Myc-mediated control of gene transcription in cancer cells

The Myc oncoproteins belong to a family of transcription factors composed by Myc, N-Myc and L-Myc. The most studied components of this family are Myc and N-Myc because their expressions are frequently deregulated in a wide range of cancers. These oncoproteins can act both as activators or repressors of gene transcription. As activators, they heterodimerize with Max (Myc associated X-factor) and the heterodimer recognizes and binds a specific sequence elements (E-Box) onto gene promoters recruiting histone acetylase and inducing transcriptional activation. Myc-mediated transcriptional repression is a quite debated issue. One of the first mechanisms defined for the Myc-mediated transcriptional repression consisted in the interaction of Myc-Max complex Sp1 and/or Miz1 transcription factors already bound to gene promoters. This interaction may interfere with their activation functions by recruiting co-repressors such as Dnmt3 or HDACs. Moreover, in the absence of , Myc may interfere with the Sp1 activation function by direct interaction and subsequent recruitment of HDACs. More recently the Myc/Max complex was also shown to mediate transcriptional repression by direct binding to peculiar E-box. In this study we analyzed the role of Myc overexpression in Osteosarcoma and Neuroblastoma oncogenesis and the mechanisms underling to Myc function. Myc overexpression is known to correlate with chemoresistance in Osteosarcoma cells. We extended this study by demonstrating that c-Myc induces transcription of a panel of ABC drug transporter genes. ABCs are a large family trans-membrane transporter deeply involved in multi drug resistance. Furthermore expression levels of Myc, ABCC1, ABCC4 and ABCF1 were proved to be important prognostic tool to predict conventional therapy failure. N-Myc amplification/overexpression is the most important prognostic factor for Neuroblastoma. Cyclin G2 and Clusterin are two genes often down regulated in neuroblastoma cells. Cyclin G2 is an atypical member of Cyclin family and its expression is associated with terminal differentiation and apoptosis. Moreover it blocks cell cycle progression and induces cell growth arrest. Instead, CLU is a multifunctional protein involved in many physiological and pathological processes. Several lines of evidences support the view that CLU may act as a tumour suppressor in Neuroblastoma. In this thesis I showed that N-Myc represses CCNG2 and CLU transcription by different mechanisms. • N-Myc represses CCNG2 transcription by directly interacting with Sp1 bound in CCNG2 promoter and recruiting HDAC2. Importantly, reactivation of CCNG2 expression through epigenetic drugs partially reduces N-Myc and HDAC2 mediated cell proliferation. • N-Myc/Max complex represses CLU expression by direct binding to a peculiar E-box element on CLU promoter and by recruitment of HDACs and Polycomb Complexes, to the CLU promoter. Overall our findings strongly support the model in which Myc overexpression/amplification may contribute to some aspects of oncogenesis by a dual action: i) transcription activation of genes that confer a multidrug resistant phenotype to cancer cells; ii), transcription repression of genes involved in cell cycle inhibition and cellular differentiation.

In vivo- und In vitro-DNA-Verpackung in virusähnliche Partikel des Humanen Papillomvirus Typ 33

Die Rolle der DNA-Bindungsdomäne der Kapsidproteine L1 und L2 humaner Papillomviren (HPV) wird bezüglich der in vitro DNA-Verpackung kontrovers diskutiert und ist für die in vivo DNA-Verpackung noch ungeklärt. Ich konnte zeigen, dass die L1 Proteine der HPV Typen 16, 18 und 33 DNA binden, nicht aber das HPV33 L2 Protein. Die DNA-Bindungsdomäne habe ich auf die letzten sieben Aminosäuren des Carboxyterminus eingegrenzt. In Funktionsanalysen zeigte ich, dass die DNA-Bindungsdomäne des L1 Proteins für den Einschluss von Markerplasmid DNA in Kapside in einem in vivo Ansatz essentiell ist, nicht aber für eine in vitro DNA-Verpackung. Das L2 Protein, das in Kapside eingebaut wurde, denen die L1 DNA-Bindungsdomäne fehlte, konnte die DNA-Verpackung nicht aufrechterhalten.Zusätzlich habe ich die Infektiösität in vitro und in vivo hergestellter DNA-haltiger Kapside (Pseudovirionen) verglichen. Dabei konnte ich zeigen, dass in vivo gewonnene Pseudovirionen, die DNA in Form von Chromatin enthalten, bis zu fünffach infektiöser sind als Pseudovirionen, die in vitro hergestellt wurden und histonfreie DNA enthalten. Biochemische und strukturelle Unterschiede konnten zwischen den zwei Arten von Pseudovirionen nicht festgestellt werden. Chromatin scheint demzufolge die Infektiösität der Pseudovirionen zu verstärken.

