Innovative analytical strategies for the development of sensor devices and mass spectrometry methods

Il lavoro presentato in questa tesi di Dottorato è incentrato sullo sviluppo di strategie analitiche innovative basate sulla sensoristica e su tecniche di spettrometria di massa in ambito biologico e della sicurezza alimentare. Il primo capitolo tratta lo studio di aspetti metodologici ed applicativi di procedure sensoristiche per l’identificazione e la determinazione di biomarkers associati alla malattia celiaca. In tale ambito, sono stati sviluppati due immunosensori, uno a trasduzione piezoelettrica e uno a trasduzione amperometrica, per la rivelazione di anticorpi anti-transglutaminasi tissutale associati a questa malattia. L’innovazione di questi dispositivi riguarda l’immobilizzazione dell’enzima tTG nella conformazione aperta (Open-tTG), che è stato dimostrato essere quella principalmente coinvolta nella patogenesi. Sulla base dei risultati ottenuti, entrambi i sistemi sviluppati si sono dimostrati una valida alternativa ai test di screening attualmente in uso per la diagnosi della celiachia. Rimanendo sempre nel contesto della malattia celiaca, ulteriore ricerca oggetto di questa tesi di Dottorato, ha riguardato lo sviluppo di metodi affidabili per il controllo di prodotti “gluten-free”. Il secondo capitolo tratta lo sviluppo di un metodo di spettrometria di massa e di un immunosensore competitivo per la rivelazione di prolammine in alimenti “gluten-free”. E’ stato sviluppato un metodo LC-ESI-MS/MS basato su un’analisi target con modalità di acquisizione del segnale selected reaction monitoring per l’identificazione di glutine in diversi cereali potenzialmente tossici per i celiaci. Inoltre ci si è focalizzati su un immunosensore competitivo per la rivelazione di gliadina, come metodo di screening rapido di farine. Entrambi i sistemi sono stati ottimizzati impiegando miscele di farina di riso addizionata di gliadina, avenine, ordeine e secaline nel caso del sistema LC-MS/MS e con sola gliadina nel caso del sensore. Infine i sistemi analitici sono stati validati analizzando sia materie prime (farine) che alimenti (biscotti, pasta, pane, etc.). L’approccio sviluppato in spettrometria di massa apre la strada alla possibilità di sviluppare un test di screening multiplo per la valutazione della sicurezza di prodotti dichiarati “gluten-free”, mentre ulteriori studi dovranno essere svolti per ricercare condizioni di estrazione compatibili con l’immunosaggio competitivo, per ora applicabile solo all’analisi di farine estratte con etanolo. Terzo capitolo di questa tesi riguarda lo sviluppo di nuovi metodi per la rivelazione di HPV, Chlamydia e Gonorrhoeae in fluidi biologici. Si è scelto un substrato costituito da strips di carta in quanto possono costituire una valida piattaforma di rivelazione, offrendo vantaggi grazie al basso costo, alla possibilità di generare dispositivi portatili e di poter visualizzare il risultato visivamente senza la necessità di strumentazioni. La metodologia sviluppata è molto semplice, non prevede l’uso di strumentazione complessa e si basa sull’uso della isothermal rolling-circle amplification per l’amplificazione del target. Inoltre, di fondamentale importanza, è l’utilizzo di nanoparticelle colorate che, essendo state funzionalizzate con una sequenza di DNA complementare al target amplificato derivante dalla RCA, ne permettono la rivelazione a occhio nudo mediante l’uso di filtri di carta. Queste strips sono state testate su campioni reali permettendo una discriminazione tra campioni positivi e negativi in tempi rapidi (10-15 minuti), aprendo una nuova via verso nuovi test altamente competitivi con quelli attualmente sul mercato.

Nutraceutical approach to the modulation of cholesterol metabolism: in vitro and in vivo studies

