Higher incidence of death in multi-vessel coronary artery disease patients associated with polymorphisms in chromosome 9p21

Background: We investigated whether 9p21 polymorphisms are associated with cardiovascular events in a group of 611 patients enrolled in the Medical, Angioplasty or Surgery Study II (MASS II), a randomized trial comparing treatments for patients with coronary artery disease (CAD) and preserved left ventricular function. Methods: The participants of the MASS II were genotyped for 9p21 polymorphisms (rs10757274, rs2383206, rs10757278 and rs1333049). Survival curves were calculated with the Kaplan-Meier method and compared with the log-rank statistic. We assessed the relationship between baseline variables and the composite end-point of death, death from cardiac causes and myocardial infarction using a Cox proportional hazards survival model. Results: We observed significant differences between patients within each polymorphism genotype group for baseline characteristics. The frequency of diabetes was lower in patients carrying GG genotype for rs10757274, rs2383206 and rs10757278 (29.4%, 32.8%, 32.0%) compared to patients carrying AA or AG genotypes (49.1% and 39.2%, p = 0.01; 52.4% and 40.1%, p = 0.01; 47.8% and 37.9%, p = 0.04; respectively). Significant differences in genotype frequencies between double and triple vessel disease patients were observed for the rs10757274, rs10757278 and rs1333049. Finally, there was a higher incidence of overall mortality in patients with the GG genotype for rs2383206 compared to patients with AA and AG genotypes (19.5%, 11.9%, 11.0%, respectively; p = 0.04). Moreover, the rs2383206 was still significantly associated with a 1.75-fold increased risk of overall mortality (p = 0.02) even after adjustment of a Cox multivariate model for age, previous myocardial infarction, diabetes, smoking and type of coronary anatomy. Conclusions: Our data are in accordance to previous evidence that chromosome 9p21 genetic variation may constitute a genetic modulator in the cardiovascular system in different scenarios. In patients with established CAD, we observed an association between the rs2383206 and higher incidence of overall mortality and death from cardiac causes in patients with multi-vessel CAD.

Genotype analysis of the human endostatin variant p.D104N in benign and malignant adrenocortical tumors

OBJECTIVE: Endostatin is a potent endogenous inhibitor of angiogenesis. It is derived from the proteolytic cleavage of collagen XVIII, which is encoded by the COL18A1 gene. A polymorphic COL18A1 allele encoding the functional polymorphism p.D104N impairs the activity of endostatin, resulting in a decreased ability to inhibit angiogenesis. This polymorphism has been previously analyzed in many types of cancer and has been considered a phenotype modulator in some benign and malignant tumors. However, these data are controversial, and different results have been reported for the same tumor types, such as prostate and breast cancer. The purpose of this study was to genotype the p.D104N variant in a cohort of pediatric and adult patients with adrenocortical tumors and to determine its possible association with the biological behavior of adrenocortical tumors. METHODS: DNA samples were obtained from 38 pediatric and 56 adult patients (0.6-75 yrs) with adrenocortical tumors. The DNA samples were obtained from peripheral blood, frozen tissue or paraffin-embedded tumor blocks when blood samples or fresh frozen tissue samples were unavailable. Restriction fragment length polymorphism analysis was used to genotype the patients and 150 controls. The potential associations of the p.D104N polymorphism with clinical and histopathological features and oncologic outcome (age of onset, tumor size, malignant tumor behavior, and clinical syndrome) were analyzed. RESULTS: Both the patient group and the control group were in Hardy-Weinberg equilibrium. The frequencies of the p.D104N polymorphism in the patient group were 81.9% (DD), 15.9% (DN) and 2.2% (NN). In the controls, these frequencies were 80.6%, 17.3% and 2.0%, respectively. We did not observe any association of this variant with clinical or histopathological features or oncologic outcome in our cohort of pediatric and adult patients with adrenocortical tumors.

Adipose tissue inflammation and cancer cachexia: Possible role of nuclear transcription factors

Cancer cachexia is a multifaceted syndrome whose aetiology is extremely complex and is directly related to poor patient prognosis and survival. Changes in lipid metabolism in cancer cachexia result in marked reduction of total fat mass, increased lipolysis, total oxidation of fatty acids, hyperlipidaemia, hypertriglyceridaemia, and hypercholesterolaemia. These changes are believed to be induced by inflammatory mediators, such as tumour necrosis factor-alpha (TNF-alpha) and other factors. Attention has recently been drawn to the current theory that cachexia is a chronic inflammatory state, mainly caused by the host's reaction to the tumour. Changes in expression of numerous inflammatory mediators, notably in white adipose tissue (WAT), may trigger several changes in WAT homeostasis. The inhibition of adipocyte differentiation by PPAR gamma is paralleled by the appearance of smaller adipocytes, which may partially account for the inhibitory effect of PPAR gamma on inflammatory gene expression. Furthermore, inflammatory modulation and/or inhibition seems to be dependent on the IKK/NF-kappa B pathway, suggesting that a possible interaction between NF-kappa B and PPAR gamma is required to modulate WAT inflammation induced by cancer cachexia. In this article, current literature on the possible mechanisms of NF-kappa B and PPAR gamma regulation of WAT cells during cancer cachexia are discussed. This review aims to assess the role of a possible interaction between NF-kappa B and PPAR gamma in the setting of cancer cachexia as well as its significant role as a potential modulator of chronic inflammation that could be explored therapeutically. Crown Copyright (C) 2011 Published by Elsevier Ltd. All rights reserved.

