Complementary DNA cloning of complement C8 beta and its sequence homology to C9.

The complete amino acid sequence of mature C8 beta has been derived from the DNA sequence of a cDNA clone identified by expression screening of a human liver cDNA library. Comparison with the amino acid sequence of C9 shows an overall homology with few deletions and insertions. In particular, the cysteine-rich domains and membrane-inserting regions of C9 are well conserved. These findings are discussed in relation to a possible mechanism of membrane attack complex formation.

Characterization and functional identification of a novel plant extradiol 4,5-dioxygenase involved in betalain pigment biosynthesis in Portulaca Grandiflora

RESUME Les bétalaïnes sont des pigments chromo-alcaloïdes violets et jaunes présents dans les plantes appartenant à l'ordre des Caryophyllales et dans les champignons des genres Amanita et Hygrocybe. Leur courte voie de biosynthèse est élucidée chimiquement depuis de nombreuses années, mais les enzymes impliquées dans cette biosynthèse chez les plantes ne sont toujours pas caractérisées. L'enzyme de la DOPA-dioxygénase d' Amanita muscaria a été identifiée (Girod et Zryd, 1991a), mais de nombreuses tentatives d'isolation d'un homologue chez les plantes ont échoué. Afin d'isoler les gènes spécifiques des bétalaïnes chez les plantes, nous avons construit des banques soustraites d'ADNc à partir d'ARN total de pétales immatures de Portulaca grandiflora (Pg) de génotypes jaunes et blancs, respectivement violets et blancs. Les clones couleur- spécifiques ont été détectés en premier par analyse Northem du RNA de pétales blancs et colorés. Les candidats positifs ont alors été soumis à une analyse de transcription au niveau des tiges colorées, vertes et des feuilles, afin d'établir leur expression spécifique. Deux ARNs messagers complets ont une expression corrélée avec l'accumulation des bétalaïnes dans les tissus. Le premier de ces clones, A.16, code pour une oxydase de l'acyl-Coenzyme A (ACX) putative, mais le domaine de liaison du FAD essentiel pour l'activité d'ACX est absent. Toutes nos tentatives pour démontrer sa fonction ont échoué. Le rôle de cette protéine dans la voie de synthèse des bétalaïnes reste inconnu. Le deuxième de ces clones spécifique aux bétalaïnes, L.6 (isolé par Zaiko, 2000), a été renommé DODA en raison de son homologie avec le domaine LigB (pfam02900) d'une 4,5-dioxygénase extradiol bactérienne. DODA a été identifié in silico comme une dioxygénase extradiol en raison de la conservation stricte, au niveau de sa séquence peptidique, des résidus catalytiques de LigB et de ceux liant le cofacteur fer. Une analyse de transfert Southem a montré que ce gène est unique dans Pg. L'expression transitoire de DODA par transformation biolistique dans des pétales blancs de Pg a produit des taches violettes ou jaunes dans des cellules transformées. Une analyse HPLC de ces taches a démontré leur identité avec les bétalaïnes présentes naturellement dans les pétales violets et jaunes de Pg, confirmant ainsi la complémentation par le gène Pg DODA de l'allèle récessif cc présent dans les pétales blancs de Pg. Des homologues de DODA (DOPA-dioxygénase) ont été identifiés dans de nombreuses espèces de plantes, y compris dans celles sans bétalaïne. L'alignement de ces homologues a permis l'identification d'un motif spécifique aux bétalaïnes à côté d'une histidine catalytique conservée. Ce motif [H-P-(S,A)-(N,D)-x-T-P] remplace le motif [H-N-L-R] conservé dans les plantes sans bétalaïne et le motif [H-N-L-x] présent dans tous les homologues bactériens et archaebactériens. Une modélisation tridimensionnelle préliminaire du site actif de Pg DODA et de son homologue dans la mousse Physcomitrella patens a montré l'importance de ce motif spécifique aux bétalaïnes pour l'accessibilité du substrat au site actif. L'analyse phylogénétique de DODA a confirmé l'évolution séparée de cette protéine chez les plantes à bétalaïnes par comparaison avec celle des