Use-dependent block of the voltage-gated Na+ channel by tetrodotoxin and saxitoxin: Effect of pore mutations that change ionic selectivity.

Voltage-gated Na(+) channels (NaV channels) are specifically blocked by guanidinium toxins such as tetrodotoxin (TTX) and saxitoxin (STX) with nanomolar to micromolar affinity depending on key amino acid substitutions in the outer vestibule of the channel that vary with NaV gene isoforms. All NaV channels that have been studied exhibit a use-dependent enhancement of TTX/STX affinity when the channel is stimulated with brief repetitive voltage depolarizations from a hyperpolarized starting voltage. Two models have been proposed to explain the mechanism of TTX/STX use dependence: a conformational mechanism and a trapped ion mechanism. In this study, we used selectivity filter mutations (K1237R, K1237A, and K1237H) of the rat muscle NaV1.4 channel that are known to alter ionic selectivity and Ca(2+) permeability to test the trapped ion mechanism, which attributes use-dependent enhancement of toxin affinity to electrostatic repulsion between the bound toxin and Ca(2+) or Na(+) ions trapped inside the channel vestibule in the closed state. Our results indicate that TTX/STX use dependence is not relieved by mutations that enhance Ca(2+) permeability, suggesting that ion-toxin repulsion is not the primary factor that determines use dependence. Evidence now favors the idea that TTX/STX use dependence arises from conformational coupling of the voltage sensor domain or domains with residues in the toxin-binding site that are also involved in slow inactivation.

Proteomic analysis of the shistosome tegument and its surface membranes

The tegument surface of the adult schistosome, bounded by a normal plasma membrane overlain by a secreted membranocalyx, holds the key to understanding how schistosomes evade host immune responses. Recent advances in mass spectrometry (MS), and the sequencing of the Schistosoma mansoni transcriptome/genome, have facilitated schistosome proteomics. We detached the tegument from the worm body and enriched its surface membranes by differential extraction, before subjecting the preparation to liquid chromatography-based proteomics to identify its constituents. The most exposed proteins on live worms were labelled with impearmeant biotinylation reagents, and we also developed methods to isolate the membranocalyx for analysis. We identified transporters for sugars, amino acids, inorganic ions and water, which confirm the importance of the tegument plasma membrane in nutrient acquisition and solute balance. Enzymes, including phosphohydrolases, esterases and carbonic anhydrase were located with their catalytic domains external to the plasma membrane, while five tetraspanins, annexin and dysferlin were implicated in membrane architecture. In contrast, few parasite proteins could be assigned to the membranocalyx but mouse immune response proteins, including three immunoglobulins and two complement factors, were detected, plus host membrane proteins such as CD44, integrin and a complement regulatory protein, testifying to the acquisitive properties of the secreted bilayer.

Bacillus subtilis alpha-phosphoglucomutase is required for normal cell morphology and biofilm formation.

Mutations designated gtaC and gtaE that affect alpha-phosphoglucomutase activity required for interconversion of glucose 6-phosphate and alpha-glucose 1-phosphate were mapped to the Bacillus subtilis pgcA (yhxB) gene. Backcrossing of the two mutations into the 168 reference strain was accompanied by impaired alpha-phosphoglucomutase activity in the soluble cell extract fraction, altered colony and cell morphology, and resistance to phages phi29 and rho11. Altered cell morphology, reversible by additional magnesium ions, may be correlated with a deficiency in the membrane glycolipid. The deficiency in biofilm formation in gtaC and gtaE mutants may be attributed to an inability to synthesize UDP-glucose, an important intermediate in a number of cell envelope biosynthetic processes.

Molecular basis of interaction between Na,K-ATPase and FXYD proteins.