Space and Motion Perception and Discomfort in Air Travel

RAMOS RT, MATTOS DA, REBOUCAS ITS, RANVAUD RD. Space and motion perception and discomfort in air travel. Aviat Space Environ Med 2012; 83:1162-6. Introduction: The perception of comfort during air trips is determined by several factors. External factors like cabin design and environmental parameters (temperature, humidity, air pressure, noise, and vibration) interact with individual characteristics (anxiety traits, fear of flying, and personality) from arrival at the airport to landing at the destination. In this study, we investigated the influence of space and motion discomfort (SMD), fear of heights, and anxiety on comfort perception during all phases of air travel. Methods: We evaluated 51 frequent air travelers through a modified version of the Flight Anxiety Situations Questionnaire (FAS), in which new items were added and where the subjects were asked to report their level of discomfort or anxiety (not fear) for each phase of air travel (Chronbach's alpha = 0.974). Correlations were investigated among these scales: State-Trait Anxiety Inventory (STAB, Cohen's Acrophobia Questionnaire, and the Situational Characteristics Questionnaire (SitQ, designed to estimate SMD levels). Results: Scores of SitQ correlated with discomfort in situations involving space and movement perception (Pearson's rho = 0.311), while discomfort was associated with cognitive mechanisms related to scores in the anxiety scales (Pearson's rho = 0.375). Anxiety traits were important determinants of comfort perception before and after flight, while the influence of SMD was more significant during the time spent in the aircraft cabin. Discussion: SMD seems to be an important modulator of comfort perception in air travel. Its influence on physical well being and probably on cognitive performance, with possible effects on flight safety, deserves further investigation.

SET overexpression decreases cell detoxification efficiency: ALDH2 and GSTP1 are downregulated, DDR is impaired and DNA damage accumulates

Alcohol and tobacco consumption are risk factors for head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC). Aldehyde dehydrogenase 2 (ALDH2) and glutathione Stransferase pi 1 (GSTP1) are important enzymes for cellular detoxification and low efficiencies are implicated in cancer. We assessed the potential role of SET protein overexpression, a histone acetylation modulator accumulated in HNSCC, in gene regulation and protein activity of ALDH2 and GSTP1. SET was knocked down in HN13, HN12 and Cal27, and overexpressed in HEK293 cells; ethanol and cisplatin were the chemical agents. Cells with SET overexpression (HEK293/SET, HN13 and HN12) showed lower ALDH2 and GSTP1 mRNA levels and trichostatin A increased them (real-time PCR). Ethanol upregulated GSTP1 and ALDH2 mRNAs, whereas cisplatin upregulated GSTP1 in HEK293 cells. SET-chromatin binding revealed SET interaction with ALDH2 and GSTP1 promoters, specifically via SET NAP domain; ethanol and cisplatin abolished SET binding. ALDH2 and GSTP1 efficiency was assessed by enzymatic and comet assay. A lower ALDH2 activity was associated with greater DNA damage (tail intensity) in HEK293/SET compared with HEK293 cells, whereas HN13/siSET showed ALDH2 activity higher than HN13 cells. HN13/siSET cells showed increased tail intensity. Cisplatin-induced DNA damage response showed negative relationship between SET overexpression and BRCA2 recruitment. SET downregulated repair genes ATM, BRCA1 and CHEK2 and upregulated TP53. Cisplatin-induced cell-cycle arrest occurred in G0/G1 and S in HEK293 cells, whereas HEK293/SET showed G2/M stalling. Overall, cisplatin was more cytotoxic for HN13 than HN13/siSET cells. Our data suggest a role for SET in cellular detoxification, DNA damage response and genome integrity.