plantes sans bétalaïne. Nous avons donc conclu que les bétalaïnes sont apparues par modification de l'affinité pour un substrat d'enzymes similaires à DODA, chez un ancêtre unique des Caryophyllales qui a perdu toute capacité de biosynthèse des anthocyanes. Finalement, Pg DODA n'a aucune similarité avec la protéine DODA d' Amanita muscaria, bien que celle-ci complémente aussi la pigmentation des pétales blancs de Pg. La biosynthèse des bétalaïnes est un exemple remarquable de convergence évolutive biochimique indépendante entre espèces de règnes différents. ABSTRACT Betalains are violet and yellow chromo-alkaloid pigments present in plants belonging to the order Caryophyllales and also in the fungal genera Amanita and Hygrocybe. Their short biosynthetic pathway is chemically well understood since many years, but enzymes involved in the plant pathway are still uncharacterized. The DOPA-dioxygenase from Amanita muscaria was identified (Girod and Zryd, 1991a), but numerous attempts to identify a plant homologue to the corresponding gene, failed. In order to isolate betalain-specific genes in plants, subtractive cDNA libraries were built with total RNA from white and yellow and respectively, violet immature petals from Portulaca grandiflora (Pg) genotypes. Colour-specific clones were first detected by Northern blot analysis using RNA from white and coloured petals. Positive candidates were submitted to further transcription analysis in coloured, green stems and leaves in order to assess their specific expression. Two full-length mRNAs showed a correlated expression with betalain accumulation in tissues. One of them, A.16, encodes a putative acyl-Coenzyme A oxidase (ACX), but missing the FAD binding domain essential for the ACX activity. Thus, all attempts to demonstrate its function failed. The role of this protein in the betalain biosynthesis pathway, if any, is still unknown. The second betalain-specific mRNA, L.6 (isolated by Zaiko, 2000) shows a homology with a LigB domain (pfam02900) from a bacterial extradiol 4,5-dioxygenase. It was then renamed DODA (DOPA-dioxygenase). DODA was identified in silico as a highly conserved extradiol dioxygenase due to the strict conservation of its peptidic sequence with LigB catalytic residues and iron-binding cofactor residues. Southern blot analysis showed that this gene is a single copy-gene in Pg. Transient expression of DODA protein through biolistic transformation of Pg white petals produced violet or yellow spots in individual cells. HPLC analysis of these spots showed an identity with betalain pigments present naturally in yellow and violet Pg petals, thus confirming the complementation of the recessive cc allele present in Pg white petals by Pg DODA gene. DODA homologues were identified in numerous plant species including those without betalain. Alignment of these homologues allowed the identification of a betalain-specific pattern beside a highly conserved catalytic histidine. This [H-P-(S,A)-(N,D)-x-T-P] pattern replaces a [H-N-L-R] pattern strictly conserved in non-betalain plants and a [H-N-L-x] pattern present in all bacterial and archaebacterial homologues. Preliminary three-dimensional modeling of the active site of Pg DODA and its Physcomitrella patens moss homologue revealed the importance of this betalain-specific pattern for the substrate accessibility to the DODA active site. DODA phylogenetic analysis confirmed the separate evolution of this protein in betalain-producing plants. We conclude that betalain pigments appeared in a unique ancestor of the Caryophyllales order in which anthocyanin biosynthetic pathway was impaired, by a modification of enzymes of the DODA family for substrate affinity. The Pg DODA protein has no sequence similarity with Amanita muscaria DODA, despite the fact that they both complement Pg white petals for their pigmentation. Betalain biosynthesis is an interesting example of independent biochemical evolutionary convergence between species from different kingdoms.