R��sum�� au large public Notre corps est constitu�� de diff��rents types de cellules. La condition minimale ou primordiale pour la survie des cellules est d'avoir de l'��nergie. Cette t��che est assum��e en partie par une prot��ine qui se situe dans la membrane de chaque cellule. Nomm�� Na, K��ATPase ou pompe �� sodium, c'est une prot��ine pressente dans toutes les cellules chez les mammif��res est compos��e de deux sous-unit��s, α et β. En transportant 3 ions de sodium hors de la cellule et 2 ions de potassium �� l'int��rieur de la cellule, elle transforme l'��nergie chimique sous forme de l'ATP en ��nergie motrice, qui permet aux cellules par la suite d'��changer des mat��riaux entre l'espace intracellulaire et extracellulaire ainsi que d'ing��rer des nutriments provenant de son environnement. Le manque de cette prot��ine chez la souris entra��ne la mort de l'embryon. Des d��fauts fonctionnels de cette prot��ine sont responsables de plusieurs maladies humaines comme par exemple, un type de migraine. En dehors de sa fonction vitale, cette prot��ine est ��galement engag��e dans diverses activit��s physiologiques comme la contractilit�� musculaire, l'activit�� nerveuse et la r��gulation du volume sanguin. Vue l'importance de cette prot��ine, sa d��couverte par Jens C. Skou en 1957 a ��t�� honor��e d'un Prix Noble de chimie quarante ans plus tard. Depuis lors, nous connaissons de mieux en mieux les m��canismes de fonctionnement de la Na, K-ATPase. Entre autre, sa r��gulation par une famille de prot��ines appel��es prot��ines FXYD. Cette famille contient 7 membres (FXYD 1-7). L'un d'entre eux nomm�� FXYD 2 est li�� �� une maladie h��r��ditaire connue sous le nom de hypomagnesemia. Nous disposons actuellement d'informations concernant les cons��quences de la r��gulation par les prot��ines FXYD sur activit�� de la Na, K-ATPase, mais nous savons tr��s peu sur le mode d'interaction entre les prot��ines FXYD et la Na, K-ATPase. Dans ce travail de th��se, nous avons r��ussi �� localiser des zones d'interaction dans la sous- unit�� a de la Na, K-ATPase et dans FXYD 7. En m��me temps, nous avons d��termin�� un 3��me site de liaison sp��cifique au sodium de la Na, K-ATPase. Une partie de ce site se situe �� l'int��rieur d'un domaine prot��ique qui interagit avec les prot��ines FXYD. De plus, ce site a ��t�� d��montr�� comme responsable d'un m��canisme de transport de la Na, K-ATPase caract��ris�� par un influx ionique. En conclusion, les r��sultats de ce travail de th��se fournissent de nouvelles preuves sur les r��gions d'interaction entre la Na, K-ATPase et les prot��ines FXYD. La d��termination d'un 3��me site sp��cifique au sodium et sa relation avec un influx ionique offrent la possibilit�� 1) d'explorer les m��canismes avec lesquels les prot��ines FXYD r��gulent l'activit�� de la Na, ATPase et 2) de localiser un site �� sodium qui est essentielle pour mieux comprendre l'organisation et le fonctionnement de la Na, K-ATPase. R��sum�� Les gradients de concentration de Na+ et de K+ �� travers la membrane plasmatique des cellules animales sont cruciaux pour la survie et l'hom��ostasie de cellules. De plus, des fonctions cellulaires sp��cifiques telles que la reabsorption de Na dans le rein et le c��lon, la contraction musculaire et l'excitabilit�� nerveuse d��pendent de ces gradients. La Na, K��ATPase ou pompe �� sodium est une prot��ine membranaire ubiquitaire. Elle cr��e et maintient ces gradients en utilisant l'��nergie obtenu par l'hydrolyse de l'ad��nosine triphosphate. L'unit�� fonctionnelle minimale de cette prot��ine se compose d'une sous-unit�� catalytique α et d'une sous-unit�� r��gulatrice β. R��cemment, il a ��t�� montr�� que des membres de la famille FXYD, sont des r��gulateurs tissu-sp��cifiques de la Na, K-ATPase qui influencent ses propri��t��s de transport. Cependant, on conna��t peu de chose au sujet de la nature mol��culaire de l'interaction entre les prot��ines FXYD et la Na, K-ATPase. Dans cette ��tude, nous fournissons, pour la premi��re fois, l'��vidence directe que des r��sidus du domaine transmembranaire (TM) 9 de la sous-unit�� α de la Na, K-ATPase sont impliqu��s dans l'interaction fonctionnelle et structurale avec les prot��ines FXYD. De plus nous avons identifi�� des r��gions dans le domaine transmembranaire de FXYD 7 qui sont importantes pour l'association stable avec la Na, K-ATPase et une s��rie de r��sidus responsables des r��gulations fonctionnelles. Nous avons aussi montr�� les contributions fonctionnelles du TM 9 de la Na, K-ATPase �� la translocation de Na + en d��terminant un 3��me site sp��cifique au Na+. Ce site se situe probablement dans un espace entre TM 9, TM 6 et TM 5 de la sous-unit�� α de la pompe �� sodium. De plus, nous avons constat�� que le 3��me site de Na + est fonctionnellement li�� �� un courant entrant de la pompe sensible �� l'ouaba��ne et activ�� par le pH acide. En conclusion, ce travail donne de nouvelles perspectives de l'interaction structurale et fonctionnelle entre les prot��ines FXYD et la Na, K-ATPase. En outre, les contributions fonctionnelles de TM 9 offrent de nouvelles possibilit��s pour explorer le m��canisme par lequel les prot��ines FXYD r��gulent les propri��t��s fonctionnelles de la Na, K-ATPase. La d��termination du 3��me site au Na + fournit une compr��hension avanc��e du site sp��cifique au Na + de la Na, K-ATPase et du m��canisme de transport de la Na, K-ATPase. Summary The Na+ and K+ gradients across the plasma membrane of animal cells are crucial for cell survival and homeostasis. Moreover, specific tissue functions such as Na+ reabsorption in kidney and colon, muscle contraction and nerve excitability depend on the maintenance of these gradients. Na, K-ATPase or sodium pump, an ubiquitous membrane protein, creates and maintains these gradients by using the energy from the hydrolysis of ATP. The minimal functional unit of this protein is composed of a catalytic α subunit and a regulatory β subunit. Recently, members of the FXYD family, have been reported to be tissue-specific regulators of Na, K-ATPase by influencing its transport properties. However, little is known about the molecular nature of the interaction between FXYD proteins and Na, K-ATPase. In this study, we provide, for the first time, direct evidence that residues from the transmembrane (TM) domain 9 of the α subunit of Na, K-ATPase are implicated in the functional and structural interaction with FXYD proteins. Moreover, we have identified regions in the TM domain of FXYD 7 important for the stable association with Na, K-ATPase and a stretch of residues responsible for the functional regulations. We have further revealed the functional contributions of TM 9 of the Na, K-ATPase α subunit to the Na+ translocation by determining a 3rd Na+-specific cation binding site. This site is likely in a space between TM 9, TM 6 and TM 5 of the a subunit of the sodium pump. Moreover, we have found that the 3rd Na+ binding site is functionally linked to an acidic pH- activated ouabain-sensitive inward pump current. In conclusion, this work gives new insights into the structural and functional interaction between FXYD proteins and Na, K-ATPase. Functional contributions of TM 9 offer new possibilities to explore the mechanism by which FXYD proteins regulate functional properties of Na, K-ATPase. The determination of the 3rd Na+ binding site provides an advanced understanding concerning the Na+ -specific binding site of Na, K-ATPase and the 3rd Na+ site related transport mechanism.

Acid-sensing ion channels : modulation by serine-proteases and involvement in acid-induced action potential generation in hippocampal neurons