Parameters and algorithms to evaluate cardiac mechanics by conductance catheter

This work is structured as follows: In Section 1 we discuss the clinical problem of heart failure. In particular, we present the phenomenon known as ventricular mechanical dyssynchrony: its impact on cardiac function, the therapy for its treatment and the methods for its quantification. Specifically, we describe the conductance catheter and its use for the measurement of dyssynchrony. At the end of the Section 1, we propose a new set of indexes to quantify the dyssynchrony that are studied and validated thereafter. In Section 2 we describe the studies carried out in this work: we report the experimental protocols, we present and discuss the results obtained. Finally, we report the overall conclusions drawn from this work and we try to envisage future works and possible clinical applications of our results. Ancillary studies that were carried out during this work mainly to investigate several aspects of cardiac resynchronization therapy (CRT) are mentioned in Appendix. -------- Ventricular mechanical dyssynchrony plays a regulating role already in normal physiology but is especially important in pathological conditions, such as hypertrophy, ischemia, infarction, or heart failure (Chapter 1,2.). Several prospective randomized controlled trials supported the clinical efficacy and safety of cardiac resynchronization therapy (CRT) in patients with moderate or severe heart failure and ventricular dyssynchrony. CRT resynchronizes ventricular contraction by simultaneous pacing of both left and right ventricle (biventricular pacing) (Chapter 1.). Currently, the conductance catheter method has been used extensively to assess global systolic and diastolic ventricular function and, more recently, the ability of this instrument to pick-up multiple segmental volume signals has been used to quantify mechanical ventricular dyssynchrony. Specifically, novel indexes based on volume signals acquired with the conductance catheter were introduced to quantify dyssynchrony (Chapter 3,4.). Present work was aimed to describe the characteristics of the conductancevolume signals, to investigate the performance of the indexes of ventricular dyssynchrony described in literature and to introduce and validate improved dyssynchrony indexes. Morevoer, using the conductance catheter method and the new indexes, the clinical problem of the ventricular pacing site optimization was addressed and the measurement protocol to adopt for hemodynamic tests on cardiac pacing was investigated. In accordance to the aims of the work, in addition to the classical time-domain parameters, a new set of indexes has been extracted, based on coherent averaging procedure and on spectral and cross-spectral analysis (Chapter 4.). Our analyses were carried out on patients with indications for electrophysiologic study or device implantation (Chapter 5.). For the first time, besides patients with heart failure, indexes of mechanical dyssynchrony based on conductance catheter were extracted and studied in a population of patients with preserved ventricular function, providing information on the normal range of such a kind of values. By performing a frequency domain analysis and by applying an optimized coherent averaging procedure (Chapter 6.a.), we were able to describe some characteristics of the conductance-volume signals (Chapter 6.b.). We unmasked the presence of considerable beat-to-beat variations in dyssynchrony that seemed more frequent in patients with ventricular dysfunction and to play a role in discriminating patients. These non-recurrent mechanical ventricular non-uniformities are probably the expression of the substantial beat-to-beat hemodynamic variations, often associated with heart failure and due to cardiopulmonary interaction and conduction disturbances. We investigated how the coherent averaging procedure may affect or refine the conductance based indexes; in addition, we proposed and tested a new set of indexes which quantify the non-periodic components of the volume signals. Using the new set of indexes we studied the acute effects of the CRT and the right ventricular pacing, in patients with heart failure and patients with preserved ventricular function. In the overall population we observed a correlation between the hemodynamic changes induced by the pacing and the indexes of dyssynchrony, and this may have practical implications for hemodynamic-guided device implantation. The optimal ventricular pacing site for patients with conventional indications for pacing remains controversial. The majority of them do not meet current clinical indications for CRT pacing. Thus, we carried out an analysis to compare the impact of several ventricular pacing sites on global and regional ventricular function and dyssynchrony (Chapter 6.c.). We observed that right ventricular pacing worsens cardiac function in patients with and without ventricular dysfunction unless the pacing site is optimized. CRT preserves left ventricular function in patients with normal ejection fraction and improves function in patients with poor ejection fraction despite no clinical indication for CRT. Moreover, the analysis of the results obtained using new indexes of regional dyssynchrony, suggests that pacing site may influence overall global ventricular function depending on its relative effects on regional function and synchrony. Another clinical problem that has been investigated in this work is the optimal right ventricular lead location for CRT (Chapter 6.d.). Similarly to the previous analysis, using novel parameters describing local synchrony and efficiency, we tested the hypothesis and we demonstrated that biventricular pacing with alternative right ventricular pacing sites produces acute improvement of ventricular systolic function and improves mechanical synchrony when compared to standard right ventricular pacing. Although no specific right ventricular location was shown to be superior during CRT, the right ventricular pacing site that produced the optimal acute hemodynamic response varied between patients. Acute hemodynamic effects of cardiac pacing are conventionally evaluated after stabilization episodes. The applied duration of stabilization periods in most cardiac pacing studies varied considerably. With an ad hoc protocol (Chapter 6.e.) and indexes of mechanical dyssynchrony derived by conductance catheter we demonstrated that the usage of stabilization periods during evaluation of cardiac pacing may mask early changes in systolic and diastolic intra-ventricular dyssynchrony. In fact, at the onset of ventricular pacing, the main dyssynchrony and ventricular performance changes occur within a 10s time span, initiated by the changes in ventricular mechanical dyssynchrony induced by aberrant conduction and followed by a partial or even complete recovery. It was already demonstrated in normal animals that ventricular mechanical dyssynchrony may act as a physiologic modulator of cardiac performance together with heart rate, contractile state, preload and afterload. The present observation, which shows the compensatory mechanism of mechanical dyssynchrony, suggests that ventricular dyssynchrony may be regarded as an intrinsic cardiac property, with baseline dyssynchrony at increased level in heart failure patients. To make available an independent system for cardiac output estimation, in order to confirm the results obtained with conductance volume method, we developed and validated a novel technique to apply the Modelflow method (a method that derives an aortic flow waveform from arterial pressure by simulation of a non-linear three-element aortic input impedance model, Wesseling et al. 1993) to the left ventricular pressure signal, instead of the arterial pressure used in the classical approach (Chapter 7.). The results confirmed that in patients without valve abnormalities, undergoing conductance catheter evaluations, the continuous monitoring of cardiac output using the intra-ventricular pressure signal is reliable. Thus, cardiac output can be monitored quantitatively and continuously with a simple and low-cost method. During this work, additional studies were carried out to investigate several areas of uncertainty of CRT. The results of these studies are briefly presented in Appendix: the long-term survival in patients treated with CRT in clinical practice, the effects of CRT in patients with mild symptoms of heart failure and in very old patients, the limited thoracotomy as a second choice alternative to transvenous implant for CRT delivery, the evolution and prognostic significance of diastolic filling pattern in CRT, the selection of candidates to CRT with echocardiographic criteria and the prediction of response to the therapy.