Tectonic and metamorphic evolution of the Central Himalayan Domain in Southeast Zanskar (Kashmir, India)

La région du Zanskar, étudiée dans le cadre de ce travail, se situe au passage entre deux domaines himalayens fortement contrastés, la Séquence Cristalline du Haut Himalaya (HHCS), composée de roches métamorphiques et l'Himalaya Tethysien (TH), composé de séries sédimentaires. La transition entre ces deux domaines est marquée par une structure tectonique majeure, la Zone de Cisaillement du Zanskar (ZSZ), au sein de laquelle on observe une augmentation extrêmement rapide, mais néanmoins graduelle, du degré du métamorphisme entre le TH et le HHCS. Il a été établi que le HHCS n'est autre que l'équivalent métamorphique des séries sédimentaires de la base du TH. C'est principalement lors d'un épisode de mise en place de nappes à vergence sudouest, entre l'Eocène moyen et l'Oligocène, que les séries sédimentaires de la base du TH ont été entraînées en profondeur où elles ont subi un métamorphisme de type barrovien. Au début du Miocène, le HHCS à été exhumé en direction du sud-ouest sous forme d'une grande nappe, délimitée a sa base par le MCT (principal chevauchement central) et à son sommet par la Zone de Cisaillement du Zanskar. L'ensemble des zones barroviennes, de la zone à biotite jusqu'à la zone à disthène, a été cisaillée par les mouvements en faille normale au sommet du HHCS et se retrouve actuellement sur une épaisseur d'environ 1 kilomètre au sein de la ZSZ. La décompression associée à l'exhumation du HHCS a provoqué la fusion partielle d'une partie du HHCS et a donné naissance à des magmas de composition leucogranitiques. Grâce à la géothermobarometrie, et connaissant la géométrie de la ZSZ, il nous a été possible de déterminer que le rejet le long de cette structure d'extension est d'au moins 35?9 kilomètres. Une série d'arguments nous permet cependant de suggérer que ce rejet aurait pu être encore bien plus important (~100km). Les données géochronologiques nous permettent de contraindre la durée des mouvements d'extension le long de la ZSZ à 2.4?0.2 Ma entre 22.2?0.2 Ma et 19.8?0.1 Ma. Ce travail apporte de nouvelles données sur les processus métamorphiques, magmatiques et tectoniques liés aux phénomènes d'extension syn-orogeniques.<br/><br/>The southeastern part of Zanskar is located at the transition between two major Himalayan domains of contrasting metamorphic grade, the High Himalayan Crystalline Sequence (HHCS) and the Tethyan Himalaya (TH). The transition between the TH and the HHCS is marked by a very rapid, although perfectly gradual, decrease in metamorphic grade, which coincides with a major tectonic structure, the Zanskar Shear Zone (ZSZ). It is now an established fact that the relation between the HHCS and the TH is not one of basement-cover type, but that the metasedimentary series of the HHCS represent the metamorphic equivalent of the lowermost sedimentary series of the TH. This transformation of sedimentary series into metamorphic rocks, and hence the differentiation between the TH and the HHCS, is the consequence of crustal thickening associated to the formation of large scale southwest vergent nappes within the Tethyan Himalaya sedimentary series. This, Middle Eocene to Oligocene, episode of crustal thickening and associated Barrovian metamorphism is followed, shortly after, by the exhumation of the HHCS as a, large scale, south-west vergent, nappe. Foreword The exhumation of the HHCS nappe is marked by the activation of two contemporaneous structures, the Main Central Thrust at its base and the Zanskar Shear Zone at its top. Extensional movements along the ZSZ, caused the Barrovian biotite to the kyanite zones to be sheared and constricted within the ~1 km thick shear zone. Decompression associated with the exhumation of the HHCS induced the formation of leucogranitic magmas through vapour-absent partial melting of the highest-grade rocks. The combination of geothermobarometric data with a geometric model of the ZSZ allowed us to constrain the net slip at the top of the HHCS to be at least 35?9 kilometres. A set of arguments however suggests that these movements might have been much more important (~ 100 km). Geochronological data coupled with structural observations constrain the duration of ductile shearing along the ZSZ to 2.4?0.2 Ma between 22.2?0.2 Ma and 19.8?0.1 Ma. This study also addresses the consequences of synorogenic extension on the metamorphic, tectonic and magmatic evolution of the upper parts of the High Himalayan Crystalline Sequence.

