Der Einfluss der löslichen Spaltprodukte des Amyloid-beta-Vorläuferproteins auf die Proteinhomöostase

Die Alzheimer’sche Erkrankung (AD) ist die am häufigsten vorkommende Form der Demenz. Die Spaltung des APP scheint eine große Rolle in der Pathologie der Erkrankung zu spielen. APP kann auf zwei Wegen prozessiert werden. Dem amyloidogenen Weg, bei dem neben einem löslichen extrazellulären Fragment (sAPPβ) und der APP Intrazellulären Domäne (AICD) auch Aβ entsteht. Auf dem nicht-amyloidogenen Weg entsteht sAPPα, p3 und die AICD. Dem sAPPα werden neuroprotektiv Eigenschaften zugeschrieben. rnEs konnte gezeigt werden, dass sAPPα in jungen IMR90 Zellen, den durch proteasomalen Stress ausgelösten Anstieg der Bag3 und Hsp70 Proteinlevel senkt. Gleichzeitig konnte gezeigt werden, dass sAPPα die Zellviabilität nach proteasomalen Stress erhöht und weniger Aggresomen gebildet werden. Die Analyse der proteasomalen Aktivität zeigte, dass sAPPα die proteasomale Aktivität gestresster junger Zellen erhöhen kann. In alten IMR90 Zellen konnte keine Beeinflussung der Autophagie und der proteasomalen Aktivität festgestellt werden. Das ist ein Anhaltspunkt dafür, dass im Alter das Proteasom zu stark geschädigt ist, um durch sAPPα aktiviert zu werden. Das bei der amyloidogenen Prozessierung von APP entstehende sAPPβ zeigte eine ähnliche protektive Eigenschaft. rnInsgesamt konnte ein protektiver Einfluss von sAPPα und sAPPβ unter proteotoxischen Bedingungen in jungen und klonalen Zellen gezeigt werden, wodurch die Zellviabilität verbessert wird. rn

Detrimental effects of exuberant and restrained immune responses against the central nervous system in the context of multiple sclerosis and glioblastoma multiforme

Glioblastoma multiforme (GBM) is the most common and most aggressive astrocytic tumor of the central nervous system (CNS) in adults. The standard treatment consisting of surgery, followed by a combinatorial radio- and chemotherapy, is only palliative and prolongs patient median survival to 12 to 15 months. The tumor subpopulation of stem cell-like glioma-initiating cells (GICs) shows resistance against radiation as well as chemotherapy, and has been suggested to be responsible for relapses of more aggressive tumors after therapy. The efficacy of immunotherapies, which exploit the immune system to specifically recognize and eliminate malignant cells, is limited due to strong immunosuppressive activities of the GICs and the generation of a specialized protective microenvironment. The molecular mechanisms underlying the therapy resistance of GICs are largely unknown. rnThe first aim of this study was to identify immune evasion mechanisms in GICs triggered by radiation. A model was used in which patient-derived GICs were treated in vitro with fractionated ionizing radiation (2.5 Gy in 7 consecutive passages) to select for a more radio-resistant phenotype. In the model cell line 1080, this selection process resulted in increased proliferative but diminished migratory capacities in comparison to untreated control GICs. Furthermore, radio-selected GICs downregulated various proteins involved in antigen processing and presentation, resulting in decreased expression of MHC class I molecules on the cellular surface and diminished recognition potential by cytotoxic CD8+ T cells. Thus, sub-lethal fractionated radiation can promote immune evasion and hamper the success of adjuvant immunotherapy. Among several immune-associated proteins, interferon-induced transmembrane protein 3 (IFITM3) was found to be upregulated in radio-selected GICs. While high expression of IFITM3 was associated with a worse overall survival of GBM patients (TCGA database) and increased proliferation and migration of differentiated glioma cell lines, a strong contribution of IFITM3 to proliferation in vitro as well as tumor growth and invasiveness in a xenograft model could not be observed. rnMultiple sclerosis (MS) is the most common autoimmune disease of the CNS in young adults of the Western World, which leads to progressive disability in genetically susceptible individuals, possibly triggered by environmental factors. It is assumed that self-reactive, myelin-specific T helper cell 1 (Th1) and Th17 cells, which have escaped the control mechanisms of the immune system, are critical in the pathogenesis of the human disease and its animal model experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). It was observed that in vitro differentiated interleukin 17 (IL-17) producing Th17 cells co-expressed the Th1-phenotypic cytokine Interferon-gamma (IFN-γ) in combination with the two respective lineage-associated transcription factors RORγt and T-bet after re-isolation from the CNS of diseased mice. Pathogenic molecular mechanisms that render a CD4+ T cell encephalitogenic have scarcely been investigated up to date. rnIn the second part of the thesis, whole transcriptional changes occurring in in vitro differentiated Th17 cells in the course of EAE were analyzed. Evaluation of signaling networks revealed an overrepresentation of genes involved in communication between the innate and adaptive immune system and metabolic alterations including cholesterol biosynthesis. The transcription factors Cebpa, Fos, Klf4, Nfatc1 and Spi1, associated with thymocyte development and naïve T cells were upregulated in encephalitogenic CNS-isolated CD4+ T cells, proposing a contribution to T cell plasticity. Correlation of the murine T-cell gene expression dataset to putative MS risk genes, which were selected based on their proximity (± 500 kb; ensembl database, release 75) to the MS risk single nucleotide polymorphisms (SNPs) proposed by the most recent multiple sclerosis GWAS in 2011, revealed that 67.3% of the MS risk genes were differentially expressed in EAE. Expression patterns of Bach2, Il2ra, Irf8, Mertk, Odf3b, Plek, Rgs1, Slc30a7, and Thada were confirmed in independent experiments, suggesting a contribution to T cell pathogenicity. Functional analysis of Nfatc1 revealed that Nfatc1-deficient CD4+ T cells were restrained in their ability to induce clinical signs of EAE. Nfatc1-deficiency allowed proper T cell activation, but diminished their potential to fully differentiate into Th17 cells and to express high amounts of lineage cytokines. As the inducible Nfatc1/αA transcript is distinct from the other family members, it could represent an interesting target for therapeutic intervention in MS.rn

Analyse der T-Zellkreuzreaktivität bei Birkenpollenallergikern mit assoziierter Nahrungsmittelallergie

