992 resultados para Imagerie cellulaire
Resumo:
L’hypertension artérielle est le facteur de risque le plus important dans les maladies cardiovasculaires (MCV) et les accidents vasculaires cérébraux (AVC). L’hypertension artérielle essentielle est une maladie complexe, multifactorielle et polygénique. Même si on a identifié de nombreux facteurs de risque de l’hypertension artérielle, on ne comprend pas encore clairement les mécanismes qui la régissent. Les kinases hépatocytes produisant l’érythropoïétine (Eph) constituent la plus grande famille des récepteurs tyrosine kinase qui se lient à des ligands de surface cellulaire appelés éphrines sur les cellules avoisinantes. On sait que les interactions de Eph et des éphrines sont essentielles aussi bien dans les processus de développement que dans le fonctionnement des organes et des tissus adultes. Cependant on n’a pas encore étudié la relation entre Eph/éphrines et l’hypertension artérielle. Nous avons créé des modèles de souris knockout (K.O.) Ephb6-/-, Efnb1-/- et Efnb3-/- pour cette étude. Dans le modèle EphB6-/-, nous avons observé que les souris K.O. Ephb6 castrées, mais pas les femelles, ainsi que les souris mâles non castrées présentaient une tension artérielle élevée (TA) par rapport à leurs homologues de type sauvage (TS). Ceci suggère que Ephb6 doit agir de concert avec l’hormone sexuelle mâle pour réguler la TA. Les petites artères des mâles castrés Ephb6-/- présentaient une augmentation de la contractilité, une activation de RhoA et une phosphorylation constitutive de la chaîne légère de la myosine (CLM) lorsque comparées à celles de leurs homologues TS. Ces deux derniers résultats indiquent que la phosphorylation de CLM et de RhoA passe par la voie de signalisation de Ephb6 dans les cellules du muscle lisse de la paroi vasculaire (CMLV). Nous avons démontré que la réticulation de Efnbs mais non celle de Ephb6 aboutit à une réduction de la contractilité des CMLV. Ceci montre que l’effet de Ephb6 passe par la signalisation inversée à travers Efnb. Dans le modèle Efnb1-/- conditionnel spécifique au muscle lisse, nous n’avons observé aucune différence entre Efnb1-/- et les souris de TS concernant la mesure de la TA dans des conditions normales. Cependant, la TA des souris K.O. Efnb1 lors d’un stress d’immobilisation est supérieure à celle des souris de TS. Dans les petites artères des souris K.O. Efnb1, le rétrécissement et la phosphorylation de CLM étaient élevés. In vitro, la contractilité et l’activation RhoA de la CMLV des souris TS étaient augmentées quand leur Efnb1 était réticulé. Ces résultats corroborent ceux des souris KO Ephb6 et prouvent que l’effet de Ephb6 dans le contrôle de la TA se produit au moins par l’intermédiaire d’un de ses ligands Efnb1 dans les CMLV. Dans le modèle Efnb3-/-, on a observé une augmentation de la TA et du rétrécissement des vaisseaux chez les femelles Efnb3-/-, mais non chez les mâles; l’échographie a aussi révélé une résistance accrue au débit sanguin des souris K.O. femelles. Cependant la mutation de Efnb3 ne modifie pas la phosphorylation de la CLM ou l’activation de RhoA in vivo. Dans l’expérience in vitro, les CMLV des souris femelles Efnb3-/- ont présenté une augmentation de la contractilité mais pas celle des souris mâles Efnb3-/-. La réticulation des CMLV chez les mâles ou les femelles de TS avec solide anti-Efnb3 Ab peut réduire leur contractilité. Notre étude est la première à évaluer le rôle de Eph/éphrines dans la régulation de la TA. Elle montre que les signalisations Eph/éphrines sont impliquées dans le contrôle de la TA. La signalisation inverse est principalement responsable du phénotype élevé de la TA. Bien que les Efnb1, Efnb3 appartiennent à la même famille, leur fonction et leur efficacité dans la régulation de la TA pourraient être différentes. La découverte de Eph/Efnb nous permet d’explorer plus avant les mécanismes qui gouvernent la TA.
Resumo:
Introduction : La prévention de la mort de cellules cardiaques contractiles suite à un épisode d'infarctus du myocarde représente le plus grand défi dans la récupération de la fonction cardiaque. On a démontré à maintes reprises que l'ocytocine (OT), l'hormone bien connue pour ses rôles dans le comportement social et reproductif et couramment utilisée dans l’induction de l’accouchement, diminue la taille de l'infarctus et améliore la récupération fonctionnelle du myocarde blessé. Les mécanismes de cette protection ne sont pas totalement compris. Objectif : Étudier les effets d'un traitement avec de l'ocytocine sur des cardiomyocytes isolés en utilisant un modèle in vitro qui simule les conditions d'un infarctus du myocarde. Méthodes : La lignée cellulaire myoblastique H9c2 a été utilisée comme modèle de cardiomyocyte. Pour simuler le dommage d'ischémie-reperfusion (IR), les cellules ont été placées dans un tampon ischémique et incubées dans une chambre anoxique pendant 2 heures. La reperfusion a été accomplie par la restauration du milieu de culture régulier dans des conditions normales d'oxygène. L'OT a été administrée en présence ou en absence d'inhibiteurs de kinases connues pour être impliquées dans la cardioprotection. La mortalité cellulaire a été évaluée par TUNEL et l'activité mitochondriale par la production de formazan pendant 1 à 4 heures de reperfusion. La microscopie confocale a servie pour localiser les structures cellulaires. Résultats : Le modèle expérimental de l'IR dans les cellules H9c2 a été caractérisé par une diminution dans la production de formazan (aux alentours de 50 à 70 % du groupe témoin, p < 0.001) et par l'augmentation du nombre de noyaux TUNEL-positif (11.7 ± 4.5% contre 1.3 ± 0.7% pour le contrôle). L'addition de l'OT (10-7 a 10-9 M) au commencement de la reperfusion a inversé les effets de l'IR jusqu'aux niveaux du contrôle (p < 0.001). L'effet protecteur de l'OT a été abrogé par : i) un antagoniste de l'OT ; ii) le knockdown de l'expression du récepteur à l'OT induit par le siRNA ; iii) la wortmannin, l'inhibiteur de phosphatidylinositol 3-kinases ; iv) KT5823, l'inhibiteur de la protéine kinase dépendante du cGMP (PKG); v) l'ODQ, un inhibiteur du guanylate cyclase (GC) soluble, et A71915, un antagoniste du GC membranaire. L'analyse confocale des cellules traitées avec OT a révélé la translocation du récepteur à l'OT et la forme phosphorylée de l'Akt (Thr 308, p-Akt) dans le noyau et dans les mitochondries. Conclusions : L'OT protège directement la viabilité des cardiomyocytes, lorsqu'elle est administrée au début de la reperfusion, par le déclenchement de la signalisation du PI3K, la phosphorylation de l'Akt et son trafic cellulaire. La cytoprotection médiée par l'OT implique la production de cGMP par les deux formes de GC.