Génération d'une souris dépourvue du gène VIT32 de manière conditionnelle: étude du phénotype rénal chez les souris dépourvues de RGS2

Résumé Dans le rein, la vasopressine possède un rôle essentiel dans la régulation fine du transport d'eau et participe au contrôle de la réabsorption du sodium. Cette action est conduite par l'activation du récepteur à la vasopressine V2R situé dans l'anse de Henle, dans le tubule connecteur et dans le canal collecteur du néphron des rongeurs et conduit à la formation d'AMPc entraînant un mécanisme d'action caractérisé par deux phases distinctes. Le premier effet de la vasopressine est non génomique et a lieu rapidement après l'activation du récepteur, la deuxième phase est plus tardive et possède la caractéristique de moduler la transcription d'un réseau de gènes. Parmi ces gènes, plusieurs sont directement impliqués dans le transport d'eau et de sodium, comme l'Aqp2 et 3, ENaC et la Na,K-ATPase. L'identification des effets de la voie de signalisation de la vasopressine représente un point crucial pour la compréhension des mécanismes moléculaires de la réabsorption de l'eau et du sodium dans le néphron. L'analyse en série de l'expression de gènes (SAGE) réalisée en 2001 dans notre laboratoire a permis de caractériser le transcriptome dépendant de la vasopressine dans la lignée cellulaire mpkCCDc14,a dérivée du canal collecteur cortical (CCD) de souris. Deux des transcrits induits par la vasopressine (VIT) ont fait l'objet des études de ce travail de thèse. Le premier est VIT32 (Vasopressin induced transcript 32) qui code pour une protéine ne possédant aucune homologie avec des domaines protéiques dont la fonction est connue. Dans le système d'expression de l'ovocyte de Xenopus laevis, VIT32 induit la maturation des ovocytes et diminue le courant sensible à l'amiloride de manière dépendante de la voie des MAPK. Dans les mpkCCDc14, l'inhibition de la voie des MAPK diminue le courant sodique en diminuant l'activité de la Na,K-ATPase, mais sans modifier le courant d'ENaC. Ainsi la voie de signalisation des MAPK peut avoir des cibles différentes suivant le système dans lequel elle est étudiée. C'est pourquoi nous avons décidé de poursuivre l'étude de VIT32 dans un contexte physiologique en créant une souris dépourvue du gène codant pour VIT32 de manière conditionnelle (conditional knockout). La première partie de cette thèse a donc consisté à générer cette souris. Le deuxième transcrit induit par la vasopressine qui a été étudié dans cette thèse est RGS2 (Regulator of G protein Signaling 2). In vitro, il a été montré que RGS2 inhibe des voies de signalisation dépendantes de récepteurs couplés à des protéines Gq et Gs. Dans notre étude, nous avons montré que dans le néphron de rein de souris, RGS2 est colocalisé avec V2R. In vivo, la vasopressine sécrétée lors d'une restriction en eau imposée à des souris augmente l'expression de RGS2. De plus, l'accumulation d'AMPc engendrée par l'action de la vasopressine sur les canaux collecteurs est significativement plus grande chez les souris dépourvues de RGS2 (rgs2 -/-). Cette induction de la signalisation de la vasopressine est corrélée à une augmentation de la réabsorption d'eau chez les souris rgs2 -/-. Ainsi RGS2 serait impliqué dans le rétrocontrôle négatif de la voie de signalisation de la vasopressine. Abstract In the kidney, vasopressin plays a key role in the control of water balance and participates in salt reabsorption. These actions are induced by the activation of V2 vasopressin receptor (V2R) located in the loop of Henle, in the connecting tubule and in the collecting duct leading to an increase in intracellular cAMP levels. The V2R-mediated vasopressin action elicits a rapid, non-genomic effect, during which water and salt reabsorption is rapidly increased and a late or genomic effect characterised by the long-term regulation of water and salt reabsorption through the transcriptional activation of a gene network that includes Aqp2, Aqp3, ENaC and Na,K-ATPase. Serial analysis of gene expression (SAGE) performed in 2001 in our laboratory characterised the vasopressin induced transcripts (VIT) in the mpkCCDc14 cell line. Two of them are studied in this thesis. The first one is VIT32 (Vasopressin induced transcript 32) that encodes a protein that has no homology with any protein domain of known function. In the Xenopus laevis oocyte, VIT32 induces oocyte maturation and downregulates the ENaC amiloride sensitive current via the activation of the MAPK pathway. In mpkCCDc14 cell line, the MAPK pathway inhibition leads to a decrease of Na,K-ATPase activity without affecting ENaC current. Therefore, the MAPK pathway can act on different targets depending on the cellular context. Thus, we decided to investigate the function of VIT32 in its physiological environment by performing a conditional knockout mouse of VIT32. The first part of this thesis consisted in generating this mouse. The second studied vasopressin induced transcript is RGS2 (Regulator of G protein Signaling 2). In vitro, RGS2 has been shown to inhibit Gq and Gs protein-coupled receptor pathway. In our study we show that RGS2 is co-localized with V2R in the mouse nephron. In vivo, vasopressin secreted during water restriction up-regulates RGS2 expression. Moreover, vasopressin-dependant accumulation of CAMP is significantly increased in the cortical collecting duct of RGS2 knockout mice. This increase is correlated with an increase in water reabsorption. RGS2 could be involved in the negative feedback regulation of V2R signalling. Résumé tout public Le corps humain est composé d'environ 60% d'eau répartie à l'intérieur et à l'extérieur des cellules de notre organisme. Les cellules, unités fondamentales du vivant, puisent l'oxygène et les nutriments indispensables à leur fonctionnement dans le liquide extracellulaire. La composition du milieu doit être constante, car les variations peuvent perturber considérablement et parfois fatalement la fonction des cellules. Ainsi les organismes pluricellulaires ont développé des mécanismes permettant de contrôler la constance du milieu extracellulaire afin de maintenir l'état d'équilibre nommé homéostasie. Le rein joue un rôle majeur dans cette homéostasie grâce à sa capacité de réabsorber l'eau et les solutés en fonction des besoins de l'organisme. Cette fonction du rein est régulée par différentes hormones comme la vasopressine, qui permet de contrôler la réabsorption fine de l'eau et des solutés. Dans leurs membranes, les cellules possèdent des récepteurs leur permettant de répondre aux signaux extracellulaires comme le sont entre autres les hormones. Ainsi les cellules sensibles à la vasopressine possèdent un récepteur nommé V2R qui permet d'intégrer les signaux de la vasopressine en déclenchant tout une cascade d'événements conduisant à une modification de l'expression de certaines protéines impliquées directement ou non dans la réabsorption de l'eau et des solutés. Une étude précédente élaborée au sein de notre laboratoire a permis de répertorier les protéines dont l'expression est augmentée par de la vasopressine. Deux de ces protéines ont fait l'objet des études de cette thèse. La première protéine induite par la vasopressine est VIT32 (Vasopressin induced transcript 32). Cette protéine est entre autres impliquée dans la réabsorption du sodium, mais la fonction précise de VIT32 dans ce transport n'a pas pu être déterminée. Une des approches possibles pour l'étude de la fonction d'une protéine est de supprimer son expression chez la souris et d'étudier les conséquences de son absence. Ces souris sont appelées des souris knockout, puisque la protéine en question ne peut plus agir. La première partie de cette thèse a donc consisté à générer une souris dépourvue du gène de VIT32. La deuxième protéine étudiée est RGS2 (Regulator of G protein Signaling 2). Cette protéine inhibe certaines voies de signalisation activées par différentes hormones. Dans cette partie du travail de thèse, nous avons pu mettre en évidence que RGS2 agit comme un inhibiteur de la voie de signalisation de la vasopressine. En modifiant cette signalisation, RGS2 serait donc un médiateur du contrôle de la réabsorption d'eau dans les cellules du rein sensibles à la vasopressine.