Eine Pollenallergie geht häufig mit einer sekundären Nahrungsmittelallergie einher, die durch die Kreuzreaktivität zwischen dem Pollen- und dem Nahrungsmittelallergen verursacht wird. In der vorliegenden Arbeit wurde eine Kohorte von 20 Allergikern mit einer Typ I-Allergie gegen Birkenpollen und einer assoziierten Nahrungsmittelallergie gegen Haselnüsse und/oder Karotten in Bezug auf eine allergenspezifische IgE-Antwort, T-Zellantwort und vor allen Dingen hinsichtlich der T-Zellkreuzreaktivität zwischen den rekombinanten Allergenen Bet v 1, Cor a 1 und Dau c 1 charakterisiert. Verwendet wurde hierzu ein Zellkultursystem mit primären CD4+ T-Zellen ohne die Zugabe von exogenem IL-2 oder wiederholten Stimulationen. Zur Analyse der T-Zellkreuzreaktivität kamen zwei unterschiedliche Analyseverfahren zum Einsatz: zum einen der bewährte 3H-Thymidinassay und zum anderen eine neue durchflusszytometrische Methode, die auf der Verwendung von zwei unterschiedlichen Proliferationsfarbstoffen basiert.rnBei der Charakterisierung der T-Zellantwort konnte festgestellt werden, dass eine robuste Th2-Antwort vorliegt, die stark von dem Zytokin IL-5 dominiert wird, begleitet von einer signifikanten Produktion von IL-9 und IL-13, allerdings ohne die Beteiligung von IL-4.rnDes Weiteren konnte zum ersten Mal mit Hilfe eines dosisabhängigen Inhibitions-ELISA eine B-Zellkreuzreaktivität zwischen Bet v 1 und Cor a 1 gezeigt werden, wobei das Cor a 1-reaktive IgE prädominant ist und eine Subpopulation des Bet v 1-reaktiven IgE darstellt.rnMittels 3H-Thymidinassay konnte eine T-Zellkreuzreaktivität zwischen Bet v 1, Cor a 1 und in einem geringeren Maße zu Dau c 1 bei primären T-Zellen von Allergikern gezeigt werden. Ebenso konnte die Kreuzreaktivität zwischen Bet v 1 und Cor a 1 durch die neue durchflusszytometrische Methode bewiesen werden. Zusätzlich ist es mit Hilfe dieser neuen Methode nun möglich, zwischen den einzelnen T-Zellsubpopulationen zu unterscheiden, die sowohl nach primärer und sekundärer oder ausschließlich nach sekundärer Stimulation proliferieren. Es konnte festgestellt werden, dass die kreuzreaktiven T-Zellen aus der T-Zellsubpopulation hervorgehen, die bereits nach der primären Stimulations stark proliferiert haben. Somit kann also innerhalb des T-Zellrepertoires der allergischen Spender eine Prädominanz der kreuzreaktiven T-Zellsubpopulationen festgestellt werden. Eine monospezifische T-Zellsubpopulation konnte unter Verwendung der neuen Methode nicht detektiert werden.rnDas Ausmaß von Qualität und Quantität einer Kreuzreaktivität kann nun visualisiert werden, was dazu beitragen kann, das Protokoll einer SIT zu verbessern und optimal an den individuellen Patienten anzupassen, um möglicherweise eine größere Chance auf eine erfolgreiche Therapie in Aussicht zu stellen.

On the aetiology of bovine neonatal pancytopenia (BNP)

Bovine Neonatal Pancytopenia (BNP) is a novel haemorrhagic disease in sucking calves, characterised by bleeding, haematological changes and high mortality. Dams that gave birth to BNP affected calves were immunized with PregSure® BVD, a highly adjuvanted vaccine against Bovine Viral Diarrhoea (BVD). We can show that bioprocess impurities in the vaccine, originating from the cell line used for vaccine production induces alloantibodies in vaccinated cattle. Via flow cytometry and immunoprecipitation we can demonstrate that PregSure® BVD immunization leads to BNP alloantibody production. BNP alloantibodies target highly polymorphic bovine MHC-I molecules (BoLA I). We sequenced eight BoLA I variants expressed by the production cell line and identified three alleles which are responsible for the majority of PregSure® BVD induced BoLA I reactivity. The BoLA I alleles of BNP unaffected calves are not recognized by the BNP associated alloantibodies of their respective dams. We also examined whether BNP alloantibodies cross-react with human cells, thus being a potential hazard for human colostrum consumers and could show that BNP alloantibodies are cross-reactive to human MHC-I and can even be found in commercial colostrum powder manufactured from cows immunized with PregSure® BVD. Overall we can demonstrate that BNP is a vaccine induced alloimmune disease.

Regulation des Proteins Alpha-Synuclein während der zellulären Alterung

α-Synuclein wird durch Mutationen sowie der Ausbildung von Proteinaggregaten namens Lewy-Körperchen mit der Entstehung der altersassoziierten Parkinson-Krankheit in Verbindung gebracht. Sowohl familiäre als auch sporadische Fälle sind durch erhöhte α-Synuclein-Spiegel gekennzeichnet. In familiären Fällen wurden Multiplikationen des α-Synuclein-Gens als Ursache für die erhöhte Expression aufgedeckt. In sporadischen Fällen stellt die Alterung den entscheidenden Risikofaktor für die Entstehung der Krankheit dar. Daher wurde in der vorliegenden Arbeit die Regulation von α-Synuclein während der zellulären Alterung in humanen Fibroblasten untersucht. In seneszenten Zellen konnte ein Anstieg der α-Synuclein-Expression nachgewiesen werden, der jedoch die Löslichkeit des Proteins nicht veränderte. Damit scheint die zelluläre Alterung per se nicht für die Aggregation des Proteins, wie sie in Form von Lewy-Körperchen bei z. B. Patienten der Parkinson-Krankheit beobachtet wird, verantwortlich zu sein. Möglicherweise ist die Hochregulation von α-Synuclein eine Folge der Akkumulation von DNA-Schäden in den seneszenten Zellen. Diese Korrelation konnte in jungen Zellen nach dem Einsatz verschiedener DNA-schädigender Agenzien bestätigt werden. Die Untersuchung des Regulationsmechanismus ergab, dass die erhöhte Expression von α-Synuclein in Folge von DNA-Schäden über den ERK1/2-MAPK-Signalweg vermittelt wird. In seneszenten Zellen konnte ebenfalls ein Einfluss dieses Signalweges auf die Expression von α-Synuclein beobachtet werden, allerdings scheint dieser nicht alleinig für die Hochregulation verantwortlich zu sein. Des Weiteren ergab die Betrachtung des γH2A.X-Spiegels nach Induktion von DNA-Schäden, dass α-Synuclein möglicherweise eine protektive Funktion besitzt, da dessen Überexpression zu einer verringerten und die Herunterregulation zu einer vermehrten DNA-Schädigung führte. Die Analyse der subzellulären Lokalisation von α-Synuclein ergab außerdem, dass es in jungen Zellen nach der Induktion von DNA-Schäden zu einer Translokation des Proteins in den Zellkern kommt. Diese Translokation war in seneszenten Zellen verringert. Dies lässt vermuten, dass α-Synuclein in jungen Zellen nach DNA-Schädigung durch den ERK1/2-MAPK-Signalweg hochreguliert wird und durch die Translokation in den Zellkern möglicherweise die Transkription von protektiven Genen beeinflusst oder an DNA-Reparatur-Prozessen beteiligt ist. In seneszenten Zellen ist das Protein zwar deutlich stärker exprimiert, der Transport in den Zellkern jedoch verringert, wodurch die protektive Wirkung im Zellkern herabgesetzt wäre.