Negli ultimi anni, si sono diffusi nuove strategie per il trattamento delle malattie cardiovascolari, che possano supportare una terapia medica, o in alcuni casi, sostituirla. Infatti, l’abbandono delle terapie è il più importante problema di salute pubblica del mondo occidentale, soprattutto per le malattie croniche. Ciò è dovuto alla complessità delle terapie farmacologiche e ai numerosi e in alcuni casi gravi effetti collaterali dei farmaci somministrati. Di conseguenza, una riduzione di questi effetti migliorerebbe le condizioni di vita del paziente e quindi diminuirebbe il rischio di abbandono della terapia. Per ottenere ciò, è possibile affiancare al trattamento farmacologico una terapia nutraceutica, consistente nella somministrazione di complessi molecolari o microorganismi, provenienti da piante, latte o cibi funzionali. Lo scopo generale di questo studio è indagare le attività ipolipidemizzanti di un composto nutraceutico e di un ceppo batterio specifico nel modello animale che presenta elevati alti livelli plasmatici di colesterolo. Inoltre, sono stati analizzati gli effetti del trattamento nutraceutico sui meccanismi fisiologici che contrastano la creazione della placca aterosclerotica come l’efflusso di colesterolo dalle “foam cells” presenti nell’ateroma, o la riduzione dell’assorbimento intestinale di colesterolo. La presente tesi è divisa in due parti. Nella prima parte, abbiamo analizzato la capacità dei Bifidobacteria di ridurre i livelli di colesterolo nel medium di crescita. Dall’analisi, si è osservato che vari ceppi del genere Bifidobacteria presentano un’ampia capacità di assimilazione del colesterolo all’interno della cellula batterica, in particolare il Bifidobacterium bifidum PRL2010. Le analisi di trascrittomica del Bb PRL2010 incubato in presenza di colesterolo, hanno rivelato un significativo aumento dei livelli di trascrizione di geni codificanti trasportatori e riduttasi, responsabili del meccanismo di accumulo all’interno della cellula batterica e della conversione del colesterolo in coprostanolo. L’attività ipolipidemizzante del Bb PRL2010 è stata poi valutata nel modello murino, mostrando la modificazione del microbiota dei topi trattati dopo somministrazione del batterio in questione. Nella seconda parte del progetto di ricerca, abbiamo indagato sugli effetti di un composto coperto da brevetto, chiamato “Ola”, sull’efflusso di colesterolo di criceti trattati con questo composto nutraceutico. L’efflusso di colesterolo è il primo step del meccanismo fisiologico noto come Trasporto Inverso del Colesterolo, che consente l’eliminazione del colesterolo dalle placche aterosclerotiche, attraverso l’interazione fra le HDL, presenti nella circolazione sanguigna, e specifici trasportatori delle foam cells, come ABCA1/G1 e SR-BI. In seguito, le lipoproteine rilasciano il colesterolo alle cellule epatiche, dove è metabolizzato ed escreto attraverso le feci. Per valutare l’effetto dell’Ola sul profilo lipidico dei criceti, sono state condotte analisi in vitro. I risultati mostrano un aumento dell’efflusso di colesterolo in cellule che esprimono il trasportatore ABCA1, comparato con il gruppo controllo. Questi due studi mostrano come l’approccio nutraceutico può essere un importante modo per contrastare l’aterosclerosi. Come mostrato in letteratura, gli effetti dei composti nutraceutici sull’aterosclerosi e su altre malattie croniche, hanno portato a un ampio uso come supporto alle terapie farmacologiche, ed in alcuni casi hanno rimpiazzato la terapia farmacologica stessa.

Modulation of Sarco/Endoplasmic Reticulum Ca2+-ATPase 2 (SERCA2) function by acetylation following the treatment with histone deacetylase inhibitor suberoylanilide hydroxamic acid (SAHA)

Background: Acetylation and deacetylation at specific lysine (K) residues is mediated by histone acetylases (HATs) and deacetylases (HDACs), respectively. HATs and HDACs act on both histone and non-histone proteins, regulating various processes, including cardiac impulse propagation. Aim of the present work was to establish whether the function of the Ca2+ ATPase SERCA2, one of the major players in Ca2+ reuptake during excitation-contraction coupling in cardiac myocytes (CMs), could be modulated by direct K acetylation. Materials and methods: HL-1 atrial mouse cells (donated by Prof. Claycomb), zebrafish and Streptozotocin-induced diabetic rat CMs were treated with the pan-inhibitor of class I and II HDACs suberanilohydroxamic acid (SAHA) for 1.5 hour. Evaluation of SERCA2 acetylation was analyzed by co-immunoprecipitation. SERCA2 activity was measured on microsomes by pyruvate/NADH coupled reaction assay. SERCA2 mutants were obtained after cloning wild-type and mutated sequences into the pCDNA3 vector and transfected into HEK cells. Ca2+ transients in CMs (loading with Fluo3-AM, field stimulation, 0.5 Hz) and in transfected HEK cells (loading with FLUO-4, caffeine pulse) were recorded. Results: Co-Immunoprecipitation experiments performed on HL-1 cells demonstrated a significant increase in the acetylation of SERCA2 after SAHA-treatment (2.5 µM, n=3). This was associated with an increase in SERCA2 activity in microsomes obtained from HL-1 cells, after SAHA exposure (n=5). Accordingly, SAHA-treatment significantly shortened the Ca2+ reuptake time of adult zebrafish CMs. Further, SAHA 2.5 nM restored to control values the recovery time of Ca2+ transients decay in diabetic rat CMs. HDAC inhibition also improved contraction parameters, such as fraction of shortening, and increased pump activity in microsomes isolated from diabetic CMs (n=4). Notably, the K464, identified by bioinformatic tools as the most probable acetylation site on human SERCA2a, was mutated into Glutamine (Q) or Arginine (R) mimicking acetylation and deacetylation respectively. Measurements of Ca2+ transients in HEK cells revealed that the substitution of K464 with R significantly delayed the transient recovery time, thus indicating that deacetylation has a negative impact on SERCA2 function. Conclusions: Our results indicate that SERCA2 function can be improved by pro-acetylation interventions and that this mechanism of regulation is conserved among species. Therefore, the present work provides the basis to open the search for novel pharmacological tools able to specifically improve SERCA2 activity in diseases where its expression and/or function is impaired, such as diabetic cardiomyopathy.

