Clinical pharmacogenomic testing of KRAS, BRAF and EGFR mutations by high resolution melting analysis and ultra-deep pyrosequencing

BACKGROUND: Epidermal growth factor receptor (EGFR) and its downstream factors KRAS and BRAF are mutated in several types of cancer, affecting the clinical response to EGFR inhibitors. Mutations in the EGFR kinase domain predict sensitivity to the tyrosine kinase inhibitors gefitinib and erlotinib in lung adenocarcinoma, while activating point mutations in KRAS and BRAF confer resistance to the anti-EGFR monoclonal antibody cetuximab in colorectal cancer. The development of new generation methods for systematic mutation screening of these genes will allow more appropriate therapeutic choices. METHODS: We describe a high resolution melting (HRM) assay for mutation detection in EGFR exons 19-21, KRAS codon 12/13 and BRAF V600 using formalin-fixed paraffin-embedded samples. Somatic variation of KRAS exon 2 was also analysed by massively parallel pyrosequencing of amplicons with the GS Junior 454 platform. RESULTS: We tested 120 routine diagnostic specimens from patients with colorectal or lung cancer. Mutations in KRAS, BRAF and EGFR were observed in 41.9%, 13.0% and 11.1% of the overall samples, respectively, being mutually exclusive. For KRAS, six types of substitutions were detected (17 G12D, 9 G13D, 7 G12C, 2 G12A, 2 G12V, 2 G12S), while V600E accounted for all the BRAF activating mutations. Regarding EGFR, two cases showed exon 19 deletions (delE746-A750 and delE746-T751insA) and another two substitutions in exon 21 (one showed L858R with the resistance mutation T590M in exon 20, and the other had P848L mutation). Consistent with earlier reports, our results show that KRAS and BRAF mutation frequencies in colorectal cancer were 44.3% and 13.0%, respectively, while EGFR mutations were detected in 11.1% of the lung cancer specimens. Ultra-deep amplicon pyrosequencing successfully validated the HRM results and allowed detection and quantitation of KRAS somatic mutations. CONCLUSIONS: HRM is a rapid and sensitive method for moderate-throughput cost-effective screening of oncogene mutations in clinical samples. Rather than Sanger sequence validation, next-generation sequencing technology results in more accurate quantitative results in somatic variation and can be achieved at a higher throughput scale.

Mutation analysis of genes that control the G1/S cell cycle in melanoma: TP53, CDKN1A, CDKN2A, and CDKN2B.

BACKGROUND The role of genes involved in the control of progression from the G1 to the S phase of the cell cycle in melanoma tumors in not fully known. The aim of our study was to analyse mutations in TP53, CDKN1A, CDKN2A, and CDKN2B genes in melanoma tumors and melanoma cell lines METHODS We analysed 39 primary and metastatic melanomas and 9 melanoma cell lines by single-stranded conformational polymorphism (SSCP). RESULTS The single-stranded technique showed heterozygous defects in the TP53 gene in 8 of 39 (20.5%) melanoma tumors: three new single point mutations in intronic sequences (introns 1 and 2) and exon 10, and three new single nucleotide polymorphisms located in introns 1 and 2 (C to T transition at position 11701 in intron 1; C insertion at position 11818 in intron 2; and C insertion at position 11875 in intron 2). One melanoma tumor exhibited two heterozygous alterations in the CDKN2A exon 1 one of which was novel (stop codon, and missense mutation). No defects were found in the remaining genes. CONCLUSION These results suggest that these genes are involved in melanoma tumorigenesis, although they may be not the major targets. Other suppressor genes that may be informative of the mechanism of tumorigenesis in skin melanomas should be studied.

Lack of evidence for KRAS oncogenic mutations in triple-negative breast cancer.

BACKGROUND Mutational analysis of the KRAS gene has recently been established as a complementary in vitro diagnostic tool for the identification of patients with colorectal cancer who will not benefit from anti-epidermal growth factor receptor (EGFR) therapies. Assessment of the mutation status of KRAS might also be of potential relevance in other EGFR-overexpressing tumors, such as those occurring in breast cancer. Although KRAS is mutated in only a minor fraction of breast tumors (5%), about 60% of the basal-like subtype express EGFR and, therefore could be targeted by EGFR inhibitors. We aimed to study the mutation frequency of KRAS in that subtype of breast tumors to provide a molecular basis for the evaluation of anti-EGFR therapies. METHODS Total, genomic DNA was obtained from a group of 35 formalin-fixed paraffin-embedded, triple-negative breast tumor samples. Among these, 77.1% (27/35) were defined as basal-like by immunostaining specific for the established surrogate markers cytokeratin (CK) 5/6 and/or EGFR. KRAS mutational status was determined in the purified DNA samples by Real Time (RT)-PCR using primers specific for the detection of wild-type KRAS or the following seven oncogenic somatic mutations: Gly12Ala, Gly12Asp, Gly12Arg, Gly12Cys, Gly12Ser, Gly12Val and Gly13Asp. RESULTS We found no evidence of KRAS oncogenic mutations in all analyzed tumors. CONCLUSIONS This study indicates that KRAS mutations are very infrequent in triple-negative breast tumors and that EGFR inhibitors may be of potential benefit in the treatment of basal-like breast tumors, which overexpress EGFR in about 60% of all cases.