Functional characterization of the placenta specific protein PLAC1 and its use for cancer immunotherapy

Summary Antibody-based cancer therapies have been successfully introduced into the clinic and have emerged as the most promising therapeutics in oncology. The limiting factor regarding the development of therapeutical antibody vaccines is the identification of tumor-associated antigens. PLAC1, the placenta-specific protein 1, was categorized for the first time by the group of Prof. Sahin as such a tumor-specific antigen. Within this work PLAC1 was characterized using a variety of biochemical methods. The protein expression profile, the cellular localization, the conformational state and especially the interacting partners of PLAC1 and its functionality in cancer were analyzed. Analysis of the protein expression profile of PLAC1 in normal human tissue confirms the published RT-PCR data. Except for placenta no PLAC1 expression was detectable in any other normal human tissue. Beyond, an increased PLAC1 expression was detected in several cancer cell lines derived of trophoblastic, breast and pancreatic lineage emphasizing its properties as tumor-specific antigen. rnThe cellular localization of PLAC1 revealed that PLAC1 contains a functional signal peptide which conducts the propeptide to the endoplasmic reticulum (ER) and results in the secretion of PLAC1 by the secretory pathway. Although PLAC1 did not exhibit a distinct transmembrane domain, no unbound protein was detectable in the cell culture supernatant of overexpressing cells. But by selective isolation of different cellular compartments PLAC1 was clearly enriched within the membrane fraction. Using size exclusion chromatography PLAC1 was characterized as a highly aggregating protein that forms a network of high molecular multimers, consisting of a mixture of non-covalent as well as covalent interactions. Those interactions were formed by PLAC1 with itself and probably other cellular components and proteins. Consequently, PLAC1 localize outside the cell, where it is associated to the membrane forming a stable extracellular coat-like structure.rnThe first mechanistic hint how PLAC1 promote cancer cell proliferation was achieved identifying the fibroblast growth factor FGF7 as a specific interacting partner of PLAC1. Moreover, it was clearly shown that PLAC1 as well as FGF7 bind to heparin, a glycosaminoglycan of the ECM that is also involved in FGF-signaling. The participation of PLAC1 within this pathway was approved after co-localizing PLAC1, FGF7 and the FGF7 specific receptor (FGFR2IIIb) and identifying the formation of a trimeric complex (PLAC1, FGF7 and the specific receptor FGFR2IIIb). Especially this trimeric complex revealed the role of PLAC1. Binding of PLAC1 together with FGF7 leads to the activation of the intracellular tyrosine kinase of the FGFR2IIIb-receptor and mediate the direct phosphorylation of the AKT-kinase. In the absence of PLAC1, no FGF7 mediated phosphorylation of AKT was observed. Consequently the function of PLAC1 was clarified: PLAC1 acts as a co-factor by stimulating proliferation by of the FGF7-FGFR2 signaling pathway.rnAll together, these novel biochemical findings underline that the placenta specific protein PLAC1 could be a new target for cancer immunotherapy, especially considering its potential applicability for antibody therapy in tumor patients.

Rolle der FOS-Proteine und des MAPK-Signallings in der Regulation der zellulären Antwort auf genotoxischen Stress