Paralelización de un algoritmo de ray tracing para arrays de mililentes

Máster Universitario en Sistemas Inteligentes y Aplicaciones Numéricas en Ingeniería (SIANI)

Role of BDNF secretion and signaling in the activity-dependent refinement of synaptic connections

Neuronal networks exhibit diverse types of plasticity, including the activity-dependent regulation of synaptic functions and refinement of synaptic connections. In addition, continuous generation of new neurons in the “adult” brain (adult neurogenesis) represents a powerful form of structural plasticity establishing new connections and possibly implementing pre-existing neuronal circuits (Kempermann et al, 2000; Ming and Song, 2005). Neurotrophins, a family of neuronal growth factors, are crucially involved in the modulation of activity-dependent neuronal plasticity. The first evidence for the physiological importance of this role evolved from the observations that the local administration of neurotrophins has dramatic effects on the activity-dependent refinement of synaptic connections in the visual cortex (McAllister et al, 1999; Berardi et al, 2000; Thoenen, 1995). Moreover, the local availability of critical amounts of neurotrophins appears to be relevant for the ability of hippocampal neurons to undergo long-term potentiation (LTP) of the synaptic transmission (Lu, 2004; Aicardi et al, 2004). To achieve a comprehensive understanding of the modulatory role of neurotrophins in integrated neuronal systems, informations on the mechanisms about local neurotrophins synthesis and secretion as well as ditribution of their cognate receptors are of crucial importance. In the first part of this doctoral thesis I have used electrophysiological approaches and real-time imaging tecniques to investigate additional features about the regulation of neurotrophins secretion, namely the capability of the neurotrophin brain-derived neurotrophic factor (BDNF) to undergo synaptic recycling. In cortical and hippocampal slices as well as in dissociated cell cultures, neuronal activity rapidly enhances the neuronal expression and secretion of BDNF which is subsequently taken up by neurons themselves but also by perineuronal astrocytes, through the selective activation of BDNF receptors. Moreover, internalized BDNF becomes part of the releasable source of the neurotrophin, which is promptly recruited for activity-dependent recycling. Thus, we described for the first time that neurons and astrocytes contain an endocytic compartment competent for BDNF recycling, suggesting a specialized form of bidirectional communication between neurons and glia. The mechanism of BDNF recycling is reminiscent of that for neurotransmitters and identifies BDNF as a new modulator implicated in neuro- and glio-transmission. In the second part of this doctoral thesis I addressed the role of BDNF signaling in adult hippocampal neurogenesis. I have generated a transgenic mouse model to specifically investigate the influence of BDNF signaling on the generation, differentiation, survival and connectivity of newborn neurons into the adult hippocampal network. I demonstrated that the survival of newborn neurons critically depends on the activation of the BDNF receptor TrkB. The TrkB-dependent decision regarding life or death in these newborn neurons takes place right at the transition point of their morphological and functional maturation Before newborn neurons start to die, they exhibit a drastic reduction in dendritic complexity and spine density compared to wild-type newborn neurons, indicating that this receptor is required for the connectivity of newborn neurons. Both the failure to become integrated and subsequent dying lead to impaired LTP. Finally, mice lacking a functional TrkB in the restricted population of newborn neurons show behavioral deficits, namely increased anxiety-like behavior. These data suggest that the integration and establishment of proper connections by newly generated neurons into the pre-existing network are relevant features for regulating the emotional state of the animal.

Einfluss gedächtnisrelevanter Prozesse auf die Glutamat- und GABA-Freisetzung aus hippocampalen Primärkulturzellen

Titel: Einfluss gedächtnisrelevanter Prozesse auf die Glutamat- und GABA-Freisetzung aus hippocampalen Primärkulturzellen In der vorliegenden Arbeit wurde ein biochemisches Testsystem etabliert, mit dem es möglich ist, die Freisetzung der Aminosäure-Neurotransmitter Glutamat und GABA aus neuronalem Gewebe auf dem Vielzellniveau zu untersuchen. Der qualitative und quantitative Nachweis der beiden Neurotransmitter erfolgte mit Hilfe der Reversed-Phase-Hochleistungsflüssigkeits-Chromatographie mit Fluoreszenzdetektion. Mit dem Testsystem wurden zwei Untersuchungsreihen durchgeführt: 1.) Es wurde der Einfluss des nAChR-Agonisten Nikotin und des allosterisch an nAChR wirkenden Liganden Galanthamin auf die Glutamat- und GABA-Freisetzung aus Zellen serumfreier hippocampaler Primärkulturen untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass der für einzelne hippocampale Zellen beschriebene positiv modulatorische Effekt von Nikotin auf die glutamaterge und GABAerge Neurotransmission auch auf dem Vielzellniveau über die Neurotransmitterfreisetzung nachweisbar ist. Desweiteren konnte erstmals gezeigt werden, dass die Nikotin-modulierte Glutamat- und GABA-Freisetzung durch den allosterisch wirkenden nAChR-Liganden Galanthamin signifikant beeinflusst wird. 2.) Es wurde der Einfluss einer LTP-ähnlichen Glutamatpotenzierung auf die GABA-Freisetzung aus serumfreien hippocampalen Primärkulturen untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass hippocampale Neuronen in potenziertem (= vorstimuliertem) Zustand auf einen zweiten Glutamat-Stimulus mit einer verringerten GABA-Freisetzung reagieren. Dieser Effekt wird im Wesentlichen über die ionotropen Glutamatrezeptoren vermittelt.