Resumo:
Les anomalies du tube neural (ATN) sont des malformations congénitales très fréquentes chez l’humain en touchant 1-2 nouveau-nés sur 1000 naissances. Elles résultent d’une fermeture incomplète du tube neural lors de l’embryogenèse. L’étiologie des ATN est complexe impliquant des facteurs environnementaux et des facteurs génétiques. La souris représente un outil puissant afin de mieux comprendre la génétique des ATN. Particulièrement, la souris modèle a impliqué fortement la voie de la polarité cellulaire planaire (PCP) dans ces malformations. Dans cette étude, nous avons identifié et caractérisé une nouvelle souris mutante, Skam26Jus dans le but d’identifier un nouveau gène causant les ATN. Skam26Jus a été générée par l’agent mutagène N-Ethyl-N-Nitrosuera. Cette souris est caractérisée par une queue en forme de boucle ou de crochet, soit un phénotype associé aux ATN. La complémentation génétique de la souris Skam26Jus avec une souris mutante d’un gène de la voie PCP Vangl2 (Looptail) a montré une interaction génétique entre le gène muté chez Skam26Jus et Vangl2, suggérant que ces deux gènes fonctionnent dans des voies de signalisation semblables ou parallèles. Un total de 50% des embryons doubles hétérozygotes avec un phénotype de la queue présentent un spina bifida. La cartographie par homozygotie du génome entier suivie par un clonage positionnel a permis d’identifier Lrp6 comme le gène muté chez Skam26Jus. Une mutation homozygote, p.Ile681Arg, a été identifiée dans Lrp6 chez les souris ayant une queue en boucle/crochet. Cette mutation était absente dans 30 souches génétiques pures indiquant que cette mutation est spécifique au phénotype observé. Une étude de phénotype-génotype évalue la pénétrance à 53 % de la mutation Ile681Arg. Lrp6 est connu pour activer la voie canonique Wnt/β-caténine et inhiber la voie non canonique Wnt/PCP. Le séquençage de la région codante et de la jonction exon-intron de LRP6 chez 268 patients a mené à l’identification de quatre nouvelles rares mutations faux sens absentes chez 272 contrôles et de toutes les bases de données publiques. Ces mutations sont p.Tyr306His ; p.Tyr373Cys ; p.Val1386Ile; p.Tyr1541Cys et leur pathogénicité prédite in silico indiquent que p.Val1386Ile est bénigne, et que p.Tyr306Hiset p.Tyr373Cys et p.Tyr1541Cys sont i possiblement dommageables. Les mutations p.Tyr306His, p.Tyr373Cys et p.Tyr1541Cys ont affecté l’habilité de LRP6 d’activer la voie Wnt/β-caténine en utilisant le système rapporteur luciférase de pTOPflash. Nos résultats suggèrent que LRP6 joue un rôle dans le développement des ATN chez une petite fraction de patients ayant une ATN. Cette étude présente aussi Skam26Jus comme un nouveau modèle pour étudier les ATN chez l’humain et fournit un outil important pour comprendre les mécanismes moléculaires à l’origine des A TN.
Resumo:
Bien que la douleur soit une expérience subjective universelle, la façon de la percevoir et de l’interpréter est modulée par une multitude de facteurs. Plusieurs interventions cognitives se sont montrées efficaces pour réduire la douleur dans des conditions cliniques et expérimentales. Cette thèse s’intéressera particulièrement aux mécanismes psychophysiologiques impliqués dans les stratégies de modulation volontaire de la douleur. Ces stratégies sont intéressantes puisqu’elles encouragent une prise en charge par l’individu, lui permettant de jouer un rôle actif dans la régulation de sa douleur. La première étude s’intéresse à l’efficacité du biofeedback comme moyen de modulation volontaire de la douleur. Il s’agissait de déterminer si le fait de présenter une rétroaction de l’amplitude du réflex RIII (évoqué par une stimulation électrique du nerf sural) au cours d’un entraînement de plusieurs essais permettrait au participant d’adopter des stratégies de modulation de la douleur et d’activer volontairement des mécanismes de contrôle descendant de la douleur. De façon à évaluer spécifiquement les changements induits par le biofeedback, la modulation du réflexe RIII et de la douleur était comparée dans trois groupes (biofeedback valide, faux biofeedback et groupe contrôle sans rétroaction). Dans les trois groupes, il était suggéré aux participants d’utiliser des stratégies cognitives de modulation de la douleur (attention, modulation de la respiration, réévaluation cognitive et imagerie mentale) afin d’augmenter ou de diminuer leur réflexe RIII comparativement à leur niveau de base. Les résultats de notre étude indiquent que les participants des 3 groupes ont réussi à moduler leur réflexe RIII (p<0,001) ainsi que leurs évaluations de douleur (p<0,001) (intensité et désagrément). Les résultats de notre étude montrent que l’entraînement au biofeedback n’était pas nécessaire pour obtenir une modulation du réflexe RIII et de la douleur, ce qui suggère que l’utilisation de stratégies cognitives pourrait être suffisante pour déclencher des mécanismes de contrôle de la douleur. La deuxième étude découle de la première et s’intéressait à l’influence de la fréquence et de la phase respiratoire sur la nociception spinale, l’activité cérébrale et la perception de douleur. Le contrôle volontaire de la respiration est un moyen commun de régulation des émotions et est fréquemment utilisé en combinaison avec d’autres techniques (ex. : relaxation, méditation) dans le but de réguler la douleur. Les participants étaient invités à synchroniser leur respiration à des indices sonores indiquant le moment de l’inspiration et de l’expiration. Trois patrons de respiration étaient proposés (respiration à 0,1Hz avec une inspiration de 4 secondes, respiration à 0,1Hz avec une inspiration de 2 secondes et