SUMMARY Acid-sensing ion channels (ASICs) are non-voltage gated sodium channels. They are activated by rapid extracellular acidification and generate an inactivating inward current. Four ASIC genes have been cloned: ASIC1, 2, 3 and 4, with variants a and b for ASIC1and AS1C2. ASICs are expressed in neurons of the central (CNS) and peripheral nervous system (PNS). In the CNS, ASICs have a role in learning, memory, as well as in neuronal death in ischemia. In the PNS, ASICs are involved in the perception of acid-induced pain, as well as in mechanoperception. In one part of my thesis project, we addressed the question of the mechanism of regulation of ASIC1 a by the serine protease trypsin at the molecular level. Trypsin modifies the function of ASIC1 a but not of ASIC1b. In order to identify the channel region responsible for this effect, we created chimeras between ASIC1 a and 1b. Subsequently, to identify the exact trypsin target(s), we mutated predicted trypsin sites in the region identified by the chimera. In the second part of a project, we investigated the role of ASICs at the cellular level, in neuronal signaling. Using the whole-cell patch clamp in hippocampal neuronal culture, we studied the potential involvement of ASICs in action potential (AP) generation. In the first part of the thesis work, we showed that trypsin modifies ASIC1a function: it shifts the pH activation and the steady-state inactivation curve towards more acidic values and accelerates the time course of the channel recovery from inactivation. We also showed that trypsin cleaves ASIC1a and that the functional effect and a channel cleavage correlate. In the inactivated state, channels cannot be modified by trypsin. Cleavage occurs in a channel region that is also important for inactivation of all ASICs; a part of this region is critical for the inhibition of ASIC1 a by the spider toxin Psalmotoxin1. In the second part of the thesis work, we showed that ASIC activity can modulate AP generation. ASIC activity by itself can induce trains of APs. In situations in which this activity by itself is not sufficient to induce APs, it can contribute to AP generation. During high neuronal activity, ASIC activity can block already existing trains of APs. In conclusion, depending on the activity of neuron in a particular moment, ASICs can differently modulate AP generation; they can induce, facilitate or inhibit APs. We also showed that trypsin changes the capability of ASICs to modulate AP generation by shifting the pH dependence to more acidic values, which adapts channel gating to pH conditions which may occur in pathological conditions such as ischemia. Our finding that trypsin modifies ASIC1 a function identifies a novel pharmacological tool, and proposes a mechanism of ASIC1a regulation that may have a physiological importance. The identification of the exact site of trypsin action gives insight to the molecular mechanisms of ASIC regulation. This work proposes a role in modulation of AP generation for ASICs in the CNS. RESUME Les canaux ASIC sont les canaux ioniques activ��s par l'acidification rapide extracellulaire. Activ��s, ils g��n��rent un courant entrant qui inactive en pr��sence de stimulus acide. Quatre g��nes ASIC ont ��t�� clon��s, ASIC1, 2, 3 et 4, avec les variants a et b pour ASIC1 et 2. Les ASICs sont exprim��s dans les neurones du syst��me nerveux central (SNC) et p��riph��rique (SNP). Dans le SNC, les ASIC ont un r��le dans le m��moire, apprentissage et la mort neuronale dans t'isch��mie. Dans le SNP, ils ont un r��le dans la perception de la douleur et m��chanosensation. Dans une partie de mon projet de th��se, nous avons ��tudi�� les m��canismes de la r��gulation d'ASIC1a par la s��rine-prot��ase trypsine au niveau mol��culaire. La trypsine modifie la fonction d'ASIC1a et pas ASIC1b. Nous avons cr���� les chim��res entre ASIC1 a et 1 b, afin d'identifier la r��gion du canal responsable pour l'effet. Pour identifier le(s) site(s) exactes de l'action de la trypsine, nous avons mut�� les sites potentiels de la trypsine dans la r��gion identifi��e par les chim��res. Dans la deuxi��me partie du projet, nous avons ��tudi�� le r��le des ASICs au niveau cellulaire. En utilisant la technique du patch clamp dans les cultures des neurones de l'hippocampe, nous avons ��tudi�� l'implication des ASICs dans la g��n��ration des potentiels d'action (PA). Nous avons montr�� que la trypsine agit sur le canal ASIC1a ; elle d��cale l'activation et �� steady-state �� inactivation vers les valeurs plus acides, et elle raccourcit le temps du �� recovery �� du canal. La trypsine coupe ASIC1a sur le r��sidu K145 et l'effet fonctionnel et la coupure corr��lent. Nous avons identifi�� la r��gion du canal responsable pour l'inactivation de tous les ASICs ; une partie de cette r��gion est responsable pour ['inhibition d'ASIC1 a par la Psalmotoxinel . Nous avons montr�� que les ASICs peuvent moduler la g��n��ration des PAs. L'activit�� des ASICs peut induire les trains des PAs. Quand l'activit�� des ASICs n'est pas suffisante pour induire le PA, elle peut contribuer �� sa g��n��ration. Pendant l'activit�� neuronale forte, l'activit�� des ASICs peut bloquer les trains des PAs qui existent d��j��. En conclusion, d��pendant de l'activit�� neuronale, les ASICs peuvent moduler la g��n��ration des PAs diff��remment ; ils peuvent induire, faciliter ou inhiber les PAs. La trypsine change la capacit�� des ASICs de moduler les PAs. Apr��s l'action de la trypsine, les ASICs peuvent moduler la g��n��ration des PAs dans les conditions l��g��rement acides, suivies par les fluctuations du pH acide, qui peuvent exister dans l'isch��mie. Le fait que la trypsine agit sur ASIC1a d��finit l'outil pharmacologique et propose le m��canisme de la r��gulation d'ASICI a qui pourrait avoir l'importance physiologique. L'identification du site de l'action de la trypsine ��claircit les m��canismes mol��culaires de la r��gulation des ASICs. Cette ��tude propose un r��le des ASICs dans la modulation de la g��n��ration des PAs. R��sum�� pour le public large Les neurones sont les cellules de syst��me nerveux dont la fonction est la signalisation. Comme toutes les autres cellules, les neurones ont une membrane qui s��pare l'int��rieur du milieu ext��rieur. Cette membrane est imperm��able pour des particules charg��es (ions). Dans cette membrane existent les prot��ines sp��cifiques, �� canaux ��, qui permettent le transport des ions d'un c��t�� de la membrane �� l'autre, comme r��ponse aux stimuli diff��rents. Ce transport des ions �� travers la membrane g��n��re un courant, qu'on peut mesurer. Ce courant est la base de la communication entre les neurones, ou, ce qu'on appelle la signalisation neuronale. Quand ce courant est suffisamment grand, il permet la g��n��ration du potentiel d'action, qui est le message principal de communication neuronale. Les canaux ASIC (acid-sensing ion channel), que nous ��tudions dans le laboratoire, sont activ��s par les acides. Les acides sont rel��ch��s dans beaucoup de situations dans le syst��me nerveux. Les ASIC ont ��t�� d��couverts r��cemment (en 1996), et nous ne connaissons pas encore tr��s bien toutes les fonctions de ces canaux. Nous savons qu'ils ont un r��le dans le m��moire, apprentissage, la sensation de la douleur et l'infarctus c��r��bral. Dans la premi��re partie de ce projet de th��se, nous avons voulu mieux comprendre comment fonctionnent ces canaux. Pour faire ��a, nous avons ��tudi�� la r��gulation des ASICs par une prot��ine, trypsine, qui coupe le canal ASIC. Nous avons ��tudi�� ou exactement la trypsine coupe le canal et quels effets ��a produit sur la fonction du canal. Dans la deuxi��me partie du projet de th��se, nous avons voulu mieux conna��tre comment le canal fonctionne au niveau de la cellule, comment il interagit avec les autres canaux et si il a un r��le dans la g��n��ration des potentiels d'action. Nous avons pu montrer que la trypsine change la fonction du canal, ce qui lui permet de fonctionner diff��remment. Nous avons aussi d��termin�� ou exactement ta trypsine coupe le canal. Au niveau de la cellule, nous avons montr�� que les ASIC peuvent moduler la g��n��ration des potentiels d'action, ��tant, d��pendant de l'activit�� du neurone, soit activateurs, soit inhibiteurs. La trypsine est une mol��cule qui peut ��tre lib��r��e dans le syst��me nerveux pendant certaines conditions, comme l'infarctus c��r��bral. A cause de ��a, les connaissances que la trypsine agit sur le anal ASIC pourraient ��tre important physiologiquement. La connaissance de l'endroit exacte ou la trypsine coupe le canal nous aide �� mieux comprendre la relation structure-fonction du canal. La modulation de la g��n��ration des potentiels d'actions par les ASIC indique que ces canaux peuvent avoir un r��le important dans la signalisation neuronale.

Function and regulation of the scaffold protein IB1/JIP-1 in the uro-genital tract.