La riproduzione nei rettili: nuove prospettive e sviluppi futuri

L’allevamento in cattività dei rettili è in costante crescita negli ultimi anni e richiede conoscenze mediche sempre più specialistiche per far fronte ai numerosi problemi legati a questi animali. Il corretto approccio medico prevede una profonda conoscenza delle specie prese in esame dal momento che la maggior parte delle problematiche riproduttive di questi animali sono legate ad una non corretta gestione dei riproduttori. L’apparato riproduttore dei rettili è estremamente vario a seconda delle specie prese in considerazione. Sauri ed ofidi possiedono due organi copulatori denominati emipeni e posizionati alla base della coda caudalmente alla cloaca che vengono estroflessi alternativamente durante l’accoppiamento per veicolare lo spera all’interno della cloaca della femmina. In questi animali il segmento posteriore renale è chiamato segmento sessuale, perché contribuisce alla formazione del fluido seminale. Tale porzione, durante la stagione dell’accoppiamento, diventa più voluminosa e cambia drasticamente colore, tanto che può essere confusa con una manifestazione patologica. I cheloni al contrario possiedono un unico pene che non viene coinvolto nella minzione. In questi animali. I testicoli sono due e sono situati all’interno della cavità celomatica in posizione cranioventrale rispetto ai reni. I testicoli possono variare notevolmente sia come forma che come dimensione a seconda del periodo dell’anno. Il ciclo estrale dei rettili è regolato, come pure nei mammiferi, dagli ormoni steroidei. La variazione di questi ormoni a livello ematico è stata studiato da diversi autori con il risultato di aver dimostrato come la variazione dei dosaggi degli stessi determini l’alternanza delle varie fasi del ciclo riproduttivo. La relazione tra presenza di uova (anche placentari) ed alti livelli di progesterone suggerisce che questo ormone gioca un ruolo importante nelle riproduzione delle specie ovipare per esempio stimolando la vascolarizzazione degli ovidutti durante i tre mesi in cui si ha lo sviluppo delle uova. Il 17-beta estradiolo è stato descritto come un ormone vitellogenico grazie alla sua capacità di promuovere lo sviluppo dei follicoli e la formazione di strati protettivi dell’uovo. L’aumento del livello di estradiolo osservato esclusivamente nelle femmine in fase vitellogenica è direttamente responsabile della mobilizzazione delle riserve materne in questa fase del ciclo. Va sottolineato come il progesterone sia in effetti un antagonista dell’estradiolo, riducendo la vitellogenesi e intensificando gli scambi materno fetali a livello di ovidutto. Le prostaglandine (PG) costituiscono un gruppo di molecole di origine lipidica biologicamente attive, sintetizzate sotto varie forme chimiche. Sono noti numerosi gruppi di prostaglandine ed è risputo che pesci, anfibi, rettili e mammiferi sintetizzano una o più prostaglandine partendo da acidi grassi precursori. Queste sostanze anche nei rettili agiscono sulla mucosa dell’utero aumentandone le contrazioni e sui corpi lutei determinandone la lisi. La maturità sessuale dei rettili, dipende principalmente dalla taglia piuttosto che dall’età effettiva dell’animale. In cattività, l’alimentazione e le cure dell’allevatore, possono giocare un ruolo fondamentale nel raggiungimento della taglia necessaria all’animale per maturare sessualmente. Spesso, un animale d’allevamento raggiunge prima la maturità sessuale rispetto ai suoi simili in natura. La maggior parte dei rettili sono ovipari, ovvero depongono uova con guscio sulla sabbia o in nidi creati appositamente. La condizione di ovoviviparità è riscontrabile in alcuni rettili. Le uova, in questo caso, vengono ritenute all’interno del corpo, fino alla nascita della progenie. Questa può essere considerata una strategia evolutiva di alcuni animali, che in condizioni climatiche favorevoli effettuano l’ovo deposizione, ma se il clima non lo permette, ritengono le uova fino alla nascita della prole. Alcuni serpenti e lucertole sono vivipari, ciò significa che l’embrione si sviluppa all’interno del corpo dell’animale e che è presente una placenta. I piccoli fuoriescono dal corpo dell’animale vivi e reattivi. La partenogenesi è una modalità di riproduzione asessuata, in cui si ha lo sviluppo dell’uovo senza che sia avvenuta la fecondazione. Trenta specie di lucertole e alcuni serpenti possono riprodursi con questo metodo. Cnemidophorus uniparens, C. velox e C. teselatus alternano la partenogenesi a una riproduzione sessuata, a seconda della disponibilità del maschio. La maggior parte dei rettili non mostra alcuna cura materna per le uova o per i piccoli che vengono abbandonati al momento della nascita. Esistono tuttavia eccezioni a questa regola generale infatti alcune specie di pitoni covano le uova fino al momento della schiusa proteggendole dai predatori e garantendo la giusta temperatura e umidità. Comportamenti di guardia al nido sono poi stati documentati in numerosi rettili, sia cheloni che sauri che ofidi. Nella maggior parte delle tartarughe, la riproduzione è legata alla stagione. Condizioni favorevoli, possono essere la stagione primaverile nelle zone temperate o la stagione umida nelle aree tropicali. In cattività, per riprodurre queste condizioni, è necessario fornire, dopo un periodo di ibernazione, un aumento del fotoperiodo e della temperatura. L’ atteggiamento del maschio durante il corteggiamento è di notevole aggressività, sia nei confronti degli altri maschi, con i quali combatte copiosamente, colpendoli con la corazza e cercando di rovesciare sul dorso l’avversario, sia nei confronti della femmina. Infatti prima della copulazione, il maschio insegue la femmina, la sperona, la morde alla testa e alle zampe e infine la immobilizza contro un ostacolo. Il comportamento durante la gravidanza è facilmente riconoscibile. La femmina tende ad essere molto agitata, è aggressiva nei confronti delle altre femmine e inizia a scavare buche due settimane prima della deposizione. La femmina gravida costruisce il nido in diverse ore. Scava, con gli arti anteriori, buche nel terreno e vi depone le uova, ricoprendole di terriccio e