Evolution based on domain combinations: the case of glutaredoxins

Background: Protein domains represent the basic units in the evolution of proteins. Domain duplication and shuffling by recombination and fusion, followed by divergence are the most common mechanisms in this process. Such domain fusion and recombination events are predicted to occur only once for a given multidomain architecture. However, other scenarios may be relevant in the evolution of specific proteins, such as convergent evolution of multidomain architectures. With this in mind, we study glutaredoxin (GRX) domains, because these domains of approximately one hundred amino acids are widespread in archaea, bacteria and eukaryotes and participate in fusion proteins. GRXs are responsible for the reduction of protein disulfides or glutathione-protein mixed disulfides and are involved in cellular redox regulation, although their specific roles and targets are often unclear. Results: In this work we analyze the distribution and evolution of GRX proteins in archaea,bacteria and eukaryotes. We study over one thousand GRX proteins, each containing at least one GRX domain, from hundreds of different organisms and trace the origin and evolution of the GRX domain within the tree of life. Conclusion: Our results suggest that single domain GRX proteins of the CGFS and CPYC classes have, each, evolved through duplication and divergence from one initial gene that was present in the last common ancestor of all organisms. Remarkably, we identify a case of convergent evolution in domain architecture that involves the GRX domain. Two independent recombination events of a TRX domain to a GRX domain are likely to have occurred, which is an exception to the dominant mechanism of domain architecture evolution.

T-Coffee: a web server for the multiple sequence alignment of protein and RNA sequences using structural information and homology extension

This article introduces a new interface for T-Coffee, a consistency-based multiple sequence alignment program. This interface provides an easy and intuitive access to the most popular functionality of the package. These include the default T-Coffee mode for protein and nucleic acid sequences, the M-Coffee mode that allows combining the output of any other aligners, and template-based modes of T-Coffee that deliver high accuracy alignments while using structural or homology derived templates. These three available template modes are Expresso for the alignment of protein with a known 3D-Structure, R-Coffee to align RNA sequences with conserved secondary structures and PSI-Coffee to accurately align distantly related sequences using homology extension. The new server benefits from recent improvements of the T-Coffee algorithm and can align up to 150 sequences as long as 10 000 residues and is available from both http://www.tcoffee.org and its main mirror http://tcoffee.crg.cat.

The impact of balancing on problem hardness in a highly structured domain

Random problem distributions have played a key role in the study and design of algorithms for constraint satisfaction and Boolean satisfiability, as well as in ourunderstanding of problem hardness, beyond standard worst-case complexity. We consider random problem distributions from a highly structured problem domain that generalizes the Quasigroup Completion problem (QCP) and Quasigroup with Holes (QWH), a widely used domain that captures the structure underlying a range of real-world applications. Our problem domain is also a generalization of the well-known Sudoku puz- zle: we consider Sudoku instances of arbitrary order, with the additional generalization that the block regions can have rectangular shape, in addition to the standard square shape. We evaluate the computational hardness of Generalized Sudoku instances, for different parameter settings. Our experimental hardness results show that we can generate instances that are considerably harder than QCP/QWH instances of the same size. More interestingly, we show the impact of different balancing strategies on problem hardness. We also provide insights into backbone variables in Generalized Sudoku instances and how they correlate to problem hardness.

Langevin equations with multiplicative noise: Application to domain growth

Langevin Equations of Ginzburg-Landau form, with multiplicative noise, are proposed to study the effects of fluctuations in domain growth. These equations are derived from a coarse-grained methodology. The Cahn-Hiliard-Cook linear stability analysis predicts some effects in the transitory regime. We also derive numerical algorithms for the computer simulation of these equations. The numerical results corroborate the analytical predictions of the linear analysis. We also present simulation results for spinodal decomposition at large times.

IPSec in 3G packet switched domain

Diplomityö käsittelee IPSec-protokollan (IP Security Protocol) implementointia UMTS:n (Universal Mobile Telecommunications System) pakettikytkentäiseen verkkoon. Runkoverkkoa käytetään mobiilikäyttäjän datan siirtämiseen sekä verkkoelementtien väliseen ohjausinformaation välitykseen. Koska UMTS:n runkoverkot ovat IP-pakettikytkentäisiä verkkoja, IPSec-protokollaa voidaan käyttää lähetettyjen IP-datasähkeiden suojaamiseen. IPSec- ja IKE-protokollien (Internet Key Exchange) käyttö on koettu monimutkaiseksi kiinteissä verkoissa. Tämän saman ongelman edessä tulevat olemaan myös operaattorit, kun he alkavat rakentaa UMTS-verkkojaan. On kuitenkin muistettava se, että tulevaisuudessa lähes kaikki data mukaanlukien ääni ja video on tarkoitus siirtää IP-protokollan avulla. IP-teknologiaan perustuva tiedonsiirron kasvu lisää IPSec-protokollan merkitystä ei ainoastaan runkoverkossa mutta myös radioliityntäverkoissa sekä SS7-merkinantoverkoissa (Signaling System No. 7). Diplomityö on tehty osaksi diplomi-insinöörin tutkintoa Lappeenrannan teknillisessä yliopistossa. Työ on tehty Nokia Networksin palveluksessa Helsingissä, vuosien 2002 ja 2003 välisenä aikana.