RESUME Ce m��moire de th��se traite de l'��tude de la �� scaffold ��prot��ine ou prot��ine ����chafaud��, �� Islet-Brain1/ JNK Interacting Protein 1 �� (IB1/JIP-1) dans la vessie et la prostate, deux organes importants de l'appareil uro-genital. Cette prot��ine, mise en ��vidence dans notre laboratoire �� la fin des ann��e 90, a ��t�� reconnue pour r��guler la voie de signalisation des �� Mitogen-Activated Protein Kinases �� (MAPKs), et en particulier de la MAPK appel��e c-Jun N-terminal Kinase (JNK). Le r��seau de voie de signalisation permet aux cellules de percevoir les changements dans le milieu extracellulaire et de permettre une r��ponse appropri��e �� ces diff��rents stimuli. La connaissance des voies de signalisation a permis de mettre en ��vidence leur r��le crucial tant dans l'hom��ostase des tissus sains que dans des processus pathologiques comme l'oncogen��se. Parmi une vingtaine de voie de signalisation, la voie de signalisation des ��MAPKinases �� est une des plus importantes et a ��t�� montr��e pour participer �� diverses fonctions cellulaires telles que la diff��rentiation, la motilit��, la division et la mort cellulaire. La voie de signalisation des �� MAPKinases �� est typiquement constitu��e d'un module de trois kinases qui s'activent s��quentiellement par phosphorylation. On note la pr��sence d'une MAPK, d'un activateur de MAPK et d'un activateur de l'activateur de MAPK. Une fois la MAPK activ��e, elle permettra la r��gulation de diff��rentes cibles dont certain facteur de transcription. Chez les mammif��res, il existe 3 grands groupes de MAPKs : the extracellular signal-regulated kinase 1 and 2 (ERK 1/2) cascade, qui r��gule pr��f��rentiellement la croissance et la diff��rentiation cellulaire, ainsi que les cascades JNK et p38 qui r��gulent pr��f��rentiellement la r��ponse �� diff��rents stress cellulaires telle que l'inflammation ou l'apoptose. JNK est activ�� par diff��rents stress cellulaire telle que les cytokines inflammatoires. JNK est ��galement requis au cours du d��veloppement embryonnaire et contribue �� la mort (apoptose) ou �� la prolif��ration cellulaire. Plusieurs ��tudes ont mis en ��vidence le r��le de JNK durant le processus tumoral, sans que son r��le soit clairement identifi��. JNK pourrait avoir des fonctions diff��rentes durant l'initiation puis de la progression tumorale. Chez les mammif��res, les voies de signalisation intracellulaires forment un r��seau complexe et elles interagissent entre elles, ce qui permet aux cellules une r��ponse ad��quate aux multitudes de stimuli existants dans les organismes pluricellulaires. Parmi plusieurs m��canismes de r��gulation, les prot��ines dites �� scaffold �� ou ����chafaud �� jouent un r��le crucial dans l'hom��ostase de la voie de signalisation des ��MAPKinase ��. L'introduction revoit bri��vement ces diff��rents aspects, de la voie de signalisation des ��MAPKinase et des connaissance sur IB1/JIP-1. Les premi��res ��tudes effectu��es sur IB1/JIP-1 ont montr�� une expression relativement sp��cifique de cette prot��ine dans certains types de neurones ainsi que dans la cellule beta-s��cr��trice d'insuline. IB1/JIP-1 r��gule la voie de signalisation JNK par interaction avec les diff��rents composants du module, modifiant ainsi le spectre de substrats activ��s par JNK. La fonction pr��cise de IB1/JIP-1 n'��tait pas encore ��lucid��e, mais plusieurs travaux mettaient en lumi��re un r��le dans la r��gulation, et la sous-location cellulaire des composants de la voie de signalisation JNK, ainsi que dans la survie cellulaire �� certain stress. Cette expression relativement sp��cifique est intrigante car elle sugg��re que sa pr��sence serait n��cessaire �� une r��gulation sp��cifique de la MAPKinase JNK ou �� certaines autres fonctions cellulaires ��galement sp��cifiques de certains tissus. Le premier but de ce travail a consist�� �� mettre en ��vidence l'expression de IB1/JIP-1 dans l'appareil uro-g��nital et plus particuli��rement dans la vessie et la prostate. Nos r��sultats ont montr�� que IB1/JIP-1 est sp��cifiquement exprim�� au niveau de l'uroth��lium v��sical, mais pas dans le muscle lisse. Il en est de m��me au niveau de la prostate o�� IB1/JIP-1 est exprim�� sp��cifiquement au niveau de l'��pith��lium s��cr��toire et absent au niveau du stroma fibro-musculaire. La vessie et la prostate sont des organes ou l'activit�� JNK pourrait ��tre crucial tant dans l' homeostase tissulaire que dans le d��veloppement de pathologies b��nignes ou malignes. La vessie et la prostate sont le si��ge fr��quent de tumeur. La base pour le d��veloppement du cancer est complexe et implique plusieurs anomalies g��n��tiques. Ce processus complexe li�� au d��veloppement tumoral est encore loin d`��tre compl��tement ��lucid��, raison pour laquelle il est crucial de poursuivre l'��tude des diff��rents g��nes pouvant ��tre impliqu�� dans ces processus ou pouvant ��tre utilis�� comme outil th��rapeutique. Dans l'urothelium de la vessie, la fonction de la MAPK JNK n'a ��t�� que tr��s peu ��tudi��e. Il existe quelques ��tudes, in vitro, sugg��rant une implication possible de cette voie de signalisation dans des processus telle que le d��veloppement ou la progression tumorale. Le chapitre 1 d��crit une ��tude in vivo dans la vessie un mod��le de stress m��canique, connu pour activer les MAPKinase. La dilatation v��sicale, due �� une obstruction ur��trale, a mis en ��vidence une diminution de l'expression de IB1/JIP-1 ainsi qu'une activation de la MAPKinase JNK. Dans ce mod��le, la r��gulation de IB1/JIP-1, par l'interm��diaire d'un vecteur viral, a permis de d��montrer que IB1/JIP-1 r��gulait l'activit�� de JNK dans ce tissu. Pour poursuivre l'��tude de cette fonction d' IB1/JIP-1 dans l'uroth��lium, nous avons investigu�� l'activit�� JNK dans des souris g��n��tiquement modifi��es et porteuse d'une d��l��tion de 1 des 2 all��les du g��ne codant pour IB1/JIP-1, avec un contenu en IB1/JIP-1 diminu�� de moiti��. L'activation de JNK est ��galement augment��e dans l'urothelium au repos de ces souris, ce qui confirme