foglie con gli arti posteriori. A volte, le tartarughe possono trattenere le uova, arrestando lo sviluppo embrionale della prole per anni quando non trovano le condizioni adatte a nidificare. Lo sperma, inoltre, può essere immagazzinato nell’ovidotto fino a sei anni, quindi la deposizione di uova fertilizzate può verificarsi senza che sia avvenuto l’accoppiamento durante quel ciclo riproduttivo. I comportamenti riproduttivi di tutte le specie di lucertole dipendono principalmente dalla variazione stagionale, correlata al cambiamento di temperatura e del fotoperiodo. Per questo, se si vuole far riprodurre questi animali in cattività, è necessario valutare per ogni specie una temperatura e un’illuminazione adeguata. Durante il periodo riproduttivo, un atteggiamento caratteristico di diverse specie di lucertole è quello di riprodurre particolari danze e movimenti ritmici della testa. In alcune specie, possiamo notare il gesto di estendere e retrarre il gozzo per mettere in evidenza la sua brillante colorazione e richiamare l’attenzione della femmina. L’aggressività dei maschi, durante la stagione dell’accoppiamento, è molto evidente, in alcuni casi però, anche le femmine tendono ad essere aggressive nei confronti delle altre femmine, specialmente durante l’ovo deposizione. La fertilizzazione è interna e durante la copulazione, gli spermatozoi sono depositati nella porzione anteriore della cloaca femminile, si spostano successivamente verso l’alto, dirigendosi nell’ovidotto, in circa 24-48 ore; qui, fertilizzano le uova che sono rilasciate nell’ovidotto dall’ovario. Negli ofidi il corteggiamento è molto importante e i comportamenti durante questa fase possono essere diversi da specie a specie. I feromoni specie specifici giocano un ruolo fondamentale nell’attrazione del partner, in particolar modo in colubridi e crotalidi. La femmina di queste specie emette una traccia odorifera, percepita e seguita dal maschio. Prima dell’accoppiamento, inoltre, il maschio si avvicina alla femmina e con la sua lingua bifida o con il mento, ne percorre tutto il corpo per captare i feromoni. Dopo tale comportamento, avviene la copulazione vera e propria con la apposizione delle cloache; gli emipeni vengono utilizzati alternativamente e volontariamente dal maschio. Durante l’ovulazione, il serpente aumenterà di volume nella sua metà posteriore e contrazioni muscolari favoriranno lo spostamento delle uova negli ovidotti. In generale, se l’animale è oviparo, avverrà una muta precedente alla ovo deposizione, che avviene prevalentemente di notte. Gli spermatozoi dei rettili sono morfologicamente simili a quelli di forme superiori di invertebrati. La fecondazione delle uova, da parte di spermatozoi immagazzinati nel tratto riproduttivo femminile, è solitamente possibile anche dopo mesi o perfino anni dall’accoppiamento. La ritenzione dei gameti maschili vitali è detta amphigonia retardata e si ritiene che questa caratteristica offra molti benefici per la sopravvivenza delle specie essendo un adattamento molto utile alle condizioni ambientali quando c’è una relativa scarsità di maschi conspecifici disponibili. Nell’allevamento dei rettili in cattività un accurato monitoraggio dei riproduttori presenta una duplice importanza. Permette di sopperire ad eventuali errori di management nel caso di mancata fertilizzazione e inoltre permette di capire quale sia il grado di sviluppo del prodotto del concepimento e quindi di stabilire quale sia il giorno previsto per la deposizione. Le moderne tecniche di monitoraggio e l’esperienza acquisita in questi ultimi anni permettono inoltre di valutare in modo preciso lo sviluppo follicolare e quindi di stabilire quale sia il periodo migliore per l’accoppiamento. Il dimorfismo sessuale nei serpenti è raro e anche quando presente è poco evidente. Solitamente nei maschi, la coda risulta essere più larga rispetto a quella della femmina in quanto nel segmento post-cloacale vi sono alloggiati gli emipeni. Il maschio inoltre, è generalmente più piccolo della femmina a parità di età. Molti cheloni sono sessualmente dimorfici sebbene i caratteri sessuali secondari siano poco apprezzabili nei soggetti giovani e diventino più evidenti dopo la pubertà. In alcune specie si deve aspettare per più di 10 anni prima che il dimorfismo sia evidente. Le tartarughe di sesso maschile tendono ad avere un pene di grosse dimensioni che può essere estroflesso in caso di situazioni particolarmente stressanti. I maschi sessualmente maturi di molte specie di tartarughe inoltre tendono ad avere una coda più lunga e più spessa rispetto alle femmine di pari dimensioni e la distanza tra il margine caudale del piastrone e l’apertura cloacale è maggiore rispetto alle femmine. Sebbene la determinazione del sesso sia spesso difficile nei soggetti giovani molti sauri adulti hanno dimorfismo sessuale evidente. Nonostante tutto comunque anche tra i sauri esistono molte specie come per esempio Tiliqua scincoides, Tiliqua intermedia, Gerrhosaurus major e Pogona vitticeps che anche in età adulta non mostrano alcun carattere sessuale secondario evidente rendendone molto difficile il riconoscimento del sesso. Per garantire un riconoscimento del sesso degli animali sono state messe a punto diverse tecniche di sessaggio che variano a seconda della specie presa in esame. L’eversione manuale degli emipeni è la più comune metodica utilizzata per il sessaggio dei giovani ofidi ed in particolare dei colubridi. I limiti di questa tecnica sono legati al fatto che può essere considerata attendibile al 100% solo nel caso di maschi riconosciuti positivi. L’eversione idrostatica degli emipeni esattamente come l’eversione manuale degli emipeni si basa sull’estroflessione di questi organi dalla base della coda, pertanto può essere utilizzata solo negli ofidi e in alcuni sauri. La procedura prevede l’iniezione di fluido sterile (preferibilmente soluzione salina isotonica) nella coda caudalmente all’eventuale posizione degli emipeni. Questa tecnica deve essere eseguita solo in casi eccezionali in quanto non è scevra da rischi. L’utilizzo di sonde cloacali è il principale metodo di sessaggio per gli ofidi adulti e per i sauri di grosse