Kaiso und CTCF regulieren geprägte Gene in cis und in trans

Geprägte Gene besitzen die Besonderheit, dass sie jeweils nur von einem Allel exprimiert werden und in der Regel in Imprinting Clustern (ICs) im Genom vorliegen. Bei der Regulation in solchen ICs spielen differentiell methylierte Imprinting Kontrollregionen (ICRs) und dort stattfindende Proteinbindungen eine wichtige Rolle. Die essentielle Bedeutung der CTCF-Bindung an die ICR1 in 11p15.5 für die Expressionsregulation der geprägten Gene H19 und IGF2 ist bereits bekannt. In der vorliegenden Arbeit sollte die Bindung von Kaiso an die unmethylierte ICR1 bei humanen Zellen mit maternaler uniparentaler Disomie von 11p15 (upd(11p15)mat) nachgewiesen und die genaue Bindungsverteilung von Kaiso und CTCF in den B-Repeats der Kontrollregion bestimmt werden. Cis-regulatorische und chromosomenübergreifende transkriptionelle Effekte der ICR1-Proteinbindungen sollten dann durch qPCR-Analysen geprägter Gene bei Zellen mit maternaler und paternaler upd(11p15) und nach siRNA-basierter Herunterregulation der beiden Proteine in Zellen mit upd(11p15)mat analysiert werden. In der vorliegenden Arbeit konnte erstmals gezeigt werden, dass Kaiso an die unmethylierte ICR1 bindet. Dabei kann zumindest von einer Bindestellennutzung in der distalen ICR1-Hälfte ausgegangen werden. Für CTCF hingegen wurde eine Nutzung aller analysierten Repeats in beiden ICR1-Hälften gefunden. In der maternalen bzw. paternalen upd(11p15) entspricht die Expression der 11p15.5-Gene IGF2, H19, CDKN1C und KCNQ1OT1 dem jeweiligen Disomie-Status. Von den nicht auf Chromosom 11 gelegenen geprägten Genen zeigen MEST und PLAGL1 bei Zellen mit upd(11p15)pat sowie PEG3 und GRB10 bei der upd(11p15)mat eine stärkere Expression. Ein CTCF-knockdown in Zellen mit upd(11p15)mat führt zur IGF2-Expressionssteigerung. Dies tritt in noch stärkerem Maße beim knockdown von Kaiso auf, wobei hier zusätzlich eine gesteigerte Expression von H19 vorliegt. Des Weiteren findet man beim CTCF-knockdown einen MEST-Expressionsanstieg und beim Kaiso-knockdown gesteigerte Expressionen der Gene PEG3, GRB10 und PLAGL1. Damit lassen sich sowohl eigenständige cis-regulatorische Effekte der ICR1-Bindung beider Proteine auf geprägte Gene des IC1 als auch chromosomenübergreifende Effekte erkennen. Vor allem die starken H19-Expressionsanstiege beim Kaiso-knockdown treten korrelierend mit Veränderungen von geprägten Genen anderer Chromosomen auf. Damit unterstützen die Daten die Theorie, dass die Expressionsregulation geprägter Gene koordiniert in einer Art Netzwerk stattfinden könnte und dabei bestimmte Faktoren wie H19 und PLAGL1 eine übergeordnete Regulatorfunktion besitzen, wie es in Vergangenheit in der Maus beschrieben wurde. Die Expressionsanalysen von PLAGL1 und MEST deuten darüber hinaus durch ihre tendenziell übereinstimmenden Werte bei der paternalen upd mit hypermethylierter ICR1 und den knockdowns auf die Existenz von Chromatin-Interaktionen zwischen der ICR1 und Abschnitten auf den Chromosomen 6 und 7 hin, ggf. mit einem entsprechenden lokalen Effekt der Proteine in diesen Loci. Proteinbindungen an die maternale ICR1 scheinen damit sowohl cis-regulatorisch die Transkription der geprägten Gene IGF2 und H19 zu beeinflussen als auch durch die H19-Expression ein funktionelles Netzwerk geprägter Gene als trans-Faktor zu regulieren und für Interaktionen zwischen verschiedenen Chromosomen mit transkriptionsregulierender Wirkung verantwortlich zu sein.

Imprinted genes are expressed in a parent-of-origin-specific manner, either from the maternal or paternal allele and normally occur in Imprinting Clusters (ICs) in the genome. Differentially methylated Imprinting control regions (ICRs) and binding of several proteins are essential for the gene regulation in such ICs. The importance of CTCF binding the ICR1 in chromosomal region 11p15.5 for the proper expression of the imprinted genes H19 and IGF2 is already known. rnThis projects target was to prove the binding of Kaiso to the unmethylated ICR1 in human cells with maternal uniparental disomy of the 11p15-region (upd(11p15)mat) and to identify the arrangement of Kaiso and CTCF at the B-repeats of the control region. Following transcriptionally cis- and trans-effects of the proteins binding to the ICR1 were analysed by qPCR of several imprinted genes in cells with maternal and paternal upd(11p15) and after siRNA-mediated downregulation of both proteins in upd(11p15)mat-cells.rnIt could be shown that Kaiso is binding the unmethylated ICR1 at least to the binding sites of the distal half of the control region. On the other hand CTCF seems to bind all analysed ICR1-repeats. Expression of the 11p15.5-genes IGF2, H19, CDKN1C und KCNQ1OT1 in the diverse upd(11p15)-cell cultures is in each case in accordance with the particular disomy-states. Concerning the imprinted genes lying on other chromosomes stronger expression of MEST and PLAGL1 at upd(11p15)pat-cells and of PEG3 and GRB10 at upd(11p15)mat-cells could be shown. CTCF-knockdown results in increased IGF2-expression. An even stronger increase of IGF2 could be found together with increased H19-expression after Kaiso-knockdown. Additionally CTCF-knockdown leads to increased MEST-expression and Kaiso-knockdown goes along with enhanced expression values of PEG3, GRB10 und PLAGL1. rnThe results indicate that the proteins binding the ICR1 involve cis-regulatory effects on imprinted IC1-genes as well as effects regarding imprinted genes on other chromosomes. Most notably the heavy increases of H19-expression after Kaiso-knockdown correlate with changes of genes lying on other chromosomes and are in good accordance with the theory that regulation of imprinted gene expression takes place in a network with special roles of certain regulatory factors like H19 and PLAGL1 like it was described in mice. Furthermore the concordant expression values of PLAGL1 and MEST of paternal upd-cells with hypermethylated ICR1 and of both protein-knockdowns could be seen as an evidence for the existence of chromatin interactions between ICR1 and regions on chromosomes 6 respectively 7. Maybe local effects of the proteins binding the particular loci participate in regulation of gene expression. rnTo sum it up proteins binding to the maternal ICR1 seem to cis-regulatory influence IGF2- and H19-expression, to participate in regulating imprinted genes in a network via trans-acting factors and to be responsible for interaction of chromosomes with transcriptionally relevant functions.rn