Die mittlere Überlebenszeit nach Erkennung eines Glioblastoms ohne Behandlung liegt bei 3 Monaten und kann durch die Behandlung mit Temozolomid (TMZ) auf etwa 15 Monate gesteigert werden. Neben TMZ sind die chlorethylierenden Nitrosoharnstoffe die meistversprechendsten und am häufigsten eingesetzten Chemotherapeutika in der Gliomtherapie. Hier liegt die mittlere Überlebenszeit bei 17,3 Monaten. Um die Therapie des Glioblastoms noch effektiver zu gestalten und Resistenzen zu begegnen, werden unterschiedlichste Ansätze untersucht. Eine zentrale Rolle spielen hierbei das activator protein 1 (AP-1) und die mitogen aktivierten Proteinkinasen (MAPK), deren Funktion in bisherigen Arbeiten noch unzureichend beleuchtet wurde.rnBesonders mit der Rolle des AP-1-bildenden Proteins FRA-1 in der Therapie des Glioblastoms haben sich bisher nur wenige Arbeiten beschäftigt, weshalb im ersten Teil der vorliegenden Arbeit dessen Funktion in der Regulation der Chemosensitivität gegenüber dem chlorethylierenden Agenz ACNU genauer untersucht wurde. Es konnte gezeigt werden, dass die FRA 1-Expression durch Behandlung mit ACNU induziert wird. Die Induktion erfolgte über die beiden MAPKs ERK1/2 und p38K. JNK hatte keinen Einfluss auf die Induktion. Durch die Herunterregulation der FRA-1-Expression mit Hilfe von siRNA und eines shRNA exprimierenden Plasmids kam es zu einer signifikanten Sensitivierung gegenüber ACNU. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Herunterregulation der FRA-1-Expression in einer verminderten AP 1-Bildung, bedingt durch eine reduzierte Menge an FRA-1 im AP-1-Komplex resultiert. Die Sensitivierung gegenüber ACNU ist weder durch eine Veränderung in der DNA-Reparatur, noch in der Modulation der FAS-Ligand- bzw. FAS-Rezeptor-Expression bedingt. Auch die hier untersuchten BCL 2-Familienmitglieder wiesen keine Unterschiede in der Expression durch Modulation der FRA 1-Expression auf. Allerdings kam es durch die verminderte FRA-1-Expression zu einer Reduktion der Zellzahl in der G2/M-Phase nach Behandlung mit ACNU. Diese ging einher mit einer reduzierten Menge an phosphoryliertem und unphosphoryliertem CHK1, weshalb davon auszugehen ist, dass FRA 1 nach ACNU-Behandlung in Gliomzellen vor der Apoptose schützt, indem es modulierend auf die Zellzykluskontrolle einwirkt.rnIm zweiten Teil dieser Arbeit wurde die Regulation der apoptotischen Antwort nach Behandlung mit ACNU und TMZ genauer beleuchtet, wobei ein spezielles Augen¬merk auf AP 1 und die MAPKs gelegt wurde. Hier konnte gezeigt werden, dass die Apoptose nach Behandlung mit ACNU bzw. TMZ sowohl durch Spaltung von Pro-Caspase 8, als auch Pro-Caspase 9 eingeleitet wird. Dabei akkumulierte in beiden Fällen p53 vermehrt im Zellkern. Eine Inhibierung der transkriptionellen Aktivität von p53 führte nach ACNU-Behandlung zu einer Sensitivierung der Zellen, nach TMZ-Behandlung kam es zu einem leichten Anstieg in der Vitälität. Der FAS-Rezeptor wurde nach ACNU- und nach TMZ-Behandlung aktiviert und auch die DNA-Reparaturproteine DDB2 und XPC wurden in beiden Fällen vermehrt exprimiert. Für die MAPKs JNK und ERK1/2 konnte gezeigt werden, dass diese pro-apoptotisch wirken. Die AP-1-Bildung nach ACNU-Behandlung erfolgte bereits nach 24 h und war von langer Dauer, wohingegen nach TMZ-Behandlung nur eine transiente AP 1-Bildung zu relativ späten Zeitpunkten detektiert werden konnte. Ebenso konnte für das AP-1-Zielgen FAS-Ligand nach ACNU-Behandlung eine relativ schnelle, lang anhaltende Aktivierung detektiert werden, wohingegen nach TMZ-Behandlung zu einem späten Zeitpunkt ein kurzer Anstieg im Signal zu verzeichnen war. In späteren Experimenten konnte gezeigt werden, dass das BCL-2-Familienmitglied BIM eine zentrale Rolle in der Regulation des intrinsischen Apoptosesignalweges nach Behandlung mit ACNU und TMZ spielt. Die hier entstanden Ergebnisse tragen entscheidend zum Verständnis der durch diese beiden Agenzien gesteuerten, apoptotischen Signalwege bei und bieten eine fundierte Grundlage für weitere Untersuchungen.rn

Molekulare Ursachen und therapeutische Intervention bei der Alzheimer-Demenz

Ein charakteristisches, neuropathologisches Merkmal der Alzheimer-Demenz (AD), der am häufigsten vorkommenden Demenz-Form des Menschen, ist das Auftreten von senilen Plaques im Gehirn der Patienten. Hierbei stellt das neurotoxische A-beta Peptid den Hauptbestandteil dieser Ablagerungen dar. Einen Beitrag zu der pathologisch erhöhten A-beta Generierung liefert das verschobene Expressionsgleichgewicht der um APP-konkurrierenden Proteasen BACE-1 und ADAM10 zu Gunsten der beta-Sekretase BACE-1. In der vorliegenden Dissertation sollten molekulare Mechanismen identifiziert werden, die zu einem pathologisch veränderten Gleichgewicht der APP-Spaltung und somit zum Entstehen und Fortschritt der AD beitragen. Des Weiteren sollten Substanzen identifiziert werden, die durch Beeinflussung der Genexpression einer der beiden Proteasen das physiologische Gleichgewicht der APP-Prozessierung wiederherstellen können und somit therapeutisch einsetzbar sind.rnAnhand eines „Screenings“ von 704 Transkriptionsfaktoren wurden 23 Faktoren erhalten die das Verhältnis ADAM10- pro BACE-1-Promotor Aktivität beeinflussten. Exemplarisch wurden zwei der molekularen Faktoren auf ihren Wirkmechanismus untersucht: Der TF „X box binding protein-1“ (XBP-1), der die so genannte „unfolded protein response“ (UPR) reguliert, erhöhte die Expression von ADAM10 in Zellkultur-Experimenten. Die Menge dieses Faktors war in AD-Patienten im Vergleich zu gesunden, Alters-korrelierten Kontrollen signifikant erniedrigt. Im Gegensatz dazu verminderte der Seneszenz-assoziierte TF „T box 2“ (Tbx2) die Menge an ADAM10 in SH-SY5Y Zellen. Die Expression des Faktors selbst war in post-mortem Kortexgewebe von AD-Patienten erhöht. Zusätzlich zu den TFs konnten in einer Kooperation mit dem Helmholtz Zentrum München drei microRNAs (miRNA 103, 107, 1306) bioinformatisch prädiziert und experimentell validiert werden, die die Expression des humanen ADAM10 reduzierten.rnIm Rahmen dieser Arbeit konnten damit körpereigene Faktoren identifiziert werden, die die Menge an ADAM10 regulieren und folglich potenziell an der Entstehung der gestörten Homöostase der APP-Prozessierung beteiligt sind. Somit ist die AD auch im Hinblick auf eine A-beta-vermittelte Pathologie als multifaktorielle Krankheit zu verstehen, in der verschiedene Regulatoren zur gestörten APP-Prozessierung und somit zur pathologisch gesteigerten A-beta Generierung beitragen können. rnEine pharmakologische Erhöhung der ADAM10 Genexpression würde zu der Freisetzung von neuroprotektivem APPs-alpha und gleichzeitig zu einer reduzierten A-beta Generierung führen. Deshalb war ein weiteres Ziel dieser Arbeit die Evaluierung von Substanzen mit therapeutischem Potenzial im Hinblick auf eine erhöhte ADAM10 Expression. Von 640 FDA-zugelassenen Medikamenten einer Substanz-Bibliothek wurden 23 Substanzen identifiziert, die die Menge an ADAM10 signifikant steigerten während die Expression von BACE-1 und APP unbeeinflusst blieb. In Zusammenarbeit mit dem Institut für Pathologie (Johannes Gutenberg Universität Mainz) wurde ein Zellkultur-basiertes Modell etabliert, um die Permeationsfähigkeit der potenziellen Kandidaten-Substanzen über die Blut-Hirn Schranke (BHS) zu untersuchen. Von den 23 Medikamenten konnten neun im Rahmen des etablierten Modells als BHS-gängig charakterisiert werden. Somit erfüllen diese verbleibenden Medikamente die grundlegenden Anforderungen an ein AD-Therapeutikum. rnADAM10 spaltet neben APP eine Vielzahl anderer Substrate mit unterschiedlichen Funktionen in der Zelle. Zum Beispiel reguliert das Zelladhäsionsmolekül Neuroligin-1 (NL-1), das von ADAM10 prozessiert wird, die synaptische Funktion exzitatorischer Neurone. Aus diesem Grund ist die Abschätzung potenzieller, Therapie-bedingter Nebenwirkungen sehr wichtig. Im Rahmen eines Forschungsaufenthalts an der Universität von Tokio konnte in primären, kortikalen Neuronen der Ratte bei einer Retinoid-induzierten Erhöhung von ADAM10 neben einer vermehrten alpha-sekretorischen APP-Prozessierung auch eine gesteigerte Spaltung von NL-1 beobachtet werden. Dies lässt vermuten, dass bei einer Behandlung mit dem Retinoid Acitretin neben einer vermehrten APP-Spaltung durch ADAM10 auch die Regulation glutamaterger Neurone durch die Spaltung von NL-1 betroffen ist. Anhand eines geeigneten Alzheimer-Tiermodells sollten diese Befunde weiter analysiert werden, um so auf einen sicheren therapeutischen Ansatz bezüglich einer vermehrten ADAM10 Genexpression schließen zu können.rn