la fonction r��gulatrice de JNK par IB1/JIP-1. Ces r��sultats ont permis de mettre en ��vidence un r��le critique de celle-ci dans l'hom��ostase de I`urothelium et sugg��re une nouvelle cible pour r��guler la voie de signalisation dans ce tissu. En outre, la modulation des niveaux d'expression d'IB1/JIP-1 dans la vessie, in vivo, par l'interm��diaire de vecteurs viraux s'est r��v��l��e r��alisable et indique un moyen ��l��gant pour d��velopper une th��rapie g��nique dans cet organe. Un autre ��l��ment de ce travail de th��se, r��v��l��e au chapitre 2, a ��t�� d'��tudier la r��gulation dans la vessie de rat de la communication intercellulaire de type �� GAP ��. Les cellules adjacentes partagent des ions, messagers secondaires et des petits m��tabolites par l'interm��diaire de canaux intercellulaire qui forment les jonctions de type �� GAP ��. Ce type de communications intercellulaire permet une activit�� cellulaire coordonn��e, une caract��ristique importante pour l'hom��ostase des organismes multicellulaire. Ce type de communication intercellulaire est form�� de 2 demi-canaux appel��s connexons. Chaque connexon est form�� de six prot��ines appel��es connexins (Cx). Il existe environ vingt connexines diff��rentes nomm��es par leur poids mol��culaire respectif. Les jonctions de type canaux "GAP" permettent aux cellules de communiquer avec les cellules voisines au quelles elles sont m��caniquement ou ��lectriquement coupl��es. La vessie peut ��tre particuli��rement d��pendante de la communication intercellulaire par les canaux �� Gap �� qui permettrait de coordonner la r��ponse de la musculature ainsi que de l'uroth��lium �� l'augmentation de la pression transmurale du �� l'accumulation d'urine, situation fr��quemment observ��e dans le cadre de l'hyperplasie b��nigne de la prostate. Dans la vessie de rat, la connexine26 est exprim��e uniquement dans l'urothelium. La Cx26, a ��t�� montr��e pour ��tre un possible �� tumor suppressor gene �� dans le cancer de vessie. Une augmentation de la Cx26 ainsi que du couplage des cellules uroth��liales a ��t�� d��montr�� dans notre mod��le de stress m��canique sur la vessie de rat et est d��pendante de 2 ��l��ments de r��ponses connues pour interagir avec AP-1. La r��gulation de IB1/JIP-1 a permis de montrer que celle-ci r��gulait l'activit�� JNK, ainsi que l'activit�� du facteur de transcription AP-1, compos�� de c-Jun lui-m��me cible de JNK. Cette r��duction de l'activit�� de AP-1 est associ��e �� une diminution de l'expression du transcipt de la Cx26. En r��sum��, la Cx26 pourrait ��tre r��gul��e par le complexe AP-1 lui-m��me d��pendant du contenu en IB1/JIP-1. Dans le chapitre 3, l'��tude de IB1/J1P-1 s'est port��e sur la prostate. Cet organe, si��ge fr��quent de pathologie telle que le cancer ou l'hyperplasie b��nigne de la prostate, exprime IB1/JIP-1 au niveau de son ��pith��lium s��cr��toire. Cette expression est maintenue dans une lign��e cellulaire humaine largement ��tudi��e est reconnue comme un mod��le ad��quat de cellules tumorales de type androg��ne-sensible. IB1/JIP-1 a ��t�� investigu�� dans un mod��le in vitro d'apoptose en r��ponse �� un agent appel�� N-(4-hydroxyphenyl)retinamide (4-HPR) qui induit une activation de la MAPK JNK ainsi que ��galement un diminution du contenu en IB1/JIP-1. La surexpression de IB1/JIP-1 en utilisant �� nouveau des virus comme vecteur a d��montr�� que IB1/JIP-1 ��tait capable de r��guler l'activit�� de JNK ainsi que les taux d'apoptose. Dans le cancer de la prostate, certains travaux ont montr�� que la diff��rentiation neuroendocrine des cellules tumorales est associ��e �� la progression tumorale et �� la perte de sensibilit�� aux androg��nes. Ce travail a permis de d��voiler l'augmentation d'expression de IB1/JIP-1 dans un mod��le de neurodifferentiation des cellules d'une lign��e prostatique humaine (LNCaP). Les m��canismes qui permettent une expression sp��cifique de IB1/JIP-1 ont ��t�� partiellement investigu��e dans notre laboratoire. Son promoteur humain contient un �� Neuron Restricive Silencer Element �� (NRSE) connu pour se lier a r��presseur transcriptionel appel�� �� RE-1 Silencer Transcription Factor �� ou �� Neuron Restrictive Silencer Factor �� (REST/NRSF). NRSF/REST est capable de r��primer l'expression de g��nes neuronaux en dehors du syst��me neuronal. Il prend part �� la diff��rentiation terminale des g��nes neuronaux. Dans le chapitre 3, on observe que l'activit�� de REST/NRSF est diminu��e dans les cellules LNCaP qui se transdifferencient de mani��re neuroendocrine, et que REST/NRSF est capable de moduler l'expression de ces g��nes cibles dans ce type cellulaire. Ces travaux laissent sugg��rer que NRSF/REST participe �� l'acquisition du ph��notype neuroendocrinien et pourrait ��tre une cible pour r��guler ce ph��nom��ne. En conclusion, ce travail de th��se pr��sente l'expression de IB1/JIP-1 dans 2 organes de l'appareil uro-g��nital ; la vessie et la prostate. La fonction de IB1/JIP-1 a ��t�� ��tudi��e in vivo dans la vessie de rat, ce qui a mis en ��vidence sa fonction r��gulatrice de l'activit�� de la MAPKinase JNK, et de l'activit�� du facteur de transcription AP-1 ; ainsi que sa possible implication r��gulatrice de g��ne cible tel que la Connexin 26 (Cx26). AP-1 et la Cx26 pourraient jouer un r��le dans le processus oncologique, tant dans le control de l'invasion cellulaire ou le control de la croissance cellulaire. Dans la prostate, IB1/JIP-1 r��gule ��galement l'activit�� JNK; crucial dans la transmission de certains stimulis pro-apoptotiques. Dans un mod��le de transdiff��renciation neuroendocrinienne, ph��notype possiblement li�� au caract��re agressif du cancer de la prostate, l'expression de IB1/JIP-1 est augment��, sugg��rant soit un r��le possible dans le d��veloppement du ph��notype neuronal ou une implication dans une fonction anti-apoptotique. Ce travail a donc permis d'��largir nos connaissances sur la r��gulation et le control de la voie de signalisation des MAPKinases par IB1/JIP-1, qui pourrait avoir encore d'autres fonctions dans ces tissus.