respiration à 0,2Hz avec une inspiration de 2 secondes. La moitié des stimulations étaient données durant l’inspiration et l’autre moitié durant l’expiration. Afin d’évaluer l’effet de ces manipulations, l’amplitude du RIII, l’évaluation subjective d’intensité de la douleur et de l’anxiété suscitée par le choc en plus des potentiels évoqués étaient mesurés. Les résultats de cette étude démontrent que les évaluations d’intensité de la douleur n’étaient pas affectées par le patron respiratoire (p=0,3), mais étaient statistiquement plus basses durant l’inspiration comparativement à l’expiration (p=0,02). Un effet de phase (p=0,03) était également observé sur les potentiels évoqués durant la condition de respiration à 0,1hHz avec une inspiration de 2 secondes comparativement au patron de respiration de 0,2Hz. Paradoxalement, l’amplitude du réflexe RIII était augmenté durant l’inspiration (p=0,02) comparativement à l’expiration. Ces résultats montrent que la manipulation de la fréquence et de la phase respiratoires (par une synchronisation imposée) a un effet marginal sur les évaluations de douleur et sur l’activité cérébrale et spinale évoquée par une stimulation électrique (douleur aigüe). Cela suggère que d’autres mécanismes contribuent aux effets analgésiques observés dans la relaxation et la méditation. Plus largement, nos résultats font état de la nécessité d’études plus approfondies avec une méthodologie plus rigoureuse afin de contrôler les effets non spécifiques aux traitements évalués. Une meilleure connaissance des mécanismes sous-tendant chaque stratégie permettrait de mieux cibler les clientèles susceptibles d’y répondre et de mieux considérer le ratio coût bénéfice de chaque traitement.
Resumo:
L'analyse en composantes indépendantes (ACI) est une méthode d'analyse statistique qui consiste à exprimer les données observées (mélanges de sources) en une transformation linéaire de variables latentes (sources) supposées non gaussiennes et mutuellement indépendantes. Dans certaines applications, on suppose que les mélanges de sources peuvent être groupés de façon à ce que ceux appartenant au même groupe soient fonction des mêmes sources. Ceci implique que les coefficients de chacune des colonnes de la matrice de mélange peuvent être regroupés selon ces mêmes groupes et que tous les coefficients de certains de ces groupes soient nuls. En d'autres mots, on suppose que la matrice de mélange est éparse par groupe. Cette hypothèse facilite l'interprétation et améliore la précision du modèle d'ACI. Dans cette optique, nous proposons de résoudre le problème d'ACI avec une matrice de mélange éparse par groupe à l'aide d'une méthode basée sur le LASSO par groupe adaptatif, lequel pénalise la norme 1 des groupes de coefficients avec des poids adaptatifs. Dans ce mémoire, nous soulignons l'utilité de notre méthode lors d'applications en imagerie cérébrale, plus précisément en imagerie par résonance magnétique. Lors de simulations, nous illustrons par un exemple l'efficacité de notre méthode à réduire vers zéro les groupes de coefficients non-significatifs au sein de la matrice de mélange. Nous montrons aussi que la précision de la méthode proposée est supérieure à celle de l'estimateur du maximum de la vraisemblance pénalisée par le LASSO adaptatif dans le cas où la matrice de mélange est éparse par groupe.
Resumo:
La tolérance immunitaire dépend de la distinction entre le soi et le non soi par le système immunitaire. Un bris dans la tolérance immunitaire mène à l'auto-immunité, qui peut provoquer la destruction des organes, des glandes, des articulations ou du système nerveux central. Le diabète auto-immun, également connu sous le nom diabète juvénile et diabète de type 1, résulte d'une attaque auto-immune sur les cellules β pancréatiques sécrétrices d’insuline, localisées au niveau des îlots de Langerhans du pancréas. Bien que le diabète auto-immun soit traitable par une combinaison d’injections quotidiennes d’insuline d’origine exogène, de régime et d'exercices, beaucoup de complications chroniques peuvent se manifester chez les patients, y compris, mais non limitées à, la cécité, les maladies cardiovasculaires, l’insuffisance rénale et l'amputation. En raison des nombreuses complications liées au diabète auto-immun à long terme, la recherche continue afin de mieux comprendre tous les facteurs impliqués dans la progression de la maladie dans le but de développer de nouvelles thérapies qui empêcheront, renverseront et/ou traiteront cette maladie. Un rôle primordial dans la génération et l'entretien de la tolérance immunitaire a été attribué au nombre et à la fonction des sous-populations de cellules régulatrices. Une de ces populations est constituée de cellules T CD4-CD8- (double négatives, DN), qui ont été étudiées chez la souris et l'humain pour leur contribution à la tolérance périphérique, à la prévention des maladies et pour leur potentiel associé à la thérapie cellulaire. En effet, les cellules de T DN sont d'intérêt thérapeutique parce qu'elles montrent un potentiel immunorégulateur antigène-spécifique dans divers cadres expérimentaux, y compris la prévention du diabète auto-immun. D’ailleurs, en utilisant un système transgénique, nous avons démontré que les souris prédisposées au diabète auto-immun présentent peu de cellules T DN, et que ce phénotype contribue à la susceptibilité au diabète auto-immun. En outre, un transfert des cellules T DN est suffisant pour empêcher la progression vers le diabète chez les souris prédisposées au diabète auto-immun. Ces résultats suggèrent que les cellules T DN puissent présenter un intérêt thérapeutique pour les patients diabétiques. Cependant, nous