Charakterisierung funktioneller Domänen für GABA und Furosemid auf GABA A-Rezeptoren

ZUSAMMENFASSUNGDie schnelle inhibitorische Neurotransmission im Säugerhirn ist wesentlich GABA-erg vermittelt.Neben GABA binden u.a. Picrotoxinin und TBPS (tert-Butylbicyclophosphorothionat) am GABAA-Rezeptor. Die Bindung von [35S]TBPS wird durch alle am GABAA-Rezeptor bindenden Substanzen moduliert. Zur Untersuchung der GABAA-Rezeptor-Funktionen wurden TBPS-Bindungsstudien an rekombinant exprimierten Rezeptoren in vitro und nativen Rezeptoren in situ verwendet.Die alpha-Untereinheiten spielen bei der gehirnarealspezifischen Auswirkungen verschiedener GABA-Mimetika, der Charakterisierung subtypspezifischer Substanzen und der Ausprägung der GABA-Sensitivitäten eine große Rolle. Für die Detaillierung der höheren GABA-Sensitivität alpha6-enthaltender Rezeptoren wurden Chimären und Punktmutationen zwischen den Untereinheiten alpha1 und alpha6 hergestellt. Nach Austausch des Asparagins 188 in der alpha1-Untereinheit durch das alpha6-entsprechende Lysin zeigten Rezeptoren in Kombination mit den Untereinheiten beta3 und gamma2 eine erhöhte GABA-Sensitivität gegenüber dem Wildtyp. Dementsprechend wiesen alpha6-enthaltende Rezeptoren mit der umgekehrten Punktmutation L187N eine geringere GABA-Sensitivität auf. Furosemid wirkt ausschließlich auf alpha6beta2/3-enthaltende GABAA-Rezeptors GABA-agonistisch. [35S]TBPS-Bindungsstudien an chimären alpha1/alpha6-Rezeptoren weisen auf eine niedrigpotente Bindungsstelle für Furosemid im extrazellulären Sequenzabschnitt zwischen der Aoc I-Schnittstelle und der TM3-Region hin. Die Substanz 4 PIOL zeigte subtypspezifischen Charakter am GABAA-Rezeptor. In den [35S]TBPS-Autoradiographien und den Bindungsstudien an Membranen wirkte 4 PIOL auf alpha6-enthaltende Rezeptoren schwach GABA-mimetisch bzw. agonistisch, in den [35S]TBPS-Bindungsstudien an alpha6-enthaltenden rekombinanten Rezeptoren schwach negativ modulatorisch oder antagonistisch.

Domänen des Kapsidproteins L2 humanpathogener Papillomviren für die Interaktion mit viralen und zellulären Bindungspartnern

Die Kapsidproteine L1 und L2 von humanen Papillomviren (HPV) werden im Cytoplasma infizierter Keratinocyten synthetisiert und gelangen unabhängig voneinander in den Kern (Florin et al. 2002b). L2 lokalisiert in speziellen Kerndomänen, sog. ND10, und induziert die Reorganisation dieser Kernstrukturen: L2-abhängig akkumuliert der transkriptionelle Modulator Daxx verstärkt in ND10 und außerdem kommt es zum Ausschluss des transkriptionellen Aktivators Sp100 aus diesen Domänen (Florin et al. 2002a). Im Anschluss an diese Umorganisation im Kern induziert L2 die Lokalisation des Kapsidproteins L1 in ND10 (Florin et al. 2002b). Da auch die Replikation und Transkription von Papillomviren in oder in unmittelbarer Nähe von ND10 stattfinden, werden ND10 als Orte der Papillomvirus-Morphogenese diskutiert (Swindle et al. 1999). Innerhalb dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass L1 und L2 im Cytoplasma der Zellen mit Chaperonen interagieren, und dass der Kerntransport von L2 von der L2/Hsc70-Assoziation abhängig ist. Hsc70, das mit dem C-Terminus von L2 assoziiert ist, wird in virusähnliche Partikel (VLPs) eingebaut. Erst durch die Verpackung von DNA in die Kapside kommt es zum Ausschluss von Hsc70 aus dem Papillomvirus-Kapsid. Ergebnisse dieser Arbeit lassen zudem vermuten, dass L2 über seinen C-Terminus mit Mikrotubuli interagieren kann, falls diese Aminosäure-Region in L2 nicht durch das Chaperon maskiert wird. Mit Hilfe dieser Erkenntnisse wurde eine Modellvorstellung für die Rolle von L2 während der Infektion und der Morphogenese von HPV entwickelt. Die ND10-Lokalisationsdomäne (NDLD) in L2 konnte wie bei keinem Protein zuvor auf eine sehr kurze Sequenz von 22 Aminosäuren eingeengt werden. Welcher Mechanismus für die ND10-Lokalisation verantwortlich ist, muss dagegen noch geklärt werden. Alle L2-Mutanten, die ND10-Lokalisation zeigen, induzieren auch die Reorganisation dieser Domänen. Dies spricht dafür, dass L2 direkt in ND10 die Veränderungen hervorruft und wahrscheinlich keine zusätzlichen Domänen in L2 daran beteiligt sind. Es konnten zwei L1-Interaktionsdomänen in L2 kartiert werden. Diese beiden Regionen in L2 konnten nicht genauer lokalisiert werden und umfassen möglicherweise mehrere L1-Interaktionsdomänen. Der Einbau von L2 in die Kapside kann nur im Kern infizierter Zellen stattfinden. Hierfür ist die Lokalisation der Kapsidproteine in ND10 nicht notwendig. Weiterführende Versuche müssen jedoch noch klären, inwieweit ND10 trotzdem unerlässlich für eine produktive Morphogenese sind. Zudem wurde klar, dass die ersten 150 Aminosäuren im L2-Protein für das L1/L2-Verhältnis in Kapsiden verantwortlich sind. In Virionen beträgt dieses Verhältnis 30:1, d. h. zwölf L2-Moleküle werden in die Partikel aus 360 L1-Molekülen eingebaut. Bei der Verwendung der Deletionsmutante L2-150/467 beträgt dieses Verhältnis 5:1. Weitere Analysen, welche Regionen von L1 und L2 miteinander interagieren und wodurch die Beschränkung des L1/L2-Verhältnisses in Papillomviren zustande kommt, können genauere Einblicke in den Aufbau der Kapside und speziell die Lage von L2 im Kapsid liefern.