The cataract and glucosuria associated monocarboxylate transporter MCT12 is a new creatine transporter.

Creatine transport has been assigned to creatine transporter 1 (CRT1), encoded by mental retardation associated SLC6A8. Here, we identified a second creatine transporter (CRT2) known as monocarboxylate transporter 12 (MCT12), encoded by the cataract and glucosuria associated gene SLC16A12. A non-synonymous alteration in MCT12 (p.G407S) found in a patient with age-related cataract (ARC) leads to a significant reduction of creatine transport. Furthermore, Slc16a12 knockout (KO) rats have elevated creatine levels in urine. Transport activity and expression characteristics of the two creatine transporters are distinct. CRT2 (MCT12)-mediated uptake of creatine was not sensitive to sodium and chloride ions or creatine biosynthesis precursors, breakdown product creatinine or creatine phosphate. Increasing pH correlated with increased creatine uptake. Michaelis-Menten kinetics yielded a Vmax of 838.8 pmol/h/oocyte and a Km of 567.4 ��m. Relative expression in various human tissues supports the distinct mutation-associated phenotypes of the two transporters. SLC6A8 was predominantly found in brain, heart and muscle, while SLC16A12 was more abundant in kidney and retina. In the lens, the two transcripts were found at comparable levels. We discuss the distinct, but possibly synergistic functions of the two creatine transporters. Our findings infer potential preventive power of creatine supplementation against the most prominent age-related vision impaired condition.

Effect of a specific supplement enriched with n-3 polyunsaturated fatty acids on markers of inflammation, oxidative stress and metabolic status of ear, nose and throat cancer patients.

Malnutrition affects 40-50% of patients with ear, nose and throat (ENT) cancer. The aim of this study was to assess changes induced by a specific nutritional supplement enriched with n-3 polyunsaturated fatty acids, fiber and greater amounts of proteins and electrolytes, as compared with a standard nutritional supplement, on markers of inflammation, oxidative stress and metabolic status of ENT cancer patients undergoing radiotherapy (RT). Fourteen days after starting RT, 26 patients were randomly allocated to one of two groups, 13 supplemented with Prosure, an oncologic formula enriched with n-3 polyunsaturated fatty acids, fiber and greater amounts of proteins and electrolytes (specific supplement), and 13 supplemented with Standard-Isosource (standard supplement). Patients were evaluated before RT, and 14, 28 and 90 days after starting RT. The results showed that there were no significant differences between the groups, but greater changes were observed in the standard supplement group, such as a decline in body mass index (BMI), reductions in hematocrit, erythrocyte, eosinophil and albumin levels, and a rise in creatinine and urea levels. We concluded that metabolic, inflammatory and oxidative stress parameters were altered during RT, and began to normalize at the end of the study. Patients supplemented with Prosure showed an earlier normalization of these parameters, with more favorable changes in oxidative stress markers and a more balanced evolution, although the difference was not significant.

Long-term effects of varying consumption of ��3 fatty acids in ear, nose and throat cancer patients: assessment 1 year after radiotherapy.

Abstract A prospective 1-year follow-up study in ear, nose, and throat (ENT) cancer patients was carried out one year after radiotherapy to assess the effect of varying consumption of ��3 fatty acid according to whether they consumed more or less than the 50th percentile of ��3 fatty acids. Clinical, analytical, inflammatory (CRP and IL-6), and oxidative variables (TAC, GPx, GST, and SOD) were evaluated. The study comprised 31 patients (87.1% men), with a mean age of 61.3��������9.1 years. Hematological variables showed significant differences in the patients with a lower consumption of ��3 fatty acids. A lower mortality and longer survival were found in the group with ��3 fatty acid consumption ���50th percentile but the differences were not significant. No significant difference was reached in toxicity, inflammation, and oxidative stress markers. The group with ��3 fatty acid consumption <50th percentile significantly experienced more hematological and immune changes.

Connexins in lymphatic vessel physiology and disease.

Connexins are transmembrane proteins that form gap junction- and hemi-channels. Once inserted into the membrane, hemi-channels (connexons) allow for diffusion of ions and small molecules (&lt;1kDa) between the extracellular space and the cytosol. Gap junction channels allow diffusion of similar molecules between the cytoplasms of adjacent cells. The expression and function of connexins in blood vessels has been intensely studied in the last few decades. In contrast, only a few studies paid attention to lymphatic vessels; convincing in vivo data with respect to expression patterns of lymphatic connexins and their functional roles have only recently begun to emerge. Interestingly, mutations in connexin genes have been linked to diseases of lymphatic vasculature, most notably primary and secondary lymphedema. This review summarizes the available data regarding lymphatic connexins. More specifically it addresses (i) early studies aimed at presence of gap junction-like structures in lymphatic vessels, (ii) more recent studies focusing on lymphatic connexins using genetically engineered mice, and (iii) results of clinical studies that have reported lymphedema-linked mutations in connexin genes.

ASIC1a oligomerization structure-function of its extracellular vestibule and functional characterization of &#945;S243P&#946;&#611; ENaC