Synthese und Charakterisierung von zylindrischen Bürsten mit polypept(o)idischen Seitenketten als nanopartikuläre Trägersysteme

Zylindrische Polymerbürsten mit pept(o)idischen Seitenketten sind auf Grund ihrer elongierten Topologie, Bioverträglichkeit und hohen Dichte an funktionellen Gruppen vielversprechende Kandidaten für Anwendungen im Bereich des kontrollierten Wirkstoff- bzw. Gentransportes.In dieser Arbeit wurden Polylysin und Polysarkosin als Bestandteile der Seitenketten verwendet. Polylysin dient als positiv geladener Polypeptidblock für die Komplexierung von Polynukleotiden. Polysarkosin reduziert mit seinem „Stealth“-Effekt die Toxizität des Trägersystems und vermindert Wechselwirkungen mit dem Immunsystem. Über den „grafting from“-Ansatz und mit Hilfe der ringöffnenden NCA-Polymerisation konnten erstmals zylindrische Bürsten mit reinen Polysarkosin-Seitenketten sowie mit amphiphilen Seitenketten aus einem Polylysinkern und einer Polysarkosinschale hergestellt werden. Die Bürsten wurden mittels Lichtstreuung, GPC, CD-Spektroskopie und AFM charakterisiert. Die hohe Biokompatibilität beider Bürsten konnte durch Toxizitätstests und dynamische Lichtstreuung in humanem Blutserum nachgewiesen werden.Die Polysarkosin-Bürsten konnten zusätzlich an den Seitenkettenenden mit Azidgruppen funktionalisiert werden, welche eine effektive Biokonjugation ermöglichen. Die zylindrischen Bürsten zeigten nach ihrer Modifikation keine unspezifische Aufnahme in dendritische Zellen und könnten somit als Ausgangssubstanzen für die Synthese polymerbasierter Antikörper-Antigen-Konjugate in der Krebsimmuntherapie verwendet werden.Die Kern-Schale-Bürsten konnten erfolgreich mit siRNA komplexiert werden, ohne dass dabei eine Aggregation auftrat. In ersten Gen-Knockdown-Experimenten zeigten ihre Komplexe eine signifikante Verminderung der ApoB100-Proteinexpression in AML-12 Hepatozyten und könnten daher zukünftig als Transfektionsmittel in der Gentherapie ihren Einsatz finden.

Imiquimod based transcutaneous immunization – insights and novel concepts

This work aims at developing a transcutaneous immunization (TCI) approach in order to activate cytotoxic T-cells. A tumor specific immune response was therefore generated by the TLR7-Agonist imiquimod. Five commercially available creams including the innovators product Aldara® 5% creme were assessed to ascertain their capability to induce an immune response in C57BL/6 mice after dermal administration. Moreover, creams were investigated regarding their imiquimod permeation in a Franz-diffusion cell model. Results obtained from this study were used to develop novel formulation approaches based on dissolved state imiquimod in a submicron scale range. High pressure homogenization ensured emulsification as well as particle size reduction. A freeze dried spreadable solid nanoemulsion based on sucrose fatty acid esters and oil components represented a major formulation approach. Within the scope of this approach the influence of pharmaceutical oils i.e. middle chain triglycerides, avocado oil, jojoba wax, and squalen was assessed towards their TCI performance. Furthermore, an aqueous jojoba wax based emulsion gel was developed. Unlike the innovators product, all formulations demonstrated a distinctly reduced imiquimod permeation across murine skin, a fact particularly evident in case of jojoba wax. Squalen significantly augmented in vivo immune response (p≤0.05 Mann-Whitney-Test). The emulsion gel demonstrated a 10fold decrease of imiquimod permeation. In comparison with the innovators product, the emulsion gel induced an equal immune response with a simultaneously enhanced tumor rejection in a mouse model.