Cuantificación de hormonas en comprimidos farmacéuticos por espectroscopía NIR: comparación de procedimientos de calibración

Los principales objetivos del presente trabajo son la puesta a punto de un método NIR por reflectancia para la determinación del contenido de los principios activos (API) de un preparado farmacéutico comercial y la comparación del efecto que tiene la forma física sobre la que se registra el espectro de las muestras de calibración sobre la sensibilidad y el camino óptico; polvo o comprimidos. El preparado comercial analizado es el Perifem® y los principios activos determinados son el valerato de estradiol y el acetato de medroxiprogesterona. El método utilizado para la preparación de las muestras de calibración ha sido la sobredosificación con API o con una mezcla de excipientes comprimidos comerciales molturados y como procedimiento de calibración se ha utilizado la Regresión Parcial por Mínimos Cuadrados (PLS). Además, se ha desarrollado un método HPLC para ser utilizado como método de referencia. A partir de los resultados obtenidos se puede concluir que la compactación de las muestras aumenta el camino óptico efectivo y, por tanto, la sensibilidad del método analítico.

Medium access control messaging scheme for cognitive radio networks

Los sistemas de radio cognitivos son una solución a la deficiente distribución del espectro inalámbrico de frecuencias. Usando acceso dinámico al medio, los usuarios secundarios pueden comunicarse en canales de frecuencia disponibles, mientras los usuarios asignados no están usando dichos canales. Un buen sistema de mensajería de control es necesario para que los usuarios secundarios no interfieran con los usuarios primarios en las redes de radio cognitivas. Para redes en donde los usuarios son heterogéneos en frecuencia, es decir, no poseen los mismos canales de frecuencia para comunicarse, el grupo de canales utilizado para transmitir información de control debe elegirse cuidadosamente. Por esta razón, en esta tesis se estudian las ideas básicas de los esquemas de mensajería de control usados en las redes de radio cognitivas y se presenta un esquema adecuado para un control adecuado para usuarios heterogéneos en canales de frecuencia. Para ello, primero se presenta una nueva taxonomía para clasificar las estrategias de mensajería de control, identificando las principales características que debe cumplir un esquema de control para sistemas heterogéneos en frecuencia. Luego, se revisan diversas técnicas matemáticas para escoger el mínimo número de canales por los cuales se transmite la información de control. Después, se introduce un modelo de un esquema de mensajería de control que use el mínimo número de canales y que utilice las características de los sistemas heterogéneos en frecuencia. Por último, se comparan diversos esquemas de mensajería de control en términos de la eficiencia de transmisión.

Functional Characterization of a Novel Frameshift Mutation in the C-terminus of the Nav1.5 Channel Underlying a Brugada Syndrome with Variable Expression in a Spanish Family.

INTRODUCTION We functionally analyzed a frameshift mutation in the SCN5A gene encoding cardiac Na(+) channels (Nav1.5) found in a proband with repeated episodes of ventricular fibrillation who presented bradycardia and paroxysmal atrial fibrillation. Seven relatives also carry the mutation and showed a Brugada syndrome with an incomplete and variable expression. The mutation (p.D1816VfsX7) resulted in a severe truncation (201 residues) of the Nav1.5 C-terminus. METHODS AND RESULTS Wild-type (WT) and mutated Nav1.5 channels together with hNavβ1 were expressed in CHO cells and currents were recorded at room temperature using the whole-cell patch-clamp. Expression of p.D1816VfsX7 alone resulted in a marked reduction (≈90%) in peak Na(+) current density compared with WT channels. Peak current density generated by p.D1816VfsX7+WT was ≈50% of that generated by WT channels. p.D1816VfsX7 positively shifted activation and inactivation curves, leading to a significant reduction of the window current. The mutation accelerated current activation and reactivation kinetics and increased the fraction of channels developing slow inactivation with prolonged depolarizations. However, late INa was not modified by the mutation. p.D1816VfsX7 produced a marked reduction of channel trafficking toward the membrane that was not restored by decreasing incubation temperature during cell culture or by incubation with 300 μM mexiletine and 5 mM 4-phenylbutirate. CONCLUSION Despite a severe truncation of the C-terminus, the resulting mutated channels generate currents, albeit with reduced amplitude and altered biophysical properties, confirming the key role of the C-terminal domain in the expression and function of the cardiac Na(+) channel.