Quatre cristaux du canal ASIC1a ont ��t�� publi��s et soutiennent une stoechiom��trie trim��rique. Cependant, ces donn��es contredisant de pr��c��dentes analyses fonctionnelles effectu��es sur des canaux de la m��me famille, notre int��r��t fut port�� sur l'oligom��risation d'ASIC1a. Dans ce sens, un nouvel essai couplant la m��thode d'analyse par substitution de cyst��ines (SCAM) avec l'utilisation de r��actifs sulfhydryls bifonctionnels (crosslinkers) a ��t�� mis en place. Le but ��tant de stabiliser, puis s��lectionner les canaux fonctionnels, pour ensuite les s��parer selon leur taille par SDS-PAGE. Gr��ce �� cette technique, nous avons d��montr�� que le complexe stabilis�� a une taille co��ncidant avec une organisation t��tram��rique. En plus de son oligom��risation, le chemin emprunt�� par les ions pour traverser le canal n'est pas clairement d��fini dans ces structures. De ce fait, utilisant une approche ��lectrophysiologique, nous avons ��tudi�� le lien entre la structure et la fonction du vestibule extracellulaire d'ASIC1a. Dans ce but, nous nous sommes int��ress��s l'accessibilit�� de cyst��ines sp��cifiques localis��es dans ce vestibule pour des r��actifs m��thanethiosulfonates (MTS). Ainsi, nous avons pu corr��ler les cin��tiques de modification de ces cyst��ines par les MTS avec les effets sur le courant sodique, et donc avoir des informations suppl��mentaires sur la voie emprunt��e par les ions. De plus, la simulation informatique de liaison de ces r��actifs illustre le remplissage total de ce vestibule. Fonctionnellement, cette interaction ne perturbe pas le passage de ions, c'est pourquoi il nous appara��t probable que le vestibule pr��sente une taille plus large que celle illustr��e par les cristaux. Dans un deuxi��me temps, notre int��r��t fut port�� sur ENaC. Ce canal est compos�� des trois sous-unit��s (a, �� et y) et est exprim�� dans divers ��pith��liums, dont les tubules des reins. Il participe �� l'hom��ostasie sodique et est essentiellement r��gul�� par voie hormonale via l'aldost��rone et la Vasopressine, mais ��galement par des s��rines prot��ases ou le Na+. Nous avons ��tudi�� la r��percussion fonctionnelle de la mutation aS243P, d��couverte chez un nouveau-n�� pr��matur�� atteint de pseudohypoaldost��ronisme de type 1. Cette maladie autosomale r��cessive se caract��rise, g��n��ralement, par une hyponatr��mie li��e �� d'importantes pertes de sel dans les urines, une hyperkali��mie, ainsi qu'un niveau ��lev�� d'aldost��rone. Tout d'abord aucune des exp��riences biochimiques et ��lectrophysiologiques n'a pu d��montrer un d��faut d'expression ou une forte diminution de l'activit�� soutenant les donn��es cliniques. Cependant, en challengeant aS243P��yENaC avec une forte concentration de Na+ externe, une hypersensibilit�� de canal fut observ��e. En effet, ni les ph��nom��nes r��gulateurs de �� feedback inhibition �� ou de �� Na+ self-inhibition �� n'��taient semblables au canal sauvage. De ce fait, ils apparaissaient exacerb��s en pr��sence de la mutation, amenant ainsi �� une diminution de la r��absorption de Na+. Ceci corrobore enti��rement l'hyponatr��mie diagnostiqu��e. Le rein d'un pr��matur�� ��tant immature, la quantit�� de Na+ atteignant la partie distale du n��phron est plus ��lev��e, du fait que les autres m��canismes de r��absorption en amont ne sont probablement pas encore en place. Cette hypoth��se est renforc��e par l'existence d'un fr��re pr��sentant la m��me mutation, mais qui, n�� �� terme, ne pr��sentait aucun signe d'hyponatr��mie. - The main topic of my thesis is the structure-function relationship of the ENaC/Deg family of ion channels, namely the Acid-Sensing Ion Channel ASIC1a and the Epithelial Na Channel ENaC. The primary part of this research is dedicated to the structure of ASIC1a. Four channel crystals have been published, which support a trimeric stoichiometry, although these data contradict previous functional experiments on other ENaC/Deg members. We are therefore interested in ASIC1a oligomerization and have set up a new assay combining the Substituted- Cysteine Accessibility Method (SCAM) with Afunctional sulfhydryl reagents (crosslinkers) allowing its study. The aim was to first stabilize the channels, then select those that are functional and then resolve them according to their size on SDS-PAGE. We demonstrated that the stabilized complex has a molecular weight corresponding to a tetrameric stoichiometry. In addition to our interest in the oligomerization of the ENaC/Deg family of ion channels, we also wanted to investigate the thus far undefined way of permeation for these channels. Therefore, taking the advantage of a more electrophysiological approach, we studied the accessibility of specific cysteines for methanethiosulfonate reagents (MTS) and were able to correlate the MTS association kinetics on cysteine residues with Na+ currents. These results have given us an insight into ion permeation and our functional evidence indicates that the extracellular is larger than that depicted by the crystal structures. As a side project, we focused on ENaC, which is made up of three subunits (a, �� and y) and is expressed in various epithelia, especially in the distal nephron of the kidneys. It plays a role in Na+ homeostasis and is essentially regulated by hormones via aldosterone and vasopressin, but also by serine proteases or Na+. We have studied the functional impact of the aS243P mutation, discovered in a premature baby suffering from pseudohypoaldosteronism of type 1. This autosomal recessive disease is characterized by hyponatremia, hyperkalemia and high aldosterone levels. Firstly, neither biochemical nor electrophysiological experiments indicated an expression defect or a strong decrease in activity. However, challenging aS243P��yENaC with increased external Na+ concentration showed channel hypersensitivity. Indeed, both the "feedback inhibition" and the "Na+ self-inhibition" regulatory mechanisms are impaired, leading to a decrease in Na+ reabsorption, entirely supports the diagnosis. The kidneys in preterm infants are immature and Na+ levels reaching the distal nephron are higher than normally observed. We hypothesize that the upstream reabsorption machinery is unlikely to be sufficiently matured and this assumption is supported by an asymptomatic sibling carrying the same mutation, but born at term. - La cellule, unit�� fonctionnelle du corps humain, est d��limit��e par une membrane plasmique servant de barri��re biologique entre les milieux intra et extracellulaires. Une communication entre cellules est indispensable pour un fonctionnement ad��quat. Sa survie d��pend, entre autres, du maintien de la teneur en ions dans chacun des milieux qui doivent pouvoir ��tre r��absorb��s, ou s��cr��t��s, selon les besoins. Les prot��ines ins��r��es dans la membrane forment un canal et sont un moyen de communication permettant sp��cifiquement �� des ions tel que le sodium (Na+) de traverser. Le Na+ se trouve dans la plupart des aliments et le sel, et est sp��cifiquement r��absorb�� au niveau des reins gr��ce au canal sodique ��pith��lial ENaC. Cette r��absorption se fait de l'urine primaire vers l'int��rieur de la cellule, puis est transport�� vers le sang. Pour maintenir un ��quilibre, une r��gulation de ce canal est n��cessaire. En effet, des dysfonctionnements impliquant la r��gulation ou l'activit�� d'ENaC lui-m��me sont �� l'origine de maladies telles que la mucoviscidose, l'hypertension ou encore, le pseudohypoaldost��ronisme (PHA). Cette maladie est caract��ris��e, notamment, par d'importantes pertes de sel dans les urines. Des p��diatres ont diagnostiqu�� un PHA chez un nouveau-n��, ce dernier pr��sentant une modification du canal ENaC, nous avons recr���� cette prot��ine afin d'��tudier l'impact de ce changement sur son activit��. Nous avons d��montr�� que la r��gulation d'ENaC ��tait effectivement perturb��e, conduisant ainsi �� une forte r��duction de la r��absorption sodique. Afin de d��velopper des mol��cules capables de moduler l'activit�� de prot��ines. Il est n��cessaire d'en conna��tre la structure. Celle du canal sodique sensible �� l'acidification ASIC1, un canal cousin d'ENaC, est connue. Ces donn��es structurales contredisant cependant les analyses fonctionnelles, nous nous sommes pench��s une nouvelle fois sur ASIC1. Une prot��ine est une macromol��cule biologique compos��e d'une cha��ne d'acides amin��s (aa). De l'encha��nement d'aa �� la prot��ine fonctionnelle, quatre niveaux de structuration existent. Chaque aa donne une indication quant au repliement et plus particuli��rement la cyst��ine. Arborant un groupe sulfhydryle (SH) capable de former une liaison sp��cifique et stable avec un autre SH, celle-ci est souvent impliqu��e dans la structure tridimensionnelle de la prot��ine. Ce type de liaison intervient ��galement dans la stabilisation de la structure quaternaire, qui est l'association de plusieurs prot��ines identiques (homom��re), ou pas (h��t��rom��re). Dans cette partie, nous avons remplac�� des aa par des cyst��ines �� des endroits sp��cifiques. Le but ��tait de stabiliser plusieurs homom��res d'ASICl ensemble avec des r��actifs cr��ant des ponts entre deux SH. Ainsi, nous avons pu d��terminer le nombre de prot��ines ASIC1 participant �� la formation d'un canal fonctionnel. Nos r��sultats corroborent les donn��es fonctionnelles soutenant un canal t��tram��rique. Nous avons ��galement ��tudi�� l'accessibilit�� de ces nouvelles cyst��ines afin d'obtenir des informations suppl��mentaires sur la structure du chemin emprunt�� par le Na+ �� travers ASIC1 et plus particuli��rement du vestibule extracellulaire.