devons d'abord valider ces résultats en utilisant un modèle non-transgénique, qui est plus physiologiquement comparable à l'humain. L'objectif principal de cette thèse est de définir la fonction immunorégulatrice des cellules T DN, ainsi que le potentiel thérapeutique de celles-ci dans la prévention du diabète auto-immun chez un modèle non-transgénique. Dans cette thèse, on démontre que les souris résistantes au diabète auto-immun présentent une proportion et nombre absolu plus élevés de cellules T DN non-transgéniques, lorsque comparées aux souris susceptibles. Cela confirme une association entre le faible nombre de cellules T DN et la susceptibilité à la maladie. On observe que les cellules T DN éliminent les cellules B activées in vitro par une voie dépendante de la voie perforine et granzyme, où la fonction des cellules T DN est équivalente entre les souris résistantes et prédisposées au diabète auto-immun. Ces résultats confirment que l'association au diabète auto-immun est due à une insuffisance en terme du nombre de cellules T DN, plutôt qu’à une déficience fonctionnelle. On démontre que les cellules T DN non-transgéniques éliminent des cellules B chargées avec des antigènes d'îlots, mais pas des cellules B chargées avec un antigène non reconnu, in vitro. Par ailleurs, on établit que le transfert des cellules T DN activées peut empêcher le développement du diabète auto-immun dans un modèle de souris non-transgénique. De plus, nous observons que les cellules T DN migrent aux îlots pancréatiques, et subissent une activation et une prolifération préférentielles au niveau des ganglions pancréatiques. D'ailleurs, le transfert des cellules T DN entraîne une diminution d'auto-anticorps spécifiques de l'insuline et de cellules B de centres germinatifs directement dans les îlots, ce qui corrèle avec les résultats décrits ci-dessus. Les résultats présentés dans cette thèse permettent de démontrer la fonction des cellules T DN in vitro et in vivo, ainsi que leur potentiel lié à la thérapie cellulaire pour le diabète auto-immun.
Resumo:
Des études récentes ont montré que le noyau caudé interagissait avec le cortex préfrontal et qu’il pourrait être impliqué dans les fonctions exécutives. Le but de cette thèse était d’étudier la contribution du noyau caudé dans les fonctions exécutives, plus précisément dans des tâches de monitoring et de changement de règle, et d’observer comment ces régions fronto-striatales interagissent avec le réseau par défaut (RPD). Dans un premier temps, nous avons étudié le rôle du noyau caudé dans les deux types de monitoring : le monitoring d’origine interne, consistant à effectuer un suivi sur l’état de l’information en mémoire de travail afin de pouvoir faire un choix subséquent, et dans le monitoring d’origine externe où le suivi sur l’état des items est effectué par l’individu, mais la sélection est exécutée par une source externe. Il a été montré que le cortex préfrontal dorsolatéral (CPFDL) est impliqué dans les deux types de monitoring. À l’aide de l’imagerie par résonance magnétique fonctionnelle (IRMf), nos résultats ont montré une augmentation significative du signal BOLD au niveau du CPFDL dans les contrastes des conditions de monitoring d’origine interne et monitoring d’origine externe par rapport à la condition contrôle. De manière plus importante, une augmentation significative de l’activité a été observée dans le noyau caudé seulement dans les soustractions impliquant le monitoring d’origine interne par rapport à la condition contrôle, et par rapport à la condition de monitoring d’origine externe. En deuxième lieu, des études ont montré une contribution spécifique des régions fronto-striatales dans l’exécution d’un changement de règle. Toutefois, l’effet d’un changement de règle sur l’activité cérébrale n’a jamais été étudié sur les essais subséquents. À l’aide de l’IRMf, le cortex préfrontal ventrolatéral (CPFVL) et le noyau caudé ont montré une augmentation significative de leur activité lors des changements de règle continus et lors des changements de règles sporadiques par rapport à la condition contrôle, et aussi lors des essais où le maintien d’une même règle devait être effectué pour une courte durée par opposition au contrôle. Cependant, aucune activité fronto-striatale n’a été observée lorsqu’une même règle devait être appliquée pour une plus longue période. De plus, une diminution significative de l’activité du noyau caudé a été observée lors de la répétition de l’exécution d’une même règle suggérant une meilleure intégration de cette dernière. Finalement, plusieurs études ont montré une déactivation du RPD lors de l’exécution de tâches. À l’aide de l’IRMf, nous avons posé l’hypothèse que le RPD serait corrélé négativement avec les régions fronto-striatales lors de l’exécution d’une tâche de changement de règle. Nos résultats montrent une augmentation significative de l’activité des régions fronto-striatales lors d’une augmentation du nombre d’essais de changement de règle consécutif, pendant que le RPD montre une déactivation continue. De façon intéressante, pendant que les régions fronto-striatales montrent une diminution de leur activité lors de l’exécution d’une même règle pour une longue période, le RPD augmente son activité de façon significative. On conclut donc que le noyau caudé joue un rôle important dans la planification d’une nouvelle action lorsque plusieurs possibilités doivent être considérées en mémoire de travail, et ce en même temps. Finalement, le RPD montre une corrélation négative avec les régions fronto-striatales suggérant sa participation dans l’intégration d’une tâche devenant de plus en plus familière.