dimensioni. Per questa metodica si utilizzano sonde metalliche dello spessore adeguato al paziente e con punta smussa. Nei soggetti di genere maschile la sonda penetra agevolmente al contrario di quello che accade nelle femmine. Anche gli esami radiografici possono rendersi utili per il sessaggio di alcune specie di Varani (Varanus achanturus, V. komodoensis, V. olivaceus, V. gouldi, V. salvadorii ecc.) in quanto questi animali possiedono zone di mineralizzazione dei tessuti molli (“hemibacula”) che possono essere facilmente individuate nei maschi. Diversi studi riportano come il rapporto tra estradiolo e androgeni nel plasma o nel liquido amniotico sia un possibile metodo per identificare il genere sessuale delle tartarughe. Per effettuare il dosaggio ormonale, è necessario prelevare un campione di sangue di almeno 1 ml ad animale aspetto che rende praticamente impossibile utilizzare questo metodo di sessaggio nelle tartarughe molto piccole e nei neonati. L’ecografia, volta al ritrovamento degli emipeni, sembra essere un metodo molto preciso, per la determinazione del sesso nei serpenti. Uno studio compiuto presso il dipartimento di Scienze Medico Veterinarie dell’Università di Parma, ha dimostrato come questo metodo abbia una sensibilità, una specificità e un valore predittivo positivo e negativo pari al 100%. La radiografia con mezzo di contrasto e la tomografia computerizzata possono essere utilizzate nel sessaggio dei sauri, con buoni risultati. Uno studio, compiuto dal dipartimento di Scienze Medico Veterinarie, dell’Università di Parma, ha voluto mettere a confronto diverse tecniche di sessaggio nei sauri, tra cui l’ecografia, la radiografia con e senza mezzo di contrasto e la tomografia computerizzata con e senza mezzo di contrasto. I risultati ottenuti, hanno dimostrato come l’ecografia non sia il mezzo più affidabile per il riconoscimento degli emipeni e quindi del sesso dell’animale, mentre la radiografia e la tomografia computerizza con mezzo di contrasto siano tecniche affidabili e accurate in queste specie. Un metodo valido e facilmente realizzabile per il sessaggio dei cheloni anche prepuberi è la cistoscopia. In un recente studio la cistoscopia è stata effettuata su quindici cheloni deceduti e venticinque cheloni vivi, anestetizzati. In generale, questo metodo si è dimostrato non invasivo per le tartarughe, facilmente ripetibile in diversi tipi di tartarughe e di breve durata. Tra le principali patologie riproduttive dei rettili le distocie sono sicuramente quelle che presentano una maggior frequenza. Quando si parla di distocia nei rettili, si intendono tutte quelle situazioni in cui si ha una mancata espulsione e deposizione del prodotto del concepimento entro tempi fisiologici. Questa patologia è complessa e può dipendere da diverse cause. Inoltre può sfociare in malattie sistemiche a volte molto severe. Le distocie possono essere classificate in ostruttive e non ostruttive in base alle cause. Si parla di distocia ostruttiva quando si verificano delle condizioni per cui viene impedito il corretto passaggio delle uova lungo il tratto riproduttivo (Fig.13). Le cause possono dipendere dalla madre o dalle caratteristiche delle uova. Nel caso di distocia non ostruttiva le uova rinvenute sono solitamente di dimensioni normali e la conformazione anatomica della madre è fisiologica. L’eziologia è da ricercare in difetti comportamentali, ambientali e patologici. Non esistono sintomi specifici e patognomonici di distocia. La malattia diviene evidente e conclamata solamente in presenza di complicazioni. Gli approcci terapeutici possibili sono vari a seconda della specie animale e della situazione. Fornire un’area adeguata per la nidiata: se la distocia non è ostruttiva si può cercare di incoraggiare l’animale a deporre autonomamente le uova creando un idoneo luogo di deposizione. Il trattamento medico prevede la stimolazione della deposizione delle uova ritenute mediante l’induzione con ossitocina. L’ossitocina viene somministrata alle dosi di 1/3 UI/kg per via intramuscolare. Uno studio condotto presso l’Università veterinaria di Parma ha comparato le somministrazioni di ossitocina per via intramuscolare e per via intravenosa, confrontando le tempistiche con le quali incominciano le contrazioni e avviene la completa ovodeposizione e dimostrando come per via intravenosa sia possibile somministrare dosi più basse rispetto a quelle riportate solitamente in letteratura ottenendo comunque un ottimo risultato. Nel caso in cui il trattamento farmacologico dovesse fallire o non fosse attuabile, oppure in casi di distocia ostruttiva è possibile ricorrere alla chirurgia. Per stasi follicolare si intende la incapacità di produrre sufficiente quantità di progesterone da corpi lutei perfettamente funzionanti. Come per la distocia, l’eziologia della stasi follicolare è variegata e molto ampia: le cause possono essere sia ambientali che patologiche. La diagnosi clinica viene fatta essenzialmente per esclusione. Come per la distocia, anche in questo caso l’anamnesi e la raccolta del maggior quantitativo di informazioni è fondamentale per indirizzarsi verso il riconoscimento della patologia. Per prolasso si intende la fuoriuscita di un organo attraverso un orifizio del corpo. Nei rettili, diversi organi possono prolassare attraverso la cloaca: la porzione terminale dell’apparato gastroenterico, la vescica urinaria, il pene nel maschio (cheloni) e gli ovidutti nella femmina. In sauri e ofidi gli emipeni possono prolassare dalle rispettive tasche in seguito ad eccesiva attività sessuale97. La corretta identificazione del viscere prolassato è estremamente importante e deve essere effettuata prima di decidere qualsiasi tipologia di trattamento ed intervento. Nei casi acuti e non complicati è possibile la riduzione manuale dell’organo, dopo un accurato lavaggio e attenta pulizia. Se questo non dovesse essere possibile, l’utilizzo di lubrificanti e pomate antibiotiche garantisce all’organo una protezione efficiente. Nel caso in cui non si sia potuto intervenire celermente e l’organo sia andato incontro a infezione e congestione venosa prolungata con conseguente necrosi, l’unica soluzione è l’amputazione