Tail bridging vs. patchiness

The subject of this thesis are the interactions between nucleosome core particles (NCPs). NCPs are the primary storage units of DNA in eucaryotic cells. Each NCP consists of a core of eight histone proteins and a strand of DNA, which is wrapped around about two times. Each histone protein has a terminal tail passing over and between the superhelix of the wrapped DNA. Special emphasis was placed on the role of the histone tails, since experimental ndings suggest that the tails have a great in uence on the mutual attraction of the NCPs. In those experiments Mangenot et al. observe a dramatic change in the con guration of the tails, which is accompanied by evidence of mutual attraction between NCPs, when a certain salt concentration is reached. Existing models used in the theoretical approaches and in simulations focus on the description of the histone core and the wrapped DNA, but neglect the histone tails. We introduce the multi chain complex as a new simulation model. Here the histone core and the wrapping DNA are modelled via a charged sphere, while the histone tails are represented by oppositely charged chains grafted on the sphere surface. We start by investigating the parameter space describing a single NCP. The Debye-Huckel potential is used to model the electrostatic interactions and to determine the e ective charge of the NCP core. This value is subsequently used for a study of the pairinteraction of two NCPs via an extensive Molecular Dynamics study. The monomer distribution of the full chain model is investigated. The existence of tail bridges between the cores is demonstrated. Finally, by discriminating between bridging and non-bridging con gurations, we can show that the effect of tail bridging between the spheres does indeed account for the observed attraction. The full chain model can serve as a model to study the acetylation of the histone tails of the nucleosome. The reduction of the charge fraction of the tails, that corresponds to the process of acetylation, leads to a reduction or even the disappearance of the attraction. A recent MC study links this e ect to the unfolding of the chromatin ber in the case of acetylated histone tails. In this case the acetylation of the histone tails leads to the formation of heterochromatin, and one could understand how larger regions of the genetic information could be inactivated through this mechanism.

Mechanismen der Caveolin-Genregulation in neuralen Zellsystemen

Caveolae sind vesikuläre Invaginationen der eukaryontischen Zellmembran, die bei einer Vielzahl zellbiologischer Prozesse eine bedeutende Rolle spielen. Die strukturellen und funktionellen Hauptbestandteile der Caveolae sind die Caveolin-Proteine, welche von drei homologen Genen (Caveolin-1,-2,-3) kodiert werden. Die Caveoline stellen die Struktur-Organisatoren der Caveolae dar, und regulieren direkt die Aktivität von zahlreichen Caveolae-assoziierten Rezeptorproteinen und Signalmolekülen. Oftmals werden die pleiotropen Effekte der Caveoline über eine Veränderung der Caveolin-Genexpressionsstärke moduliert. In der vorliegenden Arbeit wurden drei unterschiedliche biologische Steuerfaktoren identifiziert, unter deren Kontrolle die Caveolin-Genexpression in neuralen Zellsystemen steht. Bei diesen Faktoren handelt es sich um das Steroidhormon Oestrogen und seine Rezeptoren, den Wachstumsfaktor TGFa und den sekundären Botenstoff zyklisches AMP (cAMP). Oestrogen wirkt über die Aktivierung von Oestrogen-Rezeptoren (ERs) im zentralen Nervensystem in der Regel als neurotropher Faktor. In der vorliegenden Arbeit konnte erstmalig gezeigt werden, daß in humanen Neuroblastom-Zellen (SK-N-MC) die stabile, rekombinante Expression des ERa-Subtyps zu einer drastischen Reduktion der Caveolin-1/-2-Transkription führt, und daß in der Folge die zelluläre Caveolin-Biosynthese eingestellt wird. Eine Analyse des Caveolin-1-Gens ergab, daß einhergehend mit der Inaktivierung der Caveolin-1-Transkription eine Vielzahl der im Promoter enthaltenen CpG-Dinukleotide methyliert vorliegen. Durch pharmakologische Inhibition der nukleären DNA-Methyltransferasen sowie der Histon-Deacetylasen konnte die Caveolin-1-Transkription teilweise wiederhergestellt werden. Diese Befunde lassen auf die Existenz eines DNA-Methylierungs-abhängigen Stilllegungsmechanismus der Caveolin-Genexpression durch ERa schließen. Dagegen führte die Überexpression des ERb-Subtyps in SK-N-MC-Zellen zu keiner Veränderung der Caveolin-1/-2-Expression. Interessanterweise wurde die supprimierende Wirkung des ERa durch die gleichzeitige Überexpression des ERb vollständig aufgehoben. Der mitogene Wachstumsfaktor TGFa wurde als zweites extrazelluläres Signalmolekül identifiziert, welches eine Reduktion der Caveolin-1/-2-Genexpression bewirkt. In primären kortikalen Astrozyten konnte gezeigt werden, daß TGFa seine supprimierende Wirkung auf die Caveolin-1-Expression partiell über die Aktivierung des PI3-Kinase-abhängigen Signalweges vermittelt. Zudem wurde die supprimierende Wirkung von TGFa durch einen Inhibitior der Histon-Deacetylasen relativiert. Daher scheinen sowohl für den ERa als auch für TGFa epigenetische Prozesse bei der Suppression der Caveolin-1-Genexpression eine entscheidende Rolle zu spielen. Intrazellulär wirkte neben der PI3-Kinase auch der Botenstoff cAMP in kortikalen Astrozyten als Suppressor der Caveolin-Genexpression. Es wäre denkbar, daß die Caveolin-Suppression funktioneller Bestandteil des seit langem etablierten Effekts der cAMP-induzierten Astrozyten-Differenzierung ist. Desweiteren wiesen der cAMP- und TGFa-abhängige Signalweg ein überlappendes, Gehirnregion-spezifisches Regulationsprofil der Caveolin-Expression in Astrozyten auf: während in Kortex und Striatum eine Regulation durch cAMP und TGFa erfolgte, blieb diese in Klein- und Zwischenhirn aus. Somit bewirken drei zentrale regulatorische Faktoren der Proliferation und Differenzierung neuraler Zellen eine Reduktion in der Konzentration der pleiotrop funktionellen Caveoline. Zukünftige Studien müssen zeigen, inwieweit die reduzierte Caveolin-Expression für die morphologischen und biochemischen Primärwirkungen dieser Faktoren während der Entwicklung und im Zuge der Tumorgenese mitverantwortlich ist. Außerdem könnten über die Beobachtungen der zellbiologischen Auswirkungen reduzierter Caveolin-Spiegel neue Erkenntnisse über die Funktion dieser Proteine gewonnen werden.