Regenerative potential of corneal endothelium from patients with fuchs endothelial corneal dystrophy
Resumo:
La dystrophie cornéenne endothéliale de Fuchs (FECD, pour l’abréviation du terme anglais « Fuchs endothelial corneal dystrophy ») est une maladie de l'endothélium cornéen. Sa pathogenèse est mal connue. Aucun traitement médical n’est efficace. Le seul traitement existant est chirurgical et consiste dans le remplacement de l’endothélium pathologique par un endothélium sain provenant de cornées de la Banque des yeux. Le traitement chirurgical, en revanche, comporte 10% de rejet immunologique. Des modèles expérimentaux sont donc nécessaires afin de mieux comprendre cette maladie ainsi que pour le développement de traitements alternatifs. Le but général de cette thèse est de développer un modèle expérimental de la FECD en utilisant le génie tissulaire. Ceci a été réalisé en trois étapes. 1) Tout d'abord, l'endothélium cornéen a été reconstruit par génie tissulaire en utilisant des cellules endothéliales en culture, provenant de patients atteints de FECD. Ce modèle a ensuite été caractérisé in vitro. Brièvement, les cellules endothéliales cornéennes FECD ont été isolées à partir de membranes de Descemet prélevées lors de greffes de cornée. Les cellules au deuxième ou troisième passages ont ensuite été ensemencées sur une cornée humaine préalablement décellularisée. Suivant 2 semaines de culture, les endothélia cornéens reconstruits FECD (n = 6) ont été évalués à l'aide d'histologie, de microscopie électronique à transmission et d’immunomarquages de différentes protéines. Les endothélia cornéens reconstruits FECD ont formé une monocouche de cellules polygonales bien adhérées à la membrane de Descemet. Les immunomarquages ont démontré la présence des protéines importantes pour la fonctionnalité de l’endothélium cornéen telles que Na+-K+/ATPase α1 et Na+/HCO3-, ainsi qu’une expression faible et uniforme de la protéine clusterine. 2) Deux techniques chirurgicales (DSAEK ; pour « Descemet stripping automated endothelial keratoplasty » et la kératoplastie pénétrante) ont été comparées pour la transplantation cornéenne dans le modèle animal félin. Les paramètres comparés incluaient les défis chirurgicaux et les résultats cliniques. La technique « DSAEK » a été difficile à effectuer dans le modèle félin. Une formation rapide de fibrine a été observée dans tous les cas DSAEK (n = 5). 3) Finalement, la fonctionnalité in vivo des endothélia cornéens reconstruits FECD a été évaluée (n = 7). Les évaluations in vivo comprenaient la transparence, la pachymétrie et la tomographie par cohérence optique. Les évaluations post-mortem incluaient la morphométrie des cellules endothéliales, la microscopie électronique à transmission et des immunomarquage de protéines liées à la fonctionnalité. Après la transplantation, la pachymétrie a progressivement diminué et la transparence a progressivement augmenté. Sept jours après la transplantation, 6 des 7 greffes étaient claires. La microscopie électronique à transmission a montré la présence de matériel fibrillaire sous-endothélial dans toutes les greffes d’endothelia reconstruits FECD. Les endothélia reconstruits exprimaient aussi des protéines Na+-K+/ATPase et Na+/HCO3-. En résumé, cette thèse démontre que les cellules endothéliales de la cornée à un stade avancé FECD peuvent être utilisées pour reconstruire un endothélium cornéen par génie tissulaire. La kératoplastie pénétrante a été démontrée comme étant la procédure la plus appropriée pour transplanter ces tissus reconstruits dans l’œil du modèle animal félin. La restauration de l'épaisseur cornéenne et de la transparence démontrent que les greffons reconstruits FECD sont fonctionnels in vivo. Ces nouveaux modèles FECD démontrent une réhabilitation des cellules FECD, permettant d’utiliser le génie tissulaire pour reconstruire des endothelia fonctionnels à partir de cellules dystrophiques. Les applications potentielles sont nombreuses, y compris des études physiopathologiques et pharmacologiques.
Resumo:
Un modèle de croissance et de réponse à la radiothérapie pour le glioblastome multiforme (GBM) basé le formalisme du modèle de prolifération-invasion (PI) et du modèle linéaire-quadratique a été développé et implémenté. La géométrie spécifique au patient est considérée en modélisant, d'une part, les voies d'invasion possibles des GBM avec l'imagerie du tenseur de diffusion (DTI) et, d'autre part, les barrières à la propagation à partir des images anatomiques disponibles. La distribution de dose réelle reçue par un patient donné est appliquée telle quelle dans les simulations, en respectant l'horaire de traitement. Les paramètres libres du modèle (taux de prolifération, coefficient de diffusion, paramètres radiobiologiques) sont choisis aléatoirement à partir de distributions de valeurs plausibles. Un total de 400 ensembles de valeurs pour les paramètres libres sont ainsi choisis pour tous les patients, et une simulation de la croissance et de la réponse au traitement est effectuée pour chaque patient et chaque ensemble de paramètres. Un critère de récidive est appliqué sur les résultats de chaque simulation pour identifier un lieu probable de récidive (SPR). La superposition de tous les SPR obtenus pour un patient donné permet de définir la probabilité d'occurrence (OP). Il est démontré qu'il existe des valeurs de OP élevées pour tous les patients, impliquant que les résultats du modèle PI ne sont pas très sensibles aux valeurs des paramètres utilisés. Il est également démontré comment le formalisme développé dans cet ouvrage pourrait permettre de définir un volume cible personnalisé pour les traitements de radiothérapie du GBM.
Resumo:
La rétine est constituée de plusieurs types de neurones incluant les cellules amacrines, ganglionnaires, bipolaires et les photorécepteurs. Les photorécepteurs, qui englobent les cônes et les bâtonnets, sont des neurones sensoriels hautement spécialisés qui permettent la conversion de la lumière en signaux électriques par le mécanisme de phototransduction. Les mécanismes moléculaires par lesquels les progéniteurs rétiniens (RPCs) se différencient en différents neurones spécialisés comme les photorécepteurs sont encore peu connus. Le gène Polycomb Bmi1 appartient à la famille des gènes Polycomb qui forment des complexes multimériques impliqués dans la répression de l’expression génique via le remodelage de la chromatine. Au niveau biologique, le gène Bmi1 régule, entre autre, le contrôle de la prolifération cellulaire, le métabolisme des radicaux libres, et la réparation de l’ADN. Récemment, il a été démontré que Bmi1 joue un rôle critique dans la prolifération et l’auto-renouvellement d’un groupe de RPCs immatures. De plus, Bmi1 est essentiel au développement post-natal de la rétine. L'objectif de cette étude est d'analyser le rôle de Bmi1 dans le développement et la survie des photorécepteurs chez la souris. Nos résultats révèlent un phénotype de dégénérescence des photorécepteurs de types cônes chez notre modèle de souris déficiente pour Bmi1. Les bâtonnets sont insensibles à la mutation. De plus, Bmi1 est exprimé de façon prédominante dans les cônes. Nos expériences de culture de cellules rétiniennes suggèrent que le phénotype est cellule-autonome. Par ailleurs, la co-délétion du gène Chk2, membre de la réponse aux dommages à l'ADN, permet de ralentir la progression du phénotype. Les rétines Bmi1-/- et Bmi1-/-Chk2-/- présentent une augmentation importante des dommages oxydatifs à l'ADN. Ces résultats suggèrent que le stress oxydatif pourrait jouer un rôle important dans la survie des cônes. L'étude du rôle du gène Polycomb Bmi1 dans les photorécepteurs est importante pour une meilleure compréhension des mécanismes contribuant à la survie des cônes et pourrait mener à la découverte de nouveaux traitements des maladies dégénératives des cônes.