Ras-association domain of sorting nexin 27 is critical for regulating expression of GIRK potassium channels

G protein-gated inwardly rectifying potassium (GIRK) channels play an important role in regulating neuronal excitability. Sorting nexin 27b (SNX27b), which reduces surface expression of GIRK channels through a PDZ domain interaction, contains a putative Ras-association (RA) domain with unknown function. Deleting the RA domain in SNX27b (SNX27b-DRA) prevents the down-regulation of GIRK2c/GIRK3 channels. Similarly, a point mutation (K305A) in the RA domain disrupts regulation of GIRK2c/GIRK3 channels and reduces H-Ras binding in vitro. Finally, the dominant-negative H-Ras (S17N) occludes the SNX27b-dependent decrease in surface expression of GIRK2c/GIRK3 channels. Thus, the presence of a functional RA domain and the interaction with Ras-like G proteins comprise a novel mechanism for modulating SNX27b control of GIRK channel surface expression and cellular excitability.

Protein homology reveals new targets for bioactive small molecules.

MOTIVATION: The functional impact of small molecules is increasingly being assessed in different eukaryotic species through large-scale phenotypic screening initiatives. Identifying the targets of these molecules is crucial to mechanistically understand their function and uncover new therapeutically relevant modes of action. However, despite extensive work carried out in model organisms and human, it is still unclear to what extent one can use information obtained in one species to make predictions in other species. RESULTS: Here, for the first time, we explore and validate at a large scale the use of protein homology relationships to predict the targets of small molecules across different species. Our results show that exploiting target homology can significantly improve the predictions, especially for molecules experimentally tested in other species. Interestingly, when considering separately orthology and paralogy relationships, we observe that mapping small molecule interactions among orthologs improves prediction accuracy, while including paralogs does not improve and even sometimes worsens the prediction accuracy. Overall, our results provide a novel approach to integrate chemical screening results across multiple species and highlight the promises and remaining challenges of using protein homology for small molecule target identification. AVAILABILITY AND IMPLEMENTATION: Homology-based predictions can be tested on our website http://www.swisstargetprediction.ch. CONTACT: david.gfeller@unil.ch or vincent.zoete@isb-sib.ch. SUPPLEMENTARY INFORMATION: Supplementary data are available at Bioinformatics online.

RasGAP Shields Akt from Deactivating Phosphatases in Fibroblast Growth Factor Signaling but Loses This Ability Once Cleaved by Caspase-3.

Fibroblast growth factor receptors (FGFRs) are involved in proliferative and differentiation physiological responses. Deregulation of FGFR-mediated signaling involving the Ras/PI3K/Akt and the Ras/Raf/ERK MAPK pathways is causally involved in the development of several cancers. The caspase-3/p120 RasGAP module is a stress sensor switch. Under mild stress conditions, RasGAP is cleaved by caspase-3 at position 455. The resulting N-terminal fragment, called fragment N, stimulates anti-death signaling. When caspase-3 activity further increases, fragment N is cleaved at position 157. This generates a fragment, called N2, that no longer protects cells. Here, we investigated in Xenopus oocytes the impact of RasGAP and its fragments on FGF1-mediated signaling during G2/M cell cycle transition. RasGAP used its N-terminal Src homology 2 domain to bind FGFR once stimulated by FGF1, and this was necessary for the recruitment of Akt to the FGFR complex. Fragment N, which did not associate with the FGFR complex, favored FGF1-induced ERK stimulation, leading to accelerated G2/M transition. In contrast, fragment N2 bound the FGFR, and this inhibited mTORC2-dependent Akt Ser-473 phosphorylation and ERK2 phosphorylation but not phosphorylation of Akt on Thr-308. This also blocked cell cycle progression. Inhibition of Akt Ser-473 phosphorylation and entry into G2/M was relieved by PHLPP phosphatase inhibition. Hence, full-length RasGAP favors Akt activity by shielding it from deactivating phosphatases. This shielding was abrogated by fragment N2. These results highlight the role played by RasGAP in FGFR signaling and how graded stress intensities, by generating different RasGAP fragments, can positively or negatively impact this signaling.