Mechanisms of resistance of tumor cells in response to treatment with the vacuolar H+-ATPase inhibitor archazolid B

Resistance of cancer cells towards chemotherapy is the major cause of therapy failure. Hence, the evaluation of cellular defense mechanisms is essential in the establishment of new chemotherapeutics. In this study, classical intrinsic and acquired as well as new resistance mechanisms relevant in the cellular response to the novel vacuolar H+-ATPase inhibitor archazolid B were investigated. Archazolid B, originally produced by the myxobacterium Archangium gephyra, displayed cytotoxicity in the low nanomolar range on a panel of cancer cell lines. The drug showed enhanced cytotoxic activity against nearly all cancerous cells compared to their non-cancerous pendants. With regards to ABC transporters, archazolid B was identified as a moderate substrate of ABCB1 (P-glycoprotein) and a weak substrate of ABCG2 (BCRP), whereas hypersensitivity was observed in ABCB5-expressing cells. The cytotoxic effect of archazolid B was shown to be independent of the cellular p53 status. However, cells expressing constitutively active EGFR displayed significantly increased resistance. Acquired drug resistance was studied by establishing an archazolid B-resistant MCF-7 cell line. Experiments showed that this secondary resistance was not conferred by aberrant expression or DNA mutations of the gene encoding vacuolar H+-ATPase subunit c, the direct target of archazolid B. Instead, a slight increase of ABCB1 and a significant overexpression of EGFR as well as reduced proliferation may contribute to acquired archazolid B resistance. For identification of new resistance strategies upon archazolid B treatment, omics data from bladder cancer and glioblastoma cells were analyzed, revealing drastic disturbances in cholesterol homeostasis, affecting cholesterol biosynthesis, uptake and transport. As shown by filipin staining, archazolid B led to accumulation of free cholesterol in lysosomes, which triggered sterol responses, mediated by SREBP-2 and LXR, including up-regulation of HMGCR, the key enzyme of cholesterol biosynthesis. Furthermore, inhibition of LDL uptake as well as impaired LDLR surface expression were observed, indicating newly synthesized cholesterol to be the main source of cholesterol in archazolid B-treated cells. This was proven by the fact that under archazolid B treatment, total free cholesterol levels as well as cell survival were significantly reduced by inhibiting HMGCR with fluvastatin. The combination of archazolid B with statins may therefore be an attractive strategy to circumvent cholesterol-mediated cell survival and in turn potentiate the promising anticancer effects of archazolid B.

Development of a highly potent bispecific antibody format targeting the novel tumor-specific antigen CLDN18.2

Due to multiple immune evasion mechanisms of cancer cells, novel therapy approaches are required to overcome the limitations of existing immunotherapies. Bispecific antibodies are potent anti-cancer drugs, which redirect effector T cells for specific tumor cell lysis, thus enabling the patient’s immune system to fight cancer cells. The antibody format used in this proof of concept study–bispecific ideal monoclonal antibodies termed BiMAB–is a tailor-made recombinant protein, which consists of two fused scFv antibodies recognizing different antigens. Both are arranged in tandem on a single peptide chain and the individual variable binding domains are separated by special non-immunogenic linkers. The format is comprised of a scFv targeting CLDN18.2–a gastric cancer tumor associated antigen (TAA) –while the second specificity binds the CD3 epsilon (CD3ε) subunit of the T cell receptor (TCR) on T cells. For the first time, we compared in our IMAB362-based BiMAB setting, four different anti-CD3-scFvs, respectively derived from the mAbs TR66, CLB-T3, as well as the humanized and the murine variant of UCHT1. In addition, we investigated the impact of an N- versus a C-terminal location of the IMAB362-derived scFv and the anti-CD3-scFvs. Thus, nine CLDN18.2 specific BiMAB proteins were generated, of which all showed a remarkably high cytotoxicity towards CLDN18.2-positive tumor cells. Because of its promising effectiveness, 1BiMAB emerged as the BiMAB prototype. The selectivity of 1BiMAB for its TAA and CD3ε, with affinities in the nanomolar range, has been confirmed by in vitro assays. Its dual binding depends on the design of an N-terminally positioned IMAB362 scFv and the consecutive C-terminally positioned TR66 scFv. 1BiMAB provoked a concentration and target cell dependent T cell activation, proliferation, and upregulation of the cytolytic protein Granzyme B, as well as the consequent elimination of target cells. Our results demonstrate that 1BiMAB is able to activate T cells independent of elements that are usually involved in the T cell recognition program, like antigen presentation, MHC restriction, and co-stimulatory effector molecules. In the first in vivo studies using a subcutaneous xenogeneic tumor mouse model in immune incompetent NSG mice, we could prove a significant therapeutic effect of 1BiMAB with partial or complete tumor elimination. The initial in vitro RIBOMAB experiments correspondingly showed encouraging results. The electroporation of 1BiMAB IVT-RNA into target or effector cells was feasible, while the functionality of translated 1BiMAB was proven by induced T cell activation and target cell lysis. Accordingly, we could show that the in vitro RIBOMAB approach was applicable for all nine BiMABs, which proves the RIBOMAB concept. Thus, the CLDN18.2-BiMAB strategy offers great potential for the treatment of cancer. In the future, administered either as protein or as IVT-RNA, the BiMAB format will contribute towards finding solutions to raise and sustain tumor-specific cellular responses elicited by engaged and activated endogenous T cells. This will potentially enable us to overcome immune evasion mechanisms of tumor cells, consequently supporting current solid gastric cancer therapies.