Resumo:
Les papillomavirus sont de petits virus à ADN double brin qui infectent les cellules de l’épithélium de la peau et des muqueuses d’une variété de vertébrés causant des lésions bénignes telles des verrues. Certains de ces virus sont également associés au développement de lésions malignes, notamment le cancer du col utérin. La protéine régulatrice E2 des papillomavirus est impliquée dans diverses fonctions contribuant à l’établissement de l’infection par ces virus. Entre autre, E2 régule la transcription des gènes viraux, participe à l’initiation de la réplication de l’ADN viral en s’associant à l’hélicase virale E1 et est responsable du maintien et de la ségrégation de l’épisome viral au cours de la division cellulaire. Toutes ces activités sont attribuables à la capacité de E2 à s’associer au génome viral et à interagir avec des protéines virales et cellulaires. De plus, ces fonctions sont elles-mêmes régulées par des modifications post-traductionnelles de la protéine E2. Plusieurs études ont été réalisées afin de découvrir les mécanismes de régulation des fonctions de E2 mais le rôle exact des différents domaines de E2 dans ces contrôles reste à être défini. En premier lieu, nous nous sommes intéressés à l’interaction entre E2 et Brd4(L) qui avait été définie comme étant essentielle à la ségrégation de l’épisome. Plusieurs caractéristiques associées à la protéine Brd4(L) telles que sa capacité à lier les lysines acétylées des histones, son interaction avec le complexe Mediator et sa participation à l’activation de la transcription en formant un complexe avec pTEFb, nous ont permis d’émettre l’hypothèse que l’interaction E2-Brd4(L) est nécessaire à l’activité transcriptionnelle de E2. Nous avons démontré que la protéine Brd4(L) interagit avec le domaine de transactivation de E2 de divers types de papillomavirus. De plus, cette interaction implique les résidus de E2 essentiels à son activité transcriptionnelle. Ainsi, ces résultats proposent que l’association E2-Brd4(L) serve à la régulation de la transcription des gènes viraux. Dans un second temps, nos recherches se sont concentrées sur l’existence d’une interface de dimérisation au sein du domaine de transactivation de E2 et de son implication dans les activités transcriptionnelles et réplicatives de la protéine. Nos études ont aussi mis en évidence que l’intégrité de la structure de ce domaine contribue au bon fonctionnement de la réplication du génome viral. Cette découverte suggère que la dimérisation de E2 peut réguler l’initiation de la réplication et propose l’existence d’un niveau de régulation additionnel impliquant l’état de la structure quaternaire de la protéine E2 et une modulation de l’interaction entre E1 et E2 à cette étape du cycle viral. Finalement, l’étude de l’instabilité de la protéine E2 nous a permis de définir une région importante dans le domaine flexible de la protéine, nécessaire à sa dégradation par le protéasome. De plus, la présence de résidus conservés localisés dans ce domaine, sont associés à la dégradation et portent la signature d’un signal de localisation nucléaire de type PY-NLS, suggérant que la stabilité de la protéine E2 est régulée par sa localisation au sein de la cellule. Ces études démontrent l’existence de nouvelles stratégies de régulation des activités transcriptionnelle et réplicative de la protéine E2 des papillomavirus. La compréhension de ces mécanismes nous permet de mieux cerner les étapes favorisant l’établissement et la progression du cycle viral et d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques contre les infections aux papillomavirus.
Resumo:
Les acides biliaires sont reconnus comme des tensioactifs d’origine biologique potentiellement applicables dans le domaine pharmaceutique. Leurs structures en font une plateforme idéale pour l’obtention de nouvelles architectures polymères. Des composés synthétisés par polymérisation anionique de dérivés d’oxirane comme l’oxyde d’éthylène, offre des dérivés amphiphiles pegylés démontrant des propriétés d’agrégation intéressantes en vue d’une amélioration de la biocompatibilité et de la capacité d’encapsulation médicamenteuse. Une large gamme d’acides biliaires pegylés (BA(EGn)x) a été préparée avec comme objectif premier leurs applications dans la formulation de principes actifs problématiques. Pour cela, une caractérisation rigoureuse du comportement de ces dérivés (modulation de la longueur (2 < n < 19) et du nombre de bras (2 < x < 4) de PEG) en solution a été réalisée. Dans le but d’améliorer la biodisponibilité de principes actifs lipophiles (cas de l’itraconazole), des nanoémulsions spontanées, composées de BA(EGn)x et d’acide oléique, ont été développées. L’évaluation in vitro, de la toxicité (cellulaire), et de la capacité de solubilisation des systèmes BA(EGn)x, ainsi que les paramètres pharmacocinétiques in vivo (chez le rat), suggèrent une livraison contrôlée par nos systèmes auto-assemblés lors de l’administration orale et intraveineuse. Aussi, la synthèse de copolymères en blocs en étoile à base d’acide cholique pegylés a été effectuée par polymérisation anionique par addition d’un second bloc au caractère hydrophobe de poly(éther d’allyle et de glycidyle) (CA(EGn-b-AGEm)4). Selon le ratio de blocs hydrophiles-hydrophobes CA(EGn-b-AGEm)4, des réponses thermiques en solution (LCST) ont été observées par un point de trouble (Cp) entre 8 oC et 37 oC. Un mécanisme de formation d’agrégats en plusieurs étapes est suggéré. La thiolation des allyles des PAGE permet une fonctionnalisation terminale à haute densité, comparable aux dendrimères. Les caractérisations physico-chimiques des CA(EGn-b-AGEm-NH2)4 et CA(EGn-b-AGEm-COOH)4 indiquent la formation de structures auto-assemblées en solution, sensibles à la température ou au pH. Cette fonctionnalisation élargie le domaine d’application des dérivés d’acides biliaires pegylés en étoile vers la transfection d’ADN, la livraison de siRNA thérapeutiques ou encore à une sélectivité de livraison médicamenteux (ex. sensibilité au pH, greffage ligands).