Genomische Struktur und Promotorcharakterisierung des humanen ADAM10-Gens

Das ADAM10-Gen kodiert für eine membrangebundene Disintegrin-Metalloproteinase, die das Amyloidvorläuferprotein spaltet. Im Mausmodell konnte bewiesen werden, dass die Überexpression von ADAM10 die Plaquebildung vermindern und das Langzeitgedächtnis verbessert. Aus diesem Grund ist es für einen möglichen Therapieansatz für die Alzheimer’sche Erkrankung erforderlich, die Organisation des humanen ADAM10-Gens und seines Promotors aufzuklären. Beim Vergleich der genomischen Sequenzen von humanem und murinem ADAM10 zeigte sich eine hohe Übereinstimmung. Beide Gene umfassen 160 kbp und bestehen aus 16 Exons. Die ersten 500 bp stromaufwärts vom Translationsstartpunkt zwischen dem Menschen, der Maus und der Ratte sind hoch konserviert. Diese Region beinhaltet spezifische regulatorische Elemente, die die ADAM10-Transkription modulieren. In den ersten 2179 bp stromaufwärts vom humanen ADAM10-Translationsstartpunkt fanden sich einige potentiellen Transkriptionsfaktor-bindungsstellen (Brn-2, SREBP, Oct-1, Creb1/cJun, USF, Maz, MZF-1, NFkB und CDPCR3HD). Es wurde eine charakteristische GC-Box und eine CAAT-Box, aber keine TATA-Box identifiziert. Nach Klonierung dieser 2179 bp großen Region wurde eine starke Promotoraktivität, insbesondere in neuronalen Zelllinien, gefunden. Bei der Analyse von Deletionskonstrukten wurde die Region zwischen -508 und -300 als essentiell für die Transkriptionsaktivierung bestimmt. Die Promotoraktivität wird zudem streng herunterreguliert, wenn in die Region 317 bp stromaufwärts vom Startpunkt der Translation eine Punktmutation eingeführt wird. Diese per Computeranalyse als USF-Bindungsstelle deklarierte Region spielt eine zentrale Rolle bei der ADAM10-Transkription. Im EMSA wurde eine Protein-DNA-Interaktion für diese Region gezeigt. Durch transienten Transfektionen in Schneider Drosophila Insektenzellen konnte nachgewiesen werden, dass die Überexpression von Sp1 und USp3 für die ADAM10-Promotoraktivität entscheidend ist. In EMSA-Studien bestätigte sich eine Protein-DNA-Interaktion für die Region -366 bp stromaufwärts vom Translationsstartpunkt. Die Punktmutation in der CAAT-Box veränderte die die Promotoraktivität nicht. Da weiterhin für diese potentielle Bindungsstelle kein Bindungsfaktor vorausgesagt wurde, scheint die CAAT-Box keine Bedeutung bei der Promotorregulation zu spielen. Schließlich fand sich im EMSA eine Protein-DNA-Interaktion für die Bindungsstelle 203 bp stromaufwärts vom Translationsstartpunkt. Diese in Computeranalysen als RXR-Bindungsstelle identifizierte Region ist ebenfalls von Bedeutung in der Promotorregulation. Auf der Suche nach Substanzen, die die ADAM10-Promotoraktivität beeinflussen, wurde ein negativer Effekt durch die apoptoseauslösende Substanz Camptothecin und ein positiver Effekt durch die zelldifferenzierungsauslösende Substanz all-trans Retinsäure festgestellt. Mit dieser Arbeit wurde die genomische Organisation des ADAM10-Gens zusammen mit dem zugehörigen Promotor aufgeklärt und ein neuer Regulationsmechanismus für die Hochregulation der Expression der alpha-Sekretase ADAM10 gefunden. Im Weiteren sollen nun die genauen Mechanismen bei der Hochregulation der alpha-Sekretase ADAM10 durch Retinsäure untersucht und durch Mikroarray-Analysen an RNA-Proben transgener Mäuse, welche ADAM10 überexpremieren, neue therapeutische Ansätze zur Behandlung der Alzheimer´schen Erkrankung identifiziert werden.

