Modulation of Sarco/Endoplasmic Reticulum Ca2+-ATPase 2 (SERCA2) function by acetylation following the treatment with histone deacetylase inhibitor suberoylanilide hydroxamic acid (SAHA)

Background: Acetylation and deacetylation at specific lysine (K) residues is mediated by histone acetylases (HATs) and deacetylases (HDACs), respectively. HATs and HDACs act on both histone and non-histone proteins, regulating various processes, including cardiac impulse propagation. Aim of the present work was to establish whether the function of the Ca2+ ATPase SERCA2, one of the major players in Ca2+ reuptake during excitation-contraction coupling in cardiac myocytes (CMs), could be modulated by direct K acetylation. Materials and methods: HL-1 atrial mouse cells (donated by Prof. Claycomb), zebrafish and Streptozotocin-induced diabetic rat CMs were treated with the pan-inhibitor of class I and II HDACs suberanilohydroxamic acid (SAHA) for 1.5 hour. Evaluation of SERCA2 acetylation was analyzed by co-immunoprecipitation. SERCA2 activity was measured on microsomes by pyruvate/NADH coupled reaction assay. SERCA2 mutants were obtained after cloning wild-type and mutated sequences into the pCDNA3 vector and transfected into HEK cells. Ca2+ transients in CMs (loading with Fluo3-AM, field stimulation, 0.5 Hz) and in transfected HEK cells (loading with FLUO-4, caffeine pulse) were recorded. Results: Co-Immunoprecipitation experiments performed on HL-1 cells demonstrated a significant increase in the acetylation of SERCA2 after SAHA-treatment (2.5 µM, n=3). This was associated with an increase in SERCA2 activity in microsomes obtained from HL-1 cells, after SAHA exposure (n=5). Accordingly, SAHA-treatment significantly shortened the Ca2+ reuptake time of adult zebrafish CMs. Further, SAHA 2.5 nM restored to control values the recovery time of Ca2+ transients decay in diabetic rat CMs. HDAC inhibition also improved contraction parameters, such as fraction of shortening, and increased pump activity in microsomes isolated from diabetic CMs (n=4). Notably, the K464, identified by bioinformatic tools as the most probable acetylation site on human SERCA2a, was mutated into Glutamine (Q) or Arginine (R) mimicking acetylation and deacetylation respectively. Measurements of Ca2+ transients in HEK cells revealed that the substitution of K464 with R significantly delayed the transient recovery time, thus indicating that deacetylation has a negative impact on SERCA2 function. Conclusions: Our results indicate that SERCA2 function can be improved by pro-acetylation interventions and that this mechanism of regulation is conserved among species. Therefore, the present work provides the basis to open the search for novel pharmacological tools able to specifically improve SERCA2 activity in diseases where its expression and/or function is impaired, such as diabetic cardiomyopathy.

Introduzione: L’acetilazione e la deacetilazione su residui specifici di lisina (K) sono delle modificazioni post-traduzionali mediate da istone acetiltransferasi e deacetilasi (HAT) e (HDAC), rispettivamente. HAT e HDAC agiscono sia su istoni che su proteine non istoniche, regolando diversi processi, tra cui la propagazione dell'impulso cardiaco. Scopo del presente lavoro è stato quello di indagare la funzione della pompa del calcio SERCA2, la componente maggiormente coinvolta durante il recupero del calcio durante l’accoppiamento eccitazione-contrazione nei miociti cardiaci, e la sua modulazione condotta dall’acetilazione. Materiali e metodi: Le HL-1 (cellule cardiache murine, donate dal Prof. Claycomb), i cardiomiociti isolati da zebrafish, ratti e ratti diabetici (diabete indotto da streptozotocina) sono stati trattati con l’inibitore delle HDAC di classe I e II suberoilanilide dell’acido idrossamico (SAHA) per 1,5 ore. Valutazione dell’acetilazione di SERCA2 è stato effettuata mediante co-immunoprecipitazione. L’attività di SERCA2 è stata misurata su microsomi con il saggio accoppiato ATP-NADH. I mutanti di SERCA2 sono stati ottenuti dopo il clonaggio nel vettore pcDNA3 delle sequenze wild-type e mutate e successivamente sono state trasfettae le cellule HEK. I transienti di calcio sono stati misurati in cardiomiociti (caricamento con Fluo3-AM, stimolazione di campo, 0.5 Hz) e in cellule HEK trasfettate (caricamento con FLUO-4, impulso caffeina). Risultati: La co-immunoprecipitazione su cellule HL-1 ha dimostrato un aumento significativo dell’acetilazione di SERCA2 dopo il trattamento con SAHA (2,5 µM, n = 3). Questo è stato associato ad un aumento dell'attività SERCA2 misurata nei microsomi isolati da HL-1, dopo il trattamento con SAHA (n = 5). Inoltre, il SAHA ha ridotto in modo significativo il tempo di recupero del calcio nei cardiomiociti adulti di zebrafish. Il trattamento con SAHA 2.5 nM ha restaurato i valori del tempo necessario al recupero del calcio nei cardiomiociti di ratti diabetici. L’inibizione delle HDAC promossa dal SAHA ha anche migliorato i parametri di contrazione (es. la frazione di accorciamento) e ha aumentato l’attività della pompa nei microsomi isolati da cardiomiociti di ratti diabetici (n = 4). In particolare, il mutante K464 è stato identificato da un’analisi predittiva bioinformatica come il sito di acetilazione più probabile su SERCA2a umana, è stato mutato in glutammina (Q) o Arginina (R) mimando rispettivamente acetilazione e deacetilazione. Misure di transienti di calcio in cellule HEK hanno rivelato che la sostituzione di K464 con R comporta un ritardo significativo del tempo di recupero, indicando così che la deacetilazione ha un impatto negativo sulla funzione di SERCA2. Conclusioni: I nostri risultati indicano che la funzione SERCA2 può essere migliorata con interventi pro-acetilanti e che questo meccanismo di regolazione è conservato tra le specie. Pertanto, il presente lavoro fornisce un punto di partenza per lo sviluppo di nuovi farmaci da poter impiegare nelle malattie in cui la dinamica del calcio è compromessa, come la cardiomiopatia diabetica.