Caractérisation neuro-immunitaire d'un modèle d'encéphalomyélite auto-immune expérimentale spontanée
Resumo:
La sclérose en plaques est une maladie neuroinflammatoire idiopathique caractérisée par la formation de lésions focales de démyélinisation, qui apparaissent suite à l’infiltration périvasculaire de cellules immunitaires et à l’augmentation de la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique. L’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE) est le modèle animal de cette maladie. Cependant, ce modèle présente des différences importantes avec la sclérose en plaques. L’objectif de ce projet de maîtrise était d’approfondir la caractérisation d’un nouveau modèle transgénique d’encéphalomyélite auto-immune expérimentale spontanée, le modèle TCR1640, afin de valider celui-ci pour l’étude des phénomènes physiopathologiques qui surviennent à différents stades de la sclérose en plaques, ainsi que pour le développement de nouveaux traitements de la maladie. La souris TCR1640 porte un récepteur des cellules T (TCR) transgénique autoréactif, qui reconnaît un peptide de la myéline et déclenche une réaction auto-immune contre la myéline endogène au sein du système nerveux central (SNC). Des observations faites in situ et in vitro ont permis d’identifier des changements qui surviennent de façon très précoce dans l’unité neurovasculaire chez les animaux TCR1640 présymptomatiques, et qui sont liés à la présence d’un profil immunitaire périphérique proinflammatoire. Lors des phases actives de l’EAE spontanée, les animaux TCR1640 au stade chronique présentent une inflammation accrue du système nerveux central associée à une infiltration leucocytaire massive, par rapport aux animaux au stade aigu de la maladie. Une étude in vivo a également permis de moduler la maladie développée par des animaux ayant subi une immunisation passive avec des cellules T auxiliaires en provenance de souris TCR1640. Enfin, l’implication de nouvelles molécules d’adhésion cellulaire dans le développement et le maintien de l’EAE spontanée a été suggérée par des observations in vitro. L’ensemble de ces résultats suggère que le modèle TCR1640 présente plusieurs avantages pour l’étude de la physiopathologie de maladies neuroinflammatoires telles que la sclérose en plaques, et servira d’outil afin de valider de nouvelles stratégies thérapeutiques.
Resumo:
À ce jour, la scoliose idiopathique de l’adolescent (SIA) est la déformation rachidienne la plus commune parmi les enfants. Il est bien connu dans le domaine de recherche sur la SIA que les forces mécaniques, en particulier les forces biomécaniques internes dans le système musculosquelettique, pourraient jouer un rôle majeur dans l’initiation et le développement de la maladie. Cependant, les connaissances sur la transformation des forces et des stimulations mécaniques en activité biochimique sont peu abondantes. Cet axe de recherche est très prometteur et peut nous fournir de nouvelles idées dans le dépistage et le traitement de la SIA. Dans le cadre de cette étude, nous visons à caractériser la mécanotransduction chez les patients atteints de la SIA en employant des techniques novatrices aux niveaux in vivo et in vitro. Antérieurement dans notre laboratoire, nous avons démontré que les niveaux d’Ostéopontine (OPN) plasmatique chez l’humain corrèlent avec la progression et la sévérité de la maladie, et que ces changements sont observables avant le début de la scoliose. En plus, selon la littérature, l’OPN est une molécule sensible à la force mécanique, dont l’expression augmente en réponse dans de nombreux types de cellules chez plusieurs espèces. Toutefois, il n’existe aucune preuve que ce résultat soit valide in vivo chez l’humain. L’hétérogénéité physique et biochimique de la SIA pose un gros défi aux chercheurs. Souvent, il est très difficile de trouver des résultats ayant une grande applicabilité. Les études portant sur les facteurs biomécaniques ne font pas exception à cette tendance. En dépit de tout cela, nous croyons qu’une approche basée sur l’observation des contraintes de cisaillement présentes dans le système musculosquelettique pourrait aider à surmonter ces difficultés. Les contraintes de cisaillement physiologique sont générées par des courants de fluide en mouvement à l’intérieur des os. Aussi, elles sont omniprésentes et universelles chez l’humain, peu importe l’âge, le sexe, la condition physique, etc., ce qui veut dire que l’étudier pourrait fort bien avancer nos connaissances en formant une base fondamentale avec laquelle on pourra mieux comprendre les différences quant à la mécanotransduction chez les patients atteints de la SIA par rapport aux sujets sains. Pour ce projet, donc, nous proposons l’hypothèse que les sujets atteints de la SIA se différencient par leurs réponses respectives à la force mécanique au niveau cellulaire (en termes de l’expression génique) ainsi qu’au niveau in vivo (en termes du marqueur OPN et son récepteur, sCD44). Afin de vérifier la partie de notre hypothèse de recherche concernant l’aspect in vivo, nous avons recruté une cohorte de patients âgés de 9-17 ans, y compris i) des cas pré-chirurgicaux (angle de Cobb > 45°), ii) des cas modérément atteints (angle de Cobb 10-44°), iii) des témoins, et iv) des enfants asymptomatiques à risque de développer la scoliose (selon nos dépistages biochimiques et fonctionnels) d’âge et sexe appariés. Une pression pulsatile et dynamique avec une amplitude variant de 0-4 psi à 0.006 Hz a été appliquée à un des bras de chacun de nos sujets pour une durée de 90 minutes. Au tout début et à chaque intervalle de 30 minutes après l’initiation de la pression, un échantillon de sang a été prélevé, pour pouvoir surveiller les niveaux d’OPN et de sCD44 circulants chez les sujets. Nous avons découvert que le changement des niveaux d’OPN plasmatique, mais pas des niveaux de sCD44, corrélaient avec la sévérité de la difformité rachidienne chez les sujets, ceux ayant une courbe plus prononcée démontrant une ampleur de réponse