Metallic and nonmetallic shine in luster: An elastic ion backscattering study

Luster is a metal glass nanocomposite layer first produced in the Middle East in early Islamic times ( 9th AD) made of metal copper or silver nanoparticles embedded in a silica-based glassy matrix. These nanoparticles are produced by ion exchange between Cu+ and Ag+ and alkaline ions from the glassy matrix and further growth in a reducing atmosphere. The most striking property of luster is its capability of reflecting light like a continuous metal layer and it was unexpectedly found to be linked to one single production parameter: the presence of lead in the glassy matrix composition. The purpose of this article is to describe the characteristics and differences of the nanoparticle layers developed on lead rich and lead free glasses. Copper luster layers obtained using the ancient recipes and methods are analyzed by means of elastic ion backscattering spectroscopy associated with other analytical techniques. The depth profile of the different elements is determined, showing that the luster layer formed in lead rich glasses is 5���6 times thinner and 3���4 times Cu richer. Therefore, the metal nanoparticles are more densely packed in the layer and this fact is related to its higher reflectivity. It is shown that lead influences the structure of the metal nanoparticle layer through the change of the precipitation kinetics

Multifunctional ligands for application in Alzheimer���s Disease: molecular modelling and biological evaluation

Projecte de recerca elaborat a partir d���una estada a la University of British Columbia, Canad��, entre 2010 i 2012 La malaltia d'Alzheimer (MA) representa avui la forma m��s comuna de dem��ncia en la poblaci�� envellida. Malgrat fa 100 anys que va ser descoberta, encara avui no existeix cap tractament preventiu i/o curatiu ni cap agent de diagn��stic que permeti valorar quantitativament l'evoluci�� d'aquesta malaltia. L'objectiu en el que s'emmarca aquest treball ��s contribuir a aportar solucions al problema de la manca d'agents terap��utics i de diagnosi, un��vocs i rigorosos, per a la MA. Des del camp de la qu��mica bioinorg��nica ��s f��cil fixar-se en l'excessiva concentraci�� d'ions Zn(II) i Cu(II) en els cervells de malalts de MA, plantejar-se la seva utilitzaci�� com a dianes terap��utica i, en conseq����ncia, cercar agents quelants que evitin la formaci�� de plaques senils o contribueixin a la seva dissoluci��. Si b�� aquest va ser el punt de partida d���aquest projecte, els m��ltiples factors implicats en la patog��nesi de la MA fan que el cl��ssic paradigma d��� ��una mol��cula, una diana�� limiti la capacitat de la mol��cula de combatre aquesta malaltia tan complexa. Per tant, un esfor�� considerable s���ha dedicat al disseny d���agentsmultifuncionals que combatin els m��ltiples factors que caracteritzen el desenvolupament de la MA. En el present treball s���han dissenyat agents multifuncionals inspirats en dos esquelets moleculars ben establers i coneguts en el camp de la qu��mica medicinal: la tioflavina-T (ThT) i la deferiprona (DFP). La utilitzaci�� de t��cniques in silico que inclouen c��lculs farmacocin��tics i modelatge molecular ha estat un proc��s cabdal per a l���avaluaci�� dels millors candidats en base als seg��ents requeriments: (a) compliment de determinades propietats farmacocin��tiques que estableixin el seu possible ��s com a f��rmac (b) hidrofobicitat adequada per travessar la BBB i (c) interacci�� amb el p��ptid A������en soluci��.

Quantification of 4 antidepressants and a metabolite by LC-MS for therapeutic drug monitoring.

A liquid chromatography method coupled to mass spectrometry was developed for the quantification of bupropion, its metabolite hydroxy-bupropion, moclobemide, reboxetine and trazodone in human plasma. The validation of the analytical procedure was assessed according to Soci��t�� Fran��aise des Sciences et Techniques Pharmaceutiques and the latest Food and Drug Administration guidelines. The sample preparation was performed with 0.5mL of plasma extracted on a cation-exchange solid phase 96-well plate. The separation was achieved in 14min on a C18 XBridge column (2.1mm��100mm, 3.5&#956;m) using a 50mM ammonium acetate pH 9/acetonitrile mobile phase in gradient mode. The compounds of interest were analysed in the single ion monitoring mode on a single quadrupole mass spectrometer working in positive electrospray ionisation mode. Two ions were selected per molecule to increase the number of identification points and to avoid as much as possible any false positives. Since selectivity is always a critical point for routine therapeutic drug monitoring, more than sixty common comedications for the psychiatric population were tested. For each analyte, the analytical procedure was validated to cover the common range of concentrations measured in plasma samples: 1-400ng/mL for reboxetine and bupropion, 2-2000ng/mL for hydroxy-bupropion, moclobemide, and trazodone. For all investigated compounds, reliable performance in terms of accuracy, precision, trueness, recovery, selectivity and stability was obtained. One year after its implementation in a routine process, this method demonstrated a high robustness with accurate values over the wide concentration range commonly observed among a psychiatric population.

Review article: Intestinal epithelia and barrier functions.

The mucosal epithelia of the digestive tract acts as a selective barrier, permeable to ions, small molecules and macromolecules. These epithelial cells aid the digestion of food and absorption of nutrients. They contribute to the protection against pathogens and undergo continuous cell renewal which facilitates the elimination of damaged cells. Both innate and adaptive defence mechanisms protect the gastrointestinal-mucosal surfaces against pathogens. Interaction of microorganisms with epithelial cells triggers a host response by activating specific transcription factors which control the expression of chemokines and cytokines. This host response is characterized by the recruitment of macrophages and neutrophils at the site of infection. Disruption of epithelial signalling pathways that recruit migratory immune cells results in a chronic inflammatory response. The adaptive defence mechanism relies on the collaboration of epithelial cells (resident sampling system) with antigen-presenting and lymphoid cells (migratory sampling system); in order to obtain samples of foreign antigen, these samples must be transported across the barriers without affecting the integrity of the barrier. These sampling systems are regulated by both environmental and host factors. Fates of the antigen may differ depending on the way in which they cross the epithelial barrier, i.e. via interaction with motile dendritic cells or epithelial M cells in the follicle-associated epithelium.