eingehen. Diese Arbeit zeigt im Vergleich aller bisher durchgeführten Arbeiten die beste statistische Unterstützung für diese Topologie. Weiterhin konnte untermauert werden, dass die Urochordata vermutlich anstelle der Cephalochordata die Schwestergruppe der Vertebrata sind. Der Vergleich der publizierten Xenoturbella EST-Datensätze mit dem eigenen Datensatz ließ den Rückschluß zu, dass ESTs offenbar klar weniger anfällig gegen Kontaminationen mit Erbmaterial (DNA+RNA) anderer Spezies sind als PCR-Amplifikate genomischer oder mitochondrialer Gene. Allerdings bestimmt anscheinend der physiologische Zustand der Tiere die Repräsentation von Transkriptklassen wie Stressproteine und mitochondriale Transkripte. Die bakteriellen Transkripte in einem der EST-Datensätze stammen vermutlich von Chlamydien, die möglicherweise symbiontisch in Xenoturbella bocki leben. Im Bereich der Protostomia wurden drei EST-Projekte für Vertreter der Syndermata durchgeführt. Basierend auf drei verschiedenen Proteinalignment-Datensätzen von ca. 11.000 Aminosäuren Länge konnte gezeigt werden, dass die Syndermata innerhalb der Spiralia einzugruppieren sind und dass sie mit den Gnathostomulida das monophyletische Supertaxon Gnathifera bilden. Die genaue phylogenetische Position der Syndermata innerhalb der Spiralia konnte hingegen noch nicht eindeutig geklärt werden, ebenso wie kein kongruenter Beweis für die Existenz des Supertaxons Platyzoa gefunden werden konnte. Im Rahmen der Untersuchung der internen Phylogenie der Syndermata konnten drei der fünf konkurrierenden Hypothesen aufgrund der Paraphylie der Eurotatoria ausgeschlossen werden. Da keine Daten der Seisonidea in den Analysen implementiert waren, bleibt die Frage der internen Phylogenie der Syndermata letztlich offen. Klar ist jedoch, dass die Eurotatoria nicht wie bislang angenommen monophyletisch sind, da die räderorgantragenden Bdelloidea keinesfalls den morphologisch diesbezüglich ähnlichen Monogononta ähnlich sind, sondern den räderorganlosen Acanthocephala näher stehen. Die Abbildung der molekularen Phylogenie auf die morphologischen Verhältnisse zeigt, dass das Räderorgan (partiell oder komplett) offenbar kurz nach der Aufspaltung der Syndermata in Monogononta und Acanthocephala + Bdelloidea in der Acanthocephala + Bdelloidea-Linie reduziert wurde. Die Entstehung des einziehbaren hinteren Körperteils (Rostrum bei Bdelloidea bzw. Proboscis bei Acanthocephala) in der Acanthocephala + Bdelloidea-Linie könnte das Schlüsselereignis zur Entstehung des Endoparasitismus der Acanthocephala gewesen sein.

Morphologischer und biochemischer Aufbau von Silikatnadeln der Hexactinelliden am Beispiel von Monorhaphis chuni

Schon 1904 beschrieb Schulze den Aufbau von Silikatnadeln des Schwammes Monorhaphis chuni, eines Mitglieds der zweiten Familie von biosilifizierenden Schwämmen, den Hexactinelliden (Glasschwämmen). Weitergehende morphologische Untersuchungen und biochemische Analysen insbesondere mit modernen Methoden wurden an Hexactinelliden bisher kaum durchgeführt. Ziel der vorliegenden Arbeit bestand deshalb darin, Untersuchungen zur Morphologie, der chemischen Zusammensetzung, der Verteilung und Charakterisierung der beteiligten anorganischen und organischen Komponenten sowie einen molekularbiologischer Nachweis der Existenz von Silicatein in Hexactinelliden durchzuführen. Für diese Untersuchungen wurden zwei Spezies verwendet: Monorhaphis chuni und Crateromorpha meyeri. Mittels Elektronen-Mikrosonden-Technik wurde an Querschnitten der Pfahlnadel von M. chuni die Verteilung der Elemente innerhalb der Nadel untersucht. Am äußeren Rand der Nadel (150 µm) traten im Vergleich zur Nadelmitte prägnante Unterschiede in der Konzentration von Kaliumoxid und Natriumoxid auf. Diese Ergebnisse deuten auf das Vorhandensein eines ähnlichen Transportsystems zur Anreicherung von Silizium/Silikat bei der Nadelbildung hin, wie es bereits in S. domuncula bekannt ist. Mit elektronen- und lichtmikroskopischen Untersuchungen wurden die organischen Substanzen der Silikatnadel nachgewiesen und deren Verteilung innerhalb dieser Nadeln analysiert. In der lamellaren Zone befindet sich, eine säurelabile organische Netzstruktur, sowie eine, die Silikatschichten durchspannende, säulenähnliche Struktur. Im Axialzylinder zeigt das organische Material eine leicht verzweigte fibrilläre Anordnung. Mit biochemischen Verfahren wurden die organischen Komponenten der Nadeln detaillierter untersucht. Mehrere Proteine mit Molekulargewichten von 17, 24, 27 ,30, 36 und 70 kDa wurden durch gelelektrophoretische Analysen von Material der Pfahlnadel identifiziert. Die Analyse isolierter Anteile der lamellaren Zone zeigte ausschließlich ein 27 kDa Protein. Die restlichen Proteinbanden konnten hier nicht nachgewiesen werden. Das 27 kDa Protein reagierte im Westernblot mit Antikörpern gegen Silicatein aus S. domuncula. Ein weiteres Protein wurde näher charakterisert. Ein positiver Agglutinationsassay wies ein lectinähnliches Molekül innerhalb der Nadeln nach, wie es aus S. domuncula bekannt ist. Nach einer Deglycolysierung der Proteine reduzierte sich das scheinbare Molekulargewicht der 36 kDa Bande auf 30 kDa. Durch molekularbiologische Untersuchungen wurde erstmals in Hexactinelliden die Existenz von Silicatein nachgewiesen. Nach Isolierung der Gesamt-RNA von Crateromorpha meyeri, RT-PCR und Amplifizierung mit silicateinspezifischen Primern wurde eine 549 kBp Nukleotidsequenz gefunden, die auf Aminosäureebene starke Homologien (76% identische Aminosäuren) zu bekannten Silicateinen der Demospongia aufweist. Die Aminosäuren der katalytische Triade des Silicateins, essenziell für die enzymatische Katalyse des Enzyms, sind an den selben Positionen wie bei bekannten Silicateinen vorhanden.