moins élevée. Pour vérifier la partie de notre hypothèse de recherche concernant la réponse mécanotransductive cellulaire, des ostéoblastes prélevées à 12 sujets ont été mis en culture pour utilisation avec notre appareil (le soi-disant « parallel plate flow chamber »), qui sert à fournir aux ostéoblastes le niveau de contraintes de cisaillement désiré, de manière contrôlée et prévisible. Les sujets étaient tous femelles, âgées de 11-17 ans ; les patients ayant déjà une scoliose possédaient une courbe diagnostiquée comme « double courbe majeure ». Une contrainte fluidique de cisaillement à 2 Pa, 0.5 Hz a été appliquée à chaque échantillon ostéoblastique pour une durée de 90 minutes. Les changements apportés à l’expression génique ont été mesurés et quantifiés par micropuce et qRT-PCR. En réponse à notre stimulation, nous avons trouvé qu’il n’y avait que quelques gènes étant soit différentiellement exprimés, soit inchangés statistiquement dans tous les groupes expérimentaux atteints, en exhibant simultanément la condition contraire chez les témoins. Ces résultats mettent en évidence la grande diversité de la réponse mécanotransductive chez les patients comparés aux contrôles, ainsi qu’entre les sous-groupes fonctionnels de la SIA. Globalement, cette œuvre pourrait contribuer au développement d’outils diagnostiques innovateurs pour identifier les enfants asymptomatiques à risque de développer une scoliose, et évaluer le risque de progression des patients en ayant une déjà. Aussi, dans les années à venir, les profils mécanotransductifs des patients pourraient s’avérer un facteur crucial à considérer cliniquement, particulièrement en concevant ou personnalisant des plans de traitements pour des personnes atteintes.
Resumo:
L’encéphalopathie hypoxique-‐ischémique cause des milliers de victimes à travers le monde chaque année. Les enfants survivants à un épisode hypoxique-‐ischémique sont à risque de développer des problèmes neurologiques incapacitants comme une paralysie cérébrale, un retard mental, une épilepsie ou des troubles d’ordre comportemental. Les modèles animaux ont amélioré nos connaissances sur les mécanismes sous-‐jacents aux dommages cérébraux, mais elles sont encore trop incomplètes pour être capables de prévenir les problèmes neurologiques. Ce projet vise à comprendre l’impact d’un épisode asphyxique périnatale associé à des convulsions ainsi que l’activation de l’adenosine monophosphate-‐activated protein kinase (AMPK) sur les circuits GABAergiques inhibiteurs en développement chez la souris. Dans le but d’investiguer le sort des neurones inhibiteurs, appelés interneurones, suite à un épisode asphyxique périnatal associé à des convulsions avec des animaux transgéniques, nous avons pris avantage d’un nouveau modèle d’hypoxie permettant d’induire des convulsions chez la souris. Deux populations d’interneurones représentant ensemble environ 60% de tous les interneurones corticaux ont été étudiées, soit les cellules exprimant la parvalbumine (PV) et les cellules exprimant la somatostatine (SOM). L’étude stéréologique n’a montré aucune mort neuronale de ces deux populations d’interneurones dans l’hippocampe chez les souris hypoxique d’âge adulte. Par contre, le cortex des souris hypoxiques présentait des zones complètement ou fortement dépourvues de cellules PV alors que les cellules SOM n’étaient pas affectées. L’utilisation d’une lignée de souris transgénique exprimant une protéine verte fluorescente (GFP) dans les cellules PV nous a permis de comprendre que les trous PV sont le reflet de deux choses : 1) une diminution des cellules PV et 2) une immaturité des cellules PV restantes. Puisque les cellules PV sont spécifiquement affectées dans la première partie de notre étude, nous avons voulu étudier les mécanismes moléculaires sous-‐jacents à cette vulnérabilité. L’AMPK est un senseur d’énergie qui orchestre le rétablissement des i niveaux d’énergie cellulaire dans le cas d’une déplétion énergétique en modulant des voies de signalisation impliquant la synthèse de protéines et l’excitabilité membranaire. Il est possible que l’activation d’AMPK suite à un épisode asphyxique périnatal associé à des convulsions soit néfaste à long-‐terme pour le circuit GABAergique en développement et modifie l’établissement de l’innervation périsomatique d’une cellule PV sur les cellules pyramidales. Nous avons étudié cette hypothèse dans un modèle de culture organotypique en surexprimant la forme wild-‐type (WT) de la sous-‐unité α2 d’AMPK, ainsi qu’une forme mutée dominante négative (DN), dans des cellules PV individuelles. Nous avons montré que pendant la phase de formation synaptique (jours post-‐natals équivalents EP 10-‐18), la surexpression de la forme WT désorganise la stabilisation des synapses. De plus, l’abolition de l’activité d’AMPK semble augmenter le nombre de synapses périsomatiques faits par la cellule PV sur les cellules pyramidales pendant la phase de formation et semble avoir l’effet inverse pendant la phase de maturation (EP 16-‐24). La neurotransmission GABAergique joue plusieurs rôles dans le cerveau, depuis la naissance jusqu’à l’âge adulte des interneurones, et une dysfonction des interneurones a été associée à plusieurs troubles neurologiques, comme la schizophrénie, l’autisme et l’épilepsie. La maturation des circuits GABAergiques se fait majoritairement pendant la période post-‐natale et est hautement dépendante de l’activité neuronale et de l’expérience sensorielle. Nos résultats révèlent que le lourd fardeau en demande énergétique d’un épisode asphyxique périnatal peut causer une mort neuronale sélective des cellules PV et compromettre l’intégrité de leur maturation. Un des mécanismes sous-‐ jacents possible à cette immaturité des cellules PV suite à l’épisode hypoxique est l’activation d’AMPK, en désorganisant leur profil d’innervation sur les cellules pyramidales. Nous pensons que ces changements dans le réseau GABAergique pourrait contribuer aux problèmes neurologiques associés à une insulte hypoxique.