Le imprese uscite dal mercato nel corso della crisi

Questo lavoro analizza le imprese italiane uscite dal mercato tra il 2008 e il 2012 a seguito di una procedura fallimentare o di una liquidazione volontaria e individua le principali caratteristiche aziendali correlate a tale fenomeno. L’analisi econometrica condotta sui bilanci delle società di capitali indica che la probabilità di cessazione dell’attività produttiva è stata maggiore per le aziende più piccole e per quelle di più recente costituzione. A parità di altre caratteristiche delle imprese, come la dimensione, il settore produttivo o l’area in cui esse sono localizzate, l’apertura di una procedura fallimentare è risultata maggiormente correlata a squilibri nella struttura finanziaria, come un elevato leverage, mentre la probabilità di liquidazione è stata influenzata in misura superiore dai bassi livelli di redditività.

Ação popular e ação de improbidade administrativa na justiça do trabalho

O presente estudo é resultado da observação de que, em que pese o incremento do ajuizamento de ações coletivas na Justiça do Trabalho, por meio de ações civis públicas, ainda há outras ações coletivas, destinadas à defesa de direitos metaindividuais, que não vêm recebendo o mesmo tratamento. Em especial, as ações cuja pretensão é a tutela dos atos da Administração Pública, que, no contexto do Estado Democrático de Direito, deve conduzir-se em prol do bem comum e, ainda, da garantia dos direitos sociais reconhecidos constitucionalmente. Analisa-se o cabimento dessa tutela pela via do Judiciário Trabalhista, nas situações em que os fatos constantes nas causas de pedir das respectivas ações sejam atinentes a direitos relacionados ao trabalho. Isso porque, na ocorrência de pontos de interseção entre o ato administrativo e as relações de trabalho, o ramo do Judiciário constitucionalmente vocacionado a analisá-los é o Trabalhista, já que o interesse em questão não configura mero ato administrativo, mas, além disso, revela o modo como o agente estatal compreende e orienta a sua conduta, gerando a valorização ou a desvalorização de direitos trabalhistas consagrados pela Constituição Federal. Com base nesse panorama acerca do papel do Estado brasileiro contemporâneo no que diz respeito à garantia de direitos sociais e do papel do Poder Judiciário no que tange à efetivação desses direitos, bem como procedendo ao exame da natureza desses direitos, que requerem novas posturas dos operadores do direito, este trabalho se propõe a afastar concepções antigas relacionadas a argumentos de suposta violação à separação de poderes e de indevida interferência em políticas públicas. Com isso, considerando que o Poder Judiciário tem no processo seu locus de manifestação, abordam-se as principais características do processo coletivo, visando à sua diferenciação em relação ao processo individual, em face da natureza dos direitos que compõem o seu objeto. Com o foco no fortalecimento do Judiciário Trabalhista e aperfeiçoamento do Estado Democrático de Direito, ingressa-se na seara das ações populares e de improbidade administrativa, refinando-se a aplicabilidade delas a atos praticados pela Administração Pública que repercutem na esfera trabalhista. Adota-se como premissa a nova conformação dos limites da competência da Justiça do Trabalho que não mais se restringe a lides de natureza individual ou coletiva entre trabalhadores e seus tomadores de serviço, conformação essa introduzida pela Emenda Constitucional no 45/2004 para defender-se que a consecução do bem comum, levada a efeito com a observância aos princípios regentes da Administração, desafia uma nova visão, especializada no valor social do trabalho, inclusive no que se refere à qualidade dos serviços públicos. As questões apontadas possibilitam concluir sobre a necessidade de se instituir concretamente os conteúdos axiológicos e não meramente patrimoniais que compõem o patrimônio público social, em especial o valor social do trabalho, preservando-o ou restituindo-o à coletividade, por meio de ações populares e de improbidade administrativa ajuizadas perante a Justiça do Trabalho. A pesquisa mostra que se alarga a garantia ao cidadão no que tange ao uso dos valores e recursos públicos para a promoção do bem comum e a evolução da coletividade.

Evaluation of pronoun resolution algorithm for Spanish dialogues

In this paper, we present an algorithm for anaphora resolution in Spanish dialogues and an evaluation of the algorithm for pronominal anaphora. The proposed algorithm uses both linguistic information and the structure of the dialogue to find the antecedent of the anaphors. The system has been evaluated on ten dialogues.

Rilievi cinematici continui condotti con sensori a basso costo

Nel qui presente elaborato vengono descritte le principali caratteristiche del sistema di posizionamento GPS e le tecniche di rilievo. Particolare attenzione viene posta al rilievo cinematico continuo con sensori a basso costo (Ublox EVK 7P). Inotre verra descritta nel dettaglio la strumentazione atta ad acquisire il segnale, e la relativa preparazione. In particolare i dati acquisiti dalla strumentazione verranno elaborati con appositi software, dai quali si otterranno diverse soluzioni. Di seguito sara presente anche la procedura di elaborazione dei dati registrati. In fine le soluzioni ottenute saranno oggetto di confronto.