Engineering the thermal emission of macroporous silicon

Todos los cuerpos emiten luz espontaneamente al ser calentados. El espectro de radiacion es una funcion de la temperatura y el material. Sin embargo, la mayoria de los materiales irradia, en general, en una banda espectral amplia. Algunas matereiales, por el contrario, son capaces de concentrar la radiacion termica en una banda espectral mucho mas estrecha. Estos materiales se conocen como emisores selectivos y su uso tiene un profundo impacto en la eficiencia de sistemas sistemas tales como iluminacion y conversion de energia termofotovoltaica. De los emisores selectivos se espera que sean capaces de operar a altas temperaturas y que emitan en una banda espectral muy concisa. Uno de los metodos mas prometedores para controlar y disenar el espectro de emision termico es la utilizacion de cristales fotonicos. Los cristales fotonicos son estructuras periodicas artificiales capaces de controlar y confinar la luz de formas sin precedentes. Sin embargo, la produccion de dichas estructuras con grandes superficies y capaces de soportar altas temperaturas sigue siendo una dificil tarea. Este trabajo esta dedicada al estudio de las propiedades de emision termica de estructuras 3D de silicio macroporoso en el rango espectral mid-IR (2-30 m). En particular, este trabajo se enfoca en reducir la elevada emisividad del silicio cristalino. Las muestras estudiadas en este trabajo tienen una periodicidad de 4 m, lo que limitan los resultados obtenidos a la banda del infrarrojo medio, aunque estructuras mucho mas pequenas son tecnologicamente realizables con el metodo de fabricacion utilizado. Hemos demostrado que el silicio macroporoso 3D puede inhibir completamente la emision termica en su superficie. Mas aun, esta banda se puede ajustar en un amplio margen mediante pequenos cambios durante la formacion de los macroporos. Tambien hemos demostrado que tanto el ancho como la frecuencia de la banda de inhibicion se puede doblar mediante la aplicacion de tecnicas de postprocesado adecuadas. Finalmente hemos mostrado que es posible crear bandas de baja emisividad arbitrariamente anchas mediante estructuras macroporosas aperiodicas.

Locating and extracting the textual content from complex colour images using techniques inspired by human perception

Los sistemas de radio cognitivos son una solución a la deficiente distribución del espectro inalámbrico de frecuencias. Usando acceso dinámico al medio, los usuarios secundarios pueden comunicarse en canales de frecuencia disponibles, mientras los usuarios asignados no están usando dichos canales. Un buen sistema de mensajería de control es necesario para que los usuarios secundarios no interfieran con los usuarios primarios en las redes de radio cognitivas. Para redes en donde los usuarios son heterogéneos en frecuencia, es decir, no poseen los mismos canales de frecuencia para comunicarse, el grupo de canales utilizado para transmitir información de control debe elegirse cuidadosamente. Por esta razón, en esta tesis se estudian las ideas básicas de los esquemas de mensajería de control usados en las redes de radio cognitivas y se presenta un esquema adecuado para un control adecuado para usuarios heterogéneos en canales de frecuencia. Para ello, primero se presenta una nueva taxonomía para clasificar las estrategias de mensajería de control, identificando las principales características que debe cumplir un esquema de control para sistemas heterogéneos en frecuencia. Luego, se revisan diversas técnicas matemáticas para escoger el mínimo número de canales por los cuales se transmite la información de control. Después, se introduce un modelo de un esquema de mensajería de control que use el mínimo número de canales y que utilice las características de los sistemas heterogéneos en frecuencia. Por último, se comparan diversos esquemas de mensajería de control en términos de la eficiencia de transmisión.

Editor interactivo de policubos

Hoy en día existen numerosas técnicas para aplicar texturas sobre objetos 3D genéricos, pero los mecanismos para su creación son, en general, o bien complejos y poco intuitivos para el artista, o bien poco eficientes en aspectos como obtener un texturado global sin costuras. Recientemente, la invención de los policubos ha abierto un nuevo espectro de posibilidades a la hora de realizar estas tareas, e incluso otras como animación y subdivisión, de crucial importancia para industrias como el cine o los videojuegos. Desafortunadamente, no existen herramientas automáticas y editables que permitan generar el modelo de policubos base. Un policubo es una agregación de cubos idénticos de forma que cada cubo tiene como mínimo en común una cara con otro cubo. Con la agrupación de estos cubos se pueden generar diferentes figuras espaciales. El objetivo es desarrollar una herramienta para la creación y edición interactiva de un modelo de policubos a partir de un objeto tridimensional, la cual proporcionara una libertad y control al usuario no existente en las herramientas actualmente disponibles

Estudi del desenvolupament i situació reglamentària de la ràdio cognitiva

Este proyecto estudia la tecnología Radio Cognitiva. El concepto clave de esta tecnología es que permite a usuarios sin licencia compartir el espectro radioeléctrico de forma oportunista con los usuarios con licencia. Para empezar, se analizarán las características principales, su funcionamiento y como coexisten con los usuarios principales. Más adelante, se explicaran los métodos que se usan para la gestión del espectro radioeléctrico y las actividades de estandarización para la implementación de las redes de radio cognitiva. Por último, se analizara la posibilidad de la implementación de esta tecnología en España, analizando las ventajas e inconvenientes de inicializar un mercado secundario del espectro radioeléctrico.