Kaiso und CTCF regulieren geprägte Gene in cis und in trans

Geprägte Gene besitzen die Besonderheit, dass sie jeweils nur von einem Allel exprimiert werden und in der Regel in Imprinting Clustern (ICs) im Genom vorliegen. Bei der Regulation in solchen ICs spielen differentiell methylierte Imprinting Kontrollregionen (ICRs) und dort stattfindende Proteinbindungen eine wichtige Rolle. Die essentielle Bedeutung der CTCF-Bindung an die ICR1 in 11p15.5 für die Expressionsregulation der geprägten Gene H19 und IGF2 ist bereits bekannt. In der vorliegenden Arbeit sollte die Bindung von Kaiso an die unmethylierte ICR1 bei humanen Zellen mit maternaler uniparentaler Disomie von 11p15 (upd(11p15)mat) nachgewiesen und die genaue Bindungsverteilung von Kaiso und CTCF in den B-Repeats der Kontrollregion bestimmt werden. Cis-regulatorische und chromosomenübergreifende transkriptionelle Effekte der ICR1-Proteinbindungen sollten dann durch qPCR-Analysen geprägter Gene bei Zellen mit maternaler und paternaler upd(11p15) und nach siRNA-basierter Herunterregulation der beiden Proteine in Zellen mit upd(11p15)mat analysiert werden. In der vorliegenden Arbeit konnte erstmals gezeigt werden, dass Kaiso an die unmethylierte ICR1 bindet. Dabei kann zumindest von einer Bindestellennutzung in der distalen ICR1-Hälfte ausgegangen werden. Für CTCF hingegen wurde eine Nutzung aller analysierten Repeats in beiden ICR1-Hälften gefunden. In der maternalen bzw. paternalen upd(11p15) entspricht die Expression der 11p15.5-Gene IGF2, H19, CDKN1C und KCNQ1OT1 dem jeweiligen Disomie-Status. Von den nicht auf Chromosom 11 gelegenen geprägten Genen zeigen MEST und PLAGL1 bei Zellen mit upd(11p15)pat sowie PEG3 und GRB10 bei der upd(11p15)mat eine stärkere Expression. Ein CTCF-knockdown in Zellen mit upd(11p15)mat führt zur IGF2-Expressionssteigerung. Dies tritt in noch stärkerem Maße beim knockdown von Kaiso auf, wobei hier zusätzlich eine gesteigerte Expression von H19 vorliegt. Des Weiteren findet man beim CTCF-knockdown einen MEST-Expressionsanstieg und beim Kaiso-knockdown gesteigerte Expressionen der Gene PEG3, GRB10 und PLAGL1. Damit lassen sich sowohl eigenständige cis-regulatorische Effekte der ICR1-Bindung beider Proteine auf geprägte Gene des IC1 als auch chromosomenübergreifende Effekte erkennen. Vor allem die starken H19-Expressionsanstiege beim Kaiso-knockdown treten korrelierend mit Veränderungen von geprägten Genen anderer Chromosomen auf. Damit unterstützen die Daten die Theorie, dass die Expressionsregulation geprägter Gene koordiniert in einer Art Netzwerk stattfinden könnte und dabei bestimmte Faktoren wie H19 und PLAGL1 eine übergeordnete Regulatorfunktion besitzen, wie es in Vergangenheit in der Maus beschrieben wurde. Die Expressionsanalysen von PLAGL1 und MEST deuten darüber hinaus durch ihre tendenziell übereinstimmenden Werte bei der paternalen upd mit hypermethylierter ICR1 und den knockdowns auf die Existenz von Chromatin-Interaktionen zwischen der ICR1 und Abschnitten auf den Chromosomen 6 und 7 hin, ggf. mit einem entsprechenden lokalen Effekt der Proteine in diesen Loci. Proteinbindungen an die maternale ICR1 scheinen damit sowohl cis-regulatorisch die Transkription der geprägten Gene IGF2 und H19 zu beeinflussen als auch durch die H19-Expression ein funktionelles Netzwerk geprägter Gene als trans-Faktor zu regulieren und für Interaktionen zwischen verschiedenen Chromosomen mit transkriptionsregulierender Wirkung verantwortlich zu sein.

Synthese, Charakterisierung und Testung von Phenylacrylsäure-Derivaten, Benzothiazolen und Diarylthioethern als potentielle Inhibitoren der Dengue-Virus-Typ-2-NS2B-NS3-Protease

Dengue-Fieber ist eine durch Stechmücken der Gattungen Aedes aegypti und Aedes albopticus übertragene, virale Infektionskrankheit des Menschen, welche eine zunehmende Bedrohung für die Weltbevölkerung darstellt; das Infektionsrisiko betrifft vorwiegend Menschen, die in tropischen und subtropischen Gebieten der Erde (Asien, Afrika, Amerika) leben. Bei dem Erreger handelt es sich um ein Flavivirus, bestehend aus einer positiv polarisierten Einzelstrang-RNA, welches in vier verschiedenen Serotypen existiert. Eine Infektion mit Dengue-Viren zeigt sich durch drei mögliche Krankheitsbilder: Klassisches Dengue-Fieber (DF), hämorrhagisches Dengue-Fieber (DHF) oder Dengue-Schock-Syndrom (DSS). Das Dengue-Virus-Genom codiert eine Serin-Protease mit einer klassischen katalytischen Triade, bestehend aus den Aminosäuren His51, Asp75 und Ser135. Die Funktion der Dengue-Virus-Protease besteht in der post-translationalen, proteolytischen Prozessierung des viralen Polyprotein-Vorläufers, womit sie essentiell für die Virus-Replikation ist und damit einen wichtigen therapeutischen Ansatz für die Entwicklung neuer Wirkstoffe gegen Dengue-Fieber darstellt. Die Ziele der vorliegenden Arbeit bestanden darin, neue potentielle Inhibitoren der Dengue-Virus Typ 2 NS2B-NS3 Protease (DEN-2 NS2B-NS3pro) zu synthetisieren, deren Hemmwirkung sowie den Inhibitionstyp mithilfe fluorimetrischer Enzym-Assays zu bestimmen, Struktur-Wirkungs-Beziehungen (u.a. mithilfe von Molecular Docking-Rechnungen) zu analysieren und die erhaltenen Leitstrukturen zu optimieren. In der vorliegenden Arbeit wurden zwei Substanzklassen und damit zwei Teilprojekte behandelt: Phenylacrylsäureamide im ersten Teilprojekt, Benzothiazole und Diarylthioether zusammen im zweiten Teilprojekt. Im ersten Teilprojekt zeigten einige Phenylacrylsäureamide eine schwache Hemmung der DEN-2 NS2B-NS3pro zwischen ca. 50 und 61 % bei einer Inhibitorkonzentration von 50 µM sowie eine nicht-kompetitive Hemmung, welche jedoch durch vielfältige Derivatisierung kaum verändert oder verbessert werden konnte. Darüber hinaus wurden die endogenen Serin-Proteasen alpha-Chymotrypsin und Trypsin durch einige Phenylacrylsäureamide erheblich stärker gehemmt als die DEN-2 NS2B-NS3pro. Das zweite Teilprojekt befasste sich mit der Synthese und Testung von Diarylthioethern mit hydroxy-substituierten Benzothiazol-Bausteinen sowie der Testung einiger methoxy-substituierter Synthese-Vorstufen der Endverbindungen, um die Relevanz und den Einfluss der einzelnen Bausteine auf die Hemmung der DEN-2 NS2B-NS3pro zu untersuchen. Der in der vorliegenden Arbeit synthetisierte, potenteste Inhibitor der DEN-2 NS2B-NS3pro (Hemmung: 90 % [50 µM]; IC50 = 3.6 +/- 0.11 µM) und der DEN-3 NS2B-NS3pro (Hemmung: >99 % [100 µM]; IC50 = 9.1 +/- 1.02 µM), SH65, ein Diarylthioether-Benzothiazol-Derivat, entstand aufgrund der Vorhersage zweier möglicher Bindungsmodi (kompetitiv und nicht-kompetitiv) mithilfe von Molecular Docking-Experimenten an der Röntgen-Kristall-struktur der DEN-3 NS2B-NS3pro (PDB-Code: 3U1I). Nach experimenteller Bestimmung der IC50-Werte bei unterschiedlichen Substratkonzentrationen erwies sich SH65 jedoch als nicht-kompetitiver Inhibitor der DEN-2 NS2B-NS3pro. Trypsin wurde von SH65 vergleichbar stark gehemmt (96% [50 µM]; IC50 = 6.27 +/- 0.68 µM) wie die beiden getesteten Dengue-Virus-Proteasen, nicht jedoch alpha-Chymotrypsin (nur 21% Hemmung bei 50 µM), wodurch diesem Inhibitor zumindest eine relative Selektivität gegenüber Serin-Proteasen zugeschrieben werden kann. SH65 zeigte lediglich Protease-Hemmung in den Enzym-Assays, jedoch keine antivirale Aktivität bei der Testung an Dengue-Virus-infizierten Zellen, was aber wiederum bei der synthetisierten Vorstufe von SH65, welche anstelle der beiden Hydroxy-Gruppen über Methoxy-Gruppen verfügt, der Fall war. Diarylthioether mit mehrfach hydroxy-substituiertem Benzothiazol-Baustein stellen hiermit eine neue, vielversprechende Wirkstoffgruppe zur Hemmung sowohl der Dengue-Virus Typ 2- als auch der Dengue-Virus Typ 3 NS2B-NS3 Protease dar.