Impiego del GPS in altimetria su corte distanze

Il GPS è un sistema che consente d’individuare la posizione di un qualsiasi punto sulla superficie terrestre, dal quale sia possibile ricevere i segnali da almeno quattro satelliti. È costituito da un sistema di satelliti in orbita, i quali trasmettono informazioni a dei ricevitori GPS sulla Terra. Questi dati raccolti riguardano coordinate geografiche ed orari, che vengono successivamente elaborate dal ricevitore stesso. In campo topografico possono essere adottate diverse modalità operativo, soprattutto: il metodo statico e statico rapido, mentre per il rilievo di dettaglio è principalmente utilizzato il metodo cinematico. Il GPS può essere utilizzato per rilievi sia in planimetria che in altimetria. In questa tesi si è deciso di valutare principalmente l’utilizzo del GPS in altimetria in modalità statica. Per fare ciò, si è eseguito un confronto su corte distanze tra le misurazioni altimetriche, in una prima fase eseguite con strumentazione topografica classica e successivamente con il sistema GPS. Il sito scelto per effettuare questa valutazione è stato il terrazzo di copertura dell’edificio della Scuola di Ingegneria di Bologna, sul quale sono presenti due antenne di riferimento (SLITTA e UNBO) con ricevitori GPS, che hanno consentito la realizzazione di una baseline di test. Essendo molto corta la distanza tra le due antenne, si può quindi parlare di short-baselines. Il sistema GPS fornisce dati con una precisione che risente in modo molto minore, rispetto alle tecniche topografiche classiche, della propagazione della varianza all’aumentare della distanza, ma al tempo stesso non consente di raggiungere precisioni millimetriche anche su brevissime distanze. Verranno descritte le due metodologie di rilievo e i risultati ottenuti da ognuna. Si procederà in seguito con l’analisi e la rielaborazione di questi dati tramite software e solo in fine verrà eseguito il confronto, atto a verificare la precisione del GPS rispetto alla strumentazione topografica.

Troubleshooting di un impianto di disidratazione di gas naturale: un caso di studio

Il principale componente non idrocarburico contenuto nel gas naturale è l’acqua che viene rimossa mediante assorbimento con glicole trietilenico, il processo di trattamento più comune nella produzione di gas naturale. La presenza di acqua libera nel gas deve essere rimossa totalmente, per evitare la formazione di condensa nelle condizioni di trasporto e di distribuzione più critiche cioè a pressione elevata e a bassa temperatura. Obiettivo di questa tesi è l’analisi delle cause e dei fenomeni che portano a rilevanti perdite di glicole (TEG) in impianti di disidratazione del gas naturale operanti con elevate concentrazioni di CO2 e H2S nel gas di processo. Le perdite, in relazione alle diverse condizioni operative e concentrazioni dei gas menzionati, possono arrivare a raggiungere valori pari a 3-4 volte l'entità attesa, con punte che raggiungono 10 volte tali valori. Il lavoro di tesi è stato focalizzato su un impianto attualmente in esercizio, situato in Arabia Saudita. L’attività è stata condotta presso la Comart di Ravenna, azienda specializzata nella progettazione di impianti nel settore Oil&Gas. Inizialmente sono state studiate le caratteristiche di un impianto di disidratazione di gas naturale mediante assorbimento con glicole trietilenico. Dopo l’analisi delle possibili fonti di perdita, la colonna di alimentazione del ribollitore (Still Column) e il relativo condensatore, sulla base dei dati operativi degli impianti, sembra essere il punto su cui si concentrano le perdite. Vengono presentati i dettagli costruttivi di tale colonna al fine di determinarne i possibili malfunzionamenti. Scopo della tesi sarà l'identificazione, partendo dall'attuale configurazione dell’impianto, delle cause che portano a tali valori di perdite e l'individuazione di una configurazione colonna/condensatore (con eventuali altri equipment necessari) in grado di minimizzare le perdite contenendo al minimo i costi aggiuntivi della soluzione.

Valutazione sperimentale degli effetti della pressione d'iniezione dell'AdBlue sull'efficienza di abbattimento degli NOx nei sistemi SCR

In questo lavoro vengono indagati i benefici dell’aumento della pressione d’iniezione dell’AdBlue nei sistemi SCR. Dopo aver esposto le ipotesi teoriche a supporto della tesi, si passa all’allestimento del veicolo dimostrativo impiegato per l’attività sperimentale. In questa fase viene illustrato tutto il processo di preparazione, che comprende: la messa a punto del circuito idraulico, la caratterizzazione degli iniettori impiegati, la strumentazione della linea di scarico, e il software INCA impiegato per il comando delle centraline. Dopodiché vengono descritti nel dettaglio i test, condotti con il veicolo sperimentale, sul banco a rulli. Attraverso le prove, eseguite su due differenti punti motore, si è potuto dimostrare l’effettivo aumento di efficienza di abbattimento degli NOx, da parte del sistema SCR, all’aumentare della pressione d’iniezione dell’AdBlue. Inoltre si hanno effetti positivi anche in merito al fenomeno dell’ammonia slip, che viene sensibilmente ridotto ai livelli di pressione più alti.