Vulnerabilidade e sofrimento no trabalho do agente comunitário de saúde no Programa de Saúde da Família

A pesquisa, de natureza qualitativa, teve como núcleo de interesse investigativo as representações e as significações que um grupo de Agentes Comunitários de Saúde (ACSs) possui acerca das vulnerabilidades para o sofrimento no trabalho a que estão expostos, assim como as próprias manifestações deste sofrimento ao desempenharem suas ações relativas ao Programa de Saúde da Família (PSF).A entrevista semi-estruturada com um grupo de ACSs, explorou o significado de ser ACS e a percepção da organização do trabalho; a análise foi embasada no referencial teórico-metodológico da hermenêutica e nas teorias relacionadas à psicodinâmica do trabalho. Os achados mostram a existência de uma importante vulnerabilidade ao sofrimento, gerada principalmente pela ideação idealizada da própria prática e pela escassa perspectiva de rearranjo dos ingredientes constitutivos da organização do trabalho, já que este profissional depende de fatores alheios ao seu espectro de alcance, que inclui as limitações do modelo assistencial proposto pelo PSF.

Entrenament en atenció : Treball amb alumnat amb NEE

The purpose of this project was to analyze theattention span of students with mental retardation with Autism Spectrum Disorder (Asperger Syndrome) and with mild intellectual disabilities and behavioral disorders of an USEE class in a secondary school.

Os Estudos Africanos no Desenvolvimento da Biblioteca Norte/Sul (BN/S) do Centro de Estudos Sociais (CES) da Universidade de Coimbra

Esta comunicação pretende constituir uma partilha das dinâmicas de apoio à pesquisa especializada e das interacções desenvolvidas pela Biblioteca Norte/Sul (BN/S) no contexto da criação de um espaço teórico alternativo não limitado às influências culturais ocidentais. A BN/S apoia a missão do Centro de Estudos Sociais (CES) da Faculdade de Economia da Universidade de Coimbra acompanhando o seu planeamento estratégico, tendo também o compromisso de apoiar a investigação dos projectos, dos núcleos e dos programas de doutoramento da instituição, alguns ministrados em parceria com as Faculdades de Direito, de Economia e de Letras. A “clientela” é – na sua grande maioria – investigadores permanentes, investigadores juniores, doutorandos, pós-doutorandos e alunos integrados em parcerias com universidades brasileiras, em particular, e com as universidades angolanas, cabo-verdianas, goesas, guineenses, moçambicanas, entre outras. A BN/S pretende criar um acervo – prioritariamente constituído por monografias e publicações periódicas – resultante da produção científica realizada nos países do hemisfério Sul – na área das ciências sociais e humanas, englobando um amplo espectro de temas. Pretende-se, assim, com esta comunicação partilhar a experiência da BN/S, resultante da necessidade de melhorar sobretudo a qualidade das publicações sobre estudos africanos, adquiridas com o intuito de apoiar o Programa de Doutoramento “Pós-colonialismo e cidadania global” que abrange temas tão diversos como Justiça, Cidadania, Religião, Feitiçaria, Conhecimentos alternativos, Literatura, etc.

L'ús de la cançó per a potenciar el desenvolupament del llenguatge d'un nen autista

L’ús de la cançó per a potenciar el desenvolupament del llenguatge d’un nen autista és un projecte que pretén donar una visió de la música com a eina per al desenvolupament del llenguatge verbal i no verbal dels nens amb diagnòstic de TEA (Trastorn de l’Espectre Autista). Busca també fer una revisió bibliogràfica en aquest camp per conèixer i relacionar una mica més aquests móns sovint desconeguts. Finalment, presenta un programa d’intervenció adreçat específicament a quatre alumnes amb TEA, amb necessitats i objectius diferents, amb el pertinent seguiment, anàlisi de les dades recollides durant la intervenció, conclusions, i noves vies de treball que es podrien dur a terme.

Quadro Nacional de Atribuição de Frequências

O Quadro Nacional de Atribuição de Frequências – QNAF é um documento que apresenta de forma detalhada as subdivisões do espectro radioeléctrico, discriminando para cada faixa de frequências os serviços de radiocomunicações de acordo com as atribuições do Artigo 5º do Regulamento das Radiocomunicações – RR aplicáveis em Cabo Verde.