Allosteric conversation in the androgen receptor ligand-binding domain surfaces

Androgen receptor (AR) is a major therapeutic target that plays pivotal roles in prostate cancer (PCa) and androgen insensitivity syndromes. We previously proposed that compounds recruited to ligand-binding domain (LBD) surfaces could regulate AR activity in hormone-refractory PCa and discovered several surface modulators of AR function. Surprisingly, the most effective compounds bound preferentially to a surface of unknown function [binding function 3 (BF-3)] instead of the coactivator-binding site [activation function 2 (AF-2)]. Different BF-3 mutations have been identified in PCa or androgen insensitivity syndrome patients, and they can strongly affect AR activity. Further, comparison of AR x-ray structures with and without bound ligands at BF-3 and AF-2 showed structural coupling between both pockets. Here, we combine experimental evidence and molecular dynamic simulations to investigate whether BF-3 mutations affect AR LBD function and dynamics possibly via allosteric conversation between surface sites. Our data indicate that AF-2 conformation is indeed closely coupled to BF-3 and provide mechanistic proof of their structural interconnection. BF-3 mutations may function as allosteric elicitors, probably shifting the AR LBD conformational ensemble toward conformations that alter AF-2 propensity to reorganize into subpockets that accommodate N-terminal domain and coactivator peptides. The induced conformation may result in either increased or decreased AR activity. Activating BF-3 mutations also favor the formation of another pocket (BF-4) in the vicinity of AF-2 and BF-3, which we also previously identified as a hot spot for a small compound. We discuss the possibility that BF-3 may be a protein-docking site that binds to the N-terminal domain and corepressors. AR surface sites are attractive pharmacological targets to develop allosteric modulators that might be alternative lead compounds for drug design.

Domain matched epitaxial growth of Bi1.5Zn1Nb1.5O7 thin films by pulsed laser deposition

Bi1.5Zn1Nb1.5O7 (BZN) epitaxial thin films were grown by pulsed laser deposition on Al2O3 with a double ZnO buffer layer through domain matching epitaxy (DME) mechanism. The pole figure analysis and reciprocal space mapping revealed the single crystalline nature of the thin film. The pole figure analysis also shows a 60º twinning for the (222) oriented crystals. Sharp intense spots in the SAED pattern also indicate the high crystalline nature of BZN thin film. The Fourier filtered HRTEM images of the BZN-ZnO interface confirms the domain matched epitaxy of BZN with ZnO buffer. An electric field dependent dielectric tunability of 68% was obtained for the BZN thin films with inter digital capacitors patterned over the film.

Microtubule-associated protein 6 mediates neuronal connectivity through Semaphorin 3E-dependent signalling for axonal growth.

Structural microtubule associated proteins (MAPs) stabilize microtubules, a property that was thought to be essential for development, maintenance and function of neuronal circuits. However, deletion of the structural MAPs in mice does not lead to major neurodevelopment defects. Here we demonstrate a role for MAP6 in brain wiring that is independent of microtubule binding. We find that MAP6 deletion disrupts brain connectivity and is associated with a lack of post-commissural fornix fibres. MAP6 contributes to fornix development by regulating axonal elongation induced by Semaphorin 3E. We show that MAP6 acts downstream of receptor activation through a mechanism that requires a proline-rich domain distinct from its microtubule-stabilizing domains. We also show that MAP6 directly binds to SH3 domain proteins known to be involved in neurite extension and semaphorin function. We conclude that MAP6 is critical to interface guidance molecules with intracellular signalling effectors during the development of cerebral axon tracts.