Trattamenti a base di biossido di titanio per gli intonaci nel restauro: prestazioni e durabilità

In questa attività di tesi si indaga l’applicazione del biossido di titanio e delle sue proprietà fotocatalitiche su intonaci nell’architettura storica. Per questo motivo sono state studiate tre diverse tipologie di intonaci, a base di calce idraulica naturale, frequentemente usati per le facciate dell’architettura storica: intonaco di cocciopesto, intonaco di finitura e intonaco di finitura colorato. Inoltre per ogni tipologia di supporto sono stati indagati quattro diversi trattamenti: il solo biossido di titanio, la tinta, la tinta con biossido di titanio e il silicato di etile con TiO2.Nello specifico, l’attività di tesi si è concentrata sullo studio del trattamento a base di biossido di titanio in termini di prestazioni e durabilità. Per fare questo sono state condotte delle prove diagnostiche, quali l’assorbimento capillare, la permeabilità, la valutazione dell’angolo di contatto, la decolorazione con il blu di metilene. Viene condotta, inoltre, un’analisi qualitativa della variazione cromatica generata, sul substrato, dal trattamento. Il trattamento di TiO2, applicato a spray, risulta essere compatibile con tutti i supporti indagati, sia per la variazione cromatica, sia per la permeabilità al vapore che per l’assorbimento capillare. Per quel che concerne l’efficacia, è stato dimostrato come essa risulti particolarmente influenzata dalle proprietà del substrato.

Sanificazione delle acque di approvvigionamento in PVS Caso di studio: Sori-Kenya

L’elaborato è nato dall’interesse verso un progetto di un impianto di sanificazione delle acque in corso di realizzazione in Kenya. Valutando le differenti realtà di tale sito rispetto alla nostra quotidianità è nata l’esigenza di approfondire preliminarmente le varie tecnologie di approvvigionamento e sanificazione delle acque, più consone per siti in via di sviluppo. Oltre 2.5 miliardi di persone non hanno accesso ai cosiddetti “improved water supply and sanitation”, le fonti idriche migliorate: acquedotti e fognature pubbliche, eventualmente con collegamenti domestici, sorgenti e serbatoi protetti, cisterne per la raccolta delle acque piovane, ecc. Maggior interesse è stata attribuita alla qualità dell’acqua e ai possibili trattamenti di sanificazione. Impianti semplici, economici ed efficaci alla rimozione totale della carica microbiologica sono sicuramente bisogni di base e componenti essenziali di assistenza sanitaria primaria. Dove è possibile le soluzioni ottimali consigliate sono tecnologie a basso costo che sono facili da progettare, costruire e impiegare, e sono costituite da materiali facilmente disponibili nei luoghi dove si applicano. Nel villaggio di Sori, in Kenya, un impianto di ozonizzazione delle acque del Lago Vittoria, con un precedente trattamento di sedimentazione e filtrazione rende disponibili a 16000 abitanti circa 30 l/ab giorno microbiologicamente sana.

Valutazione del Beta Carba test per il rapido rilevamento di enterobatteri produttori di carbapenemasi (CPE)

L’antibiotico resistenza negli enterobatteri produttori di carbapenemasi (CPE) rappresenta una problematica emergente in sanità pubblica, dato che le opzioni alternative per il trattamento di pazienti infetti sono limitate. L’andamento epidemiologico di CPE a livello globale appare ad oggi molto variegato con differenze significative tra paesi. In Italia la diffusione di K. pneumoniae produttrice di KPC è endemica ed è stimata essere un terzo (32,9%) delle infezioni invasive (sangue e liquor) da K. pneumoniae. Pertanto, diventa indispensabile implementare gli studi di farmaco-resistenza per valutare e ridurre il potenziale di crescita di tali microrganismi. Questo studio presenta come fine la valutazione del Beta Carba test, metodo cromogeno, per il rapido rilevamento di CPE in confronto con il metodo standard di riferimento. Lo studio è stato svolto presso l’U.O. Microbiologia AUSL della Romagna ed è di natura retrospettiva, di tipo esclusivamente qualitativo. Sono stati analizzati 412 campioni completamente anonimizzati: 50 emocolture, 250 urine e 112 tamponi rettali di sorveglianza. La valutazione del test è stata condotta sia direttamente a partire dalle matrici biologiche (emocolture e urinocolture positive) che dalle colonie isolate di CPE da tamponi rettali di sorveglianza, urine o emocolture. I risultati sperimentali ottenuti in vitro con il β Carba, mostrano una totale concordanza con i metodi sia fenotipici che genotipici utilizzati come riferimento: sono state ottenute sensibilità e specificità del 100%. Inoltre, a favore del test si inserisce il parametro fondamentale della rapidità, consentendo quindi una celere rilevazione di CPE direttamente su campioni clinici con un tempo di risposta piuttosto veloce e affidabile pari a 15-30 minuti. In definitiva, grazie alla performance dimostrata in vitro, il test può rappresentare un valido strumento per arginare e limitare lo spreading di CPE, svolgendo un buon ruolo nella gestione dei pazienti infetti.

Rassegna critica sulla produzione di alluminio secondario

Questo elaborato si pone l’obiettivo di analizzare lo sviluppo, le potenzialità e le problematiche dell’alluminio secondario e di confrontarlo con l’alluminio primario cercando di capire se la soluzione del riciclo possa progressivamente sostituire la produzione a partire dal minerale. Attraverso l’analisi dei fronti energetico, logistico, ambientale ed economico si giunge ad un quadro completo che da la possibilità di evidenziare vantaggi e svantaggi di un investimento nell’ industria produttrice di alluminio primario piuttosto che secondario. Mediante la descrizione delle modalità di pre-trattamento e dei processi di raffinazione del rottame vengono messi in luce i campi che necessitano di ulteriore sviluppo. Risulta quindi possibile avere un quadro complessivo delle due tipologie di produzione e capire il perché del progressivo interesse nel rottame.