Untersuchungen zur Funktion und Regulation der Rezeptor-Tyrosin-Phosphatase RPTPlambda bei der Entwicklung des Mittel- und Hinterhirns

Der isthmische Organisator liegt an der Grenze zwischen dem sich entwickelnden Mittel- und Hinterhirn und kontrolliert Wachstum und Musterbildung dieser beiden Hirnregionen. In der vorliegenden Arbeit wird die räumliche und zeitliche Expression der Rezeptor-ähnlichen Protein Tyrosin Phosphatase lambda aus dem Huhn (cRPTPλ, auch als cRPTPψ bekannt) während der Entwicklung dieser Struktur beschrieben. Nach einer anfänglich weitläufigen Expression im kaudalen Vorderhirn und in der Mittelhirnregion, beschränkt sich die Expression von cRPTPλ zwischen dem embryonalen Tag E2 und E3.5 auf die ventrale Mittellinie des Neuralrohrs, den Bereich der späteren neuralen Retina und Linse und auf einen schmalen Ring anterior der isthmischen Einschnürung, welcher der molekularen Mittel- / Hinterhirngrenze (MHO) entspricht. Ab dem embryonalen Tag E3.5 wird RPTPλ dann auch im gesamten Mittelhirn gebildet. Um Hinweise auf die Funktion von cRPTPλ zu bekommen, wurde die Regulation dieses Moleküls untersucht. Die Expression von cRPTPλ am MHO wird von dem Fibroblasten Wachstumsfaktor Fgf8 und dem Transkriptionsfaktor Lmx1b, nicht aber von dem sezernierten Glykoprotein Wnt1 induziert. Der Transkriptionsfaktor En-1 unterdrückt die Expression von cRPTPλ am MHO. cRPTPλ-Expression im Mittelhirn wird negativ durch das sezernierte Protein Sonic Hedgehog reguliert, während Lmx1b und En-1 dort keinen Einfluss auf das Expressionsmuster von cRPTPλ haben. Fgf8 und Wnt1 sind maßgeblich an der Regulation von Wachstum und Musterbildung des embryonalen Mittelhirns beteiligt. Funktionelle Studien zu RPTPλ deuten darauf hin, dass dieses Protein als negativer Rückkopplungsmechanismus beider Signalwege wirken kann. RNAi- und Überexpressionsstudien am MHO lieferten Hinweise darauf, dass RPTPλ der Induktion der Wnt1-Expression durch Fgf8 entgegenwirkt. Dies scheint durch Interaktion noch unbekannter Faktoren mit der Juxtamembrandomäne von RPTPλ vermittelt zu werden. Auf das Expressionsmuster von Fgf8 selbst, oder einer Reihe anderer Faktoren, die ebenfalls von Fgf8 reguliert werden, hat RPTPλ allerdings keinen Einfluss. Des Weiteren konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass eine „künstliche“ Aufrechterhaltung der Expression von cRPTPλ im Mittelhirn zwischen dem embryonalen Tag E2 und E3.5 zu einem stark verkleinerten Mesenzephalon führt. RPTPλ bindet in vivo an β-Catenin, ein zentrales Protein des kanonischen Wnt-Signalweges, und moduliert dadurch vermutlich das Wnt-Signal, welches seinerseits Proliferation im Mesenzephalon fördert. Durch diesen Mechanismus könnte cRPTPλ als „Bremse“ des kanonischen Wnt-Signalweges im Mittelhirn wirken.

Analysis and Implementation of Multiphase-Multilevel Inverter for Open-Winding Loads

Research work carried out in focusing a novel multiphase-multilevel ac motor drive system much suitable for low-voltage high-current power applications. In specific, six-phase asymmetrical induction motor with open-end stator winding configuration, fed from four standard two-level three-phase voltage source inverters (VSIs). Proposed synchronous reference frame control algorithm shares the total dc source power among the 4 VSIs in each switching cycle with three degree of freedom. Precisely, first degree of freedom concerns with the current sharing between two three-phase stator windings. Based on modified multilevel space vector pulse width modulation shares the voltage between each single VSIs of two three-phase stator windings with second and third degree of freedom, having proper multilevel output waveforms. Complete model of whole ac motor drive based on three-phase space vector decomposition approach was developed in PLECS - numerical simulation software working in MATLAB environment. Proposed synchronous reference control algorithm was framed in MATLAB with modified multilevel space vector pulse width modulator. The effectiveness of the entire ac motor drives system was tested. Simulation results are given in detail to show symmetrical and asymmetrical, power sharing conditions. Furthermore, the three degree of freedom are exploited to investigate fault tolerant capabilities in post-fault conditions. Complete set of simulation results are provided when one, two and three VSIs are faulty. Hardware prototype model of quad-inverter was implemented with two passive three-phase open-winding loads using two TMS320F2812 DSP controllers. Developed McBSP (multi-channel buffered serial port) communication algorithm able to control the four VSIs for PWM communication and synchronization. Open-loop control scheme based on inverse three-phase decomposition approach was developed to control entire quad-inverter configuration and tested with balanced and unbalanced operating conditions with simplified PWM techniques. Both simulation and experimental results are always in good agreement with theoretical developments.