Funktionelle HPMA-Copolymere zur möglichen Anwendung in der Tumor-Immuntherapie

Der Fokus dieser Arbeit lag in der Synthese von funktionellen HPMA-Copolymeren, sowohl für die Darstellung definierter Polymer-Antikörper Konjugate, als auch zum effizienten Transport von p-DNA in Polymer-DNA Komplexen (Polyplexe). Nach ausführlicher physikalischer und chemischer Charakterisierung wurden gezielt ihre Wechselwirkungen mit (Immun)-Zellen untersucht und so ihr Potential für die Verwendung in der Tumor-Immuntherapie aufgezeigt.rnFür das gezielte Ansprechen von bestimmten Immunzellen mit Schlüsselfunktionen besitzen monoklonale Antikörper ein großes Potential. Im Rahmen dieser Arbeit gelang die Darstellung definierter Polymer-Antikörper Konjugate über das gezielte Einführen von Thiol-Gruppen an Antikörper und die Synthese eng verteilter, Maleinimid funktionalisierter HPMA-Copolymere. Diese sehr gut definierten, funktionellen HPMA-Copolymere konnten über die Kombination der RAFT-Polymerisation und Reaktivester Polymeren gewonnen werden. Unterschiedliche Polymerstrukturen ermöglichten die Synthese verschiedener Arten von Polymer-Antikörper Konjugaten. Speziell die Untersuchung der verschiedenen Konjugate aus dem für dendritische Zellen spezifischen aDEC-205 Antikörper an Immunzellen aus dem Knochenmark von Mäusen lieferten wertvolle Erkenntnisse über Struktur-Wirkungsbeziehungen und zeigten die Möglichkeit der gezielten Adressierung von Immunzellen mit Schlüsselfunktionen bei der Aktivierung einer (Tumor)-Immunabwehr am Beispiel von dendritischen Zellen. Gleichzeitig erlaubt der Syntheseweg sowohl die gleichzeitige und kontrollierte Einführung auch komplexerer Stimuli am Polymerrückgrat als auch die Verwendung verschiedener Antikörper.rnÜber die Kombination der RAFT-Polymerisation und polymeren Reaktivestern wurde ebenso die Synthese von neuartigen kationisch-hydrophilen Polylysin-b-poly(HPMA) Blockcopolymeren als effiziente Transporter für den komplexen aber wirkungsvollen Wirkstoff p-DNA in Form von Polymer-DNA Komplexen (Polyplexe) realisiert. Da diese Polyplexe gleichzeitig eine Abschirmung der sensitiven p-DNA über eine poly(HPMA)-Korona vermitteln, stellen sie allgemein ein geeignetes Transportmittel für einen therapeutischen Transport von p-DNA dar. Diese Polyplexe sind in der Lage, humane Nierenkarzinomzellen (HEK-293T Zelllinie) zu transfizieren ohne signifikante Zytotoxizität zu zeigen. Darüber hinaus gelang eine große Steigerung der Transfektionseffizienz, ohne eine gleichzeitige Erhöhung der Zytotoxizität, durch die gezielte Einführung von Redox-stimuliresponsiven Disulfid-Gruppen zwischen den einzelnen Blöcken. Diese Polyplexe stellen einen polymeren Vektor zur transkriptionellen Regulierung von Zellen dar, zum Beispiel für die transkriptionelle Aktivierung von dendritischen Zellen, durch die Verwendung speziell dafür modifizierter p-DNA-Konstrukte. rnDurch die Verknüpfung einer ortsspezifischen enzymatischen Kopplung und kupferfreien Cyclooctin-Azid Kupplung gelang die kontrollierte und kovalente Modifizierung von polymeren Mizellen mit aDEC-205 Antikörpern an der hydrophilen poly(HPMA)-Korona. Diese Methode bietet die Möglichkeit der Anbindung der effektiven aber anspruchsvollen Erkennungsstruktur Antikörper an komplexere Polymerstrukturen und andere nano-partikulären Systeme, zum Beispiel an die zuvor genannten Polyplexe, um eine zellspezifische und verbesserte Aufnahme und Prozessierung zu erreichen.rnDiese Studien zeigen somit, sowohl die Möglichkeit der selektiven Addressierung von Immunzellen mit Schlüsselfunktionen wie dendritischer Zellen, als auch die Möglichkeit der transkriptionellen Regulation von Zellen durch Polyplexe. Sie stellen somit einen ersten Schritt zur Herstellung funktioneller, nanopartikulärer Systeme zur Verwendung in der Tumor-Immuntherapie dar. rn