Specific PET-ligands for selected 5-HT and GABA A-receptor subtypes = PET-Liganden mit Spezifität für definierte 5-HT und GABA A-Rezeptor-Subtypen

Für diese Arbeit wurden sechs neue Benzodiazepinderivate, TC07, TC08, TC09, TC10, TC11 und TC12, hergestellt. Diese wurden mittels Radioligandenbindungsassay sowohl auf ihre Bindungseigenschaften für Membranen des Cerebellum, des Hippo-campus und des Cortex der Ratte hin untersucht, als auch für Membranen von HEK293 Zellen, die transient rekombinante GABAA Rezeptoren exprimierten. Zusätz-lich wurden kompetitive in situ Rezeptorautoradiographien an Rattenhirnschnitten mit den Liganden [3H]Ro15-4513 und [3H]R015-1788 durchgeführt. Zusammen ergaben sich aus diesen Experimenten deutliche Hinweise auf eine Selektivität der Verbindun-gen TC07, TC11 und TC12 für a5-Untereinheiten enthaltende GABAA Rezeptoren mit a5-Affinitäten im niedrigen nanomolaren Bereich. In vivo Bindungsexperimente in Ratten, mit [3H]Ro15-1788 als Tracer und TC07 als Kompetitor, ergaben, dass TC07 mehr [3H]Ro15-1788 im Vorderhirn als im Cerebellum verdrängt. Bezog man die regionale Verteilung der a5-Untereinheit des GABAA Rezep-tors im Rattenhirn mit ein – sehr wenige a5-Untereinheiten im Cerebellum, etwa 20 % der GABAA Rezeptor-Untereinheiten im Hippocampus – untermauerten diese Ergeb-nisse die Vermutung, TC07 könne a5-selektiv sein. Diese Daten bestätigten darü-berhinaus, dass TC07 die Blut-Hirn-Schranke passieren kann. Für elektrophysiologische Messungen mit TC07 und TC12 wurden die oben erwähnten transient transfizierten HEK293 Zellen verwendet, welche die GABAA Rezeptor Unte-reinheitenkombination a5b3g2 exprimierten. Das Dosis-Antwort Verhalten ergab keinen signifikanten Effekt für TC12. Die Daten von TC07 dagegen lassen auf einen schwach negativ modulatorischen Effekt schließen, was, zumindest theoretisch, die Möglichkeit eröffnet, TC07 auch als sogenannten cognitive enhancer einzusetzen. Der errechnete Ki-Wert lag in derselben Größenordnung wie der Ki-Wert, der anhand der Bindungsas-saydaten errechnet wurde. Insgesamt rechtfertigen die bisherigen Ergebnisse die radiochemische Markierung mit 18F von drei der sechs getesteten Verbindungen in der Reihenfolge TC07, TC12 und TC11. Des Weiteren wurde [18F]MHMZ, ein potentiell 5-HT2A selektiver Ligand und PET-Tracer einschließlich Vorläufer und Referenzverbindungen, mit hohen Ausbeuten syn-thetisiert (Herth, Debus et al. 2008). Autoradiographieexperimente mit Rattenhirn-schnitten zeigten hervorragende in situ Bindungseigenschaften der neuen Verbindung. Die Daten wiesen eine hohe Selektivität für 5-HT2A Rezeptoren in Verbindung mit einer niedrigen unspezifischen Bindung auf. [18F]MHMZ erfährt in vivo eine schnelle Metabo-lisierung, wobei ein polarer aktiver Metabolit entsteht, welcher vermutlich nicht die Blut-Hirn-Schranke passieren kann. Transversale, sagittale und coronale Kleintier-PET-Bilder des Rattenhirns zeigten eine hohe Anreicherung im frontalen Cortex und im Striatum, während im Cerebellum so gut wie keine Anreicherung festzustellen war. Diese Verteilung deckt sich mit der bekann-ten Verteilung der 5-HT2A Rezeptoren. Die in vivo Anreicherung scheint sich ebenfalls gut mit der Verteilung der in den Autoradiographieexperimenten gemessenen Bindung zu decken. Nach Berechnungen mit dem 4-Parameter Referenzgewebe Modell beträgt das Bindungspotential (BP) für den frontalen Cortex 1,45. Das Cortex zu Cerebellum Verhältnis wurde auf 2,7 nach 30 Minuten Messzeit bestimmt, was bemerkenswert nah an den von Lundkvist et al. für [11C]MDL 100907 publizierten Daten liegt. Abgesehen von der etwas niedrigeren Affinität waren die gemessenen in vitro, in situ und in vivo Daten denen von [3H]MDL 100907 und [11C]MDL 100907 sehr ähnlich, so dass wir ein [18F]Analogon in der Hand haben, das die bessere Selektivität von MDL 100907 verglichen mit Altanserin mit der längeren Halbwertszeit und den besse-ren Eigenschaften für die klinische Routine von 18F verglichen mit 11C verbindet. Die Ergebnisse von [18F]MHMZ rechtfertigenden weitere Experimente, um diesen Liganden für die klinische Routine am Menschen nutzbar zu machen.