Molecular approach to Neurodegenerative Disorders: Role of Nociceptin/Orphanin FQ - NOP System in Parkinson and Epigenetic Mechanism in Alzheimer's Disease

With life expectancies increasing around the world, populations are getting age and neurodegenerative diseases have become a global issue. For this reason we have focused our attention on the two most important neurodegenerative diseases: Parkinson’s and Alzheimer’s. Parkinson’s disease is a chronic progressive neurodegenerative movement disorder of multi-factorial origin. Environmental toxins as well as agricultural chemicals have been associated with PD. Has been observed that N/OFQ contributes to both neurotoxicity and symptoms associated with PD and that pronociceptin gene expression is up-regulated in rat SN of 6-OHDA and MPP induced experimental parkinsonism. First, we investigated the role of N/OFQ-NOP system in the pathogenesis of PD in an animal model developed using PQ and/or MB. Then we studied Alzheimer's disease. This disorder is defined as a progressive neurologic disease of the brain leading to the irreversible loss of neurons and the loss of intellectual abilities, including memory and reasoning, which become severe enough to impede social or occupational functioning. Effective biomarker tests could prevent such devastating damage occurring. We utilized the peripheral blood cells of AD discordant monozygotic twin in the search of peripheral markers which could reflect the pathology within the brain, and also support the hypothesis that PBMC might be a useful model of epigenetic gene regulation in the brain. We investigated the mRNA levels in several genes involve in AD pathogenesis, as well DNA methylation by MSP Real-Time PCR. Finally by Western Blotting we assess the immunoreactivity levels for histone modifications. Our results support the idea that epigenetic changes assessed in PBMCs can also be useful in neurodegenerative disorders, like AD and PD, enabling identification of new biomarkers in order to develop early diagnostic programs.

Differential cell type-specific transcriptional regulation of the CYP1A1 gene

Cytochrome P450 1A1 (CYP1A1) monooxygenase plays an important role in the metabolism of environmental pollutants such as polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) and halogenated polycyclic aromatic hydrocarbons (HAHs). Oxidation of these compounds converts them to the metabolites that subsequently can be conjugated to hydrophilic endogenous entities e.g. glutathione. Derivates generated in this way are water soluble and can be excreted in bile or urine, which is a defense mechanism. Besides detoxification, metabolism by CYP1A1 may lead to deleterious effects since the highly reactive intermediate metabolites are able to react with DNA and thus cause mutagenic effects, as it is in the case of benzo(a) pyrene (B[a]P). CYP1A1 is normally not expressed or expressed at a very low level in the cells but it is inducible by many PAHs and HAHs e.g. by B[a]P or 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD). Transcriptional activation of the CYP1A1 gene is mediated by aryl hydrocarbon receptor (AHR), a basic-helix-loop-helix (bHLH) transcription factor. In the absence of a ligand AHR stays predominantly in the cytoplasm. Ligand binding causes translocation of AHR to the nuclear compartment, its heterodimerization with another bHLH protein, the aryl hydrocarbon nuclear translocator (ARNT) and binding of the AHR/ARNT heterodimer to a DNA motif designated dioxin responsive element (DRE). This process leads to the transcriptional activation of the responsive genes containing DREs in their regulatory regions, e.g. that coding for CYP1A1. TCDD is the most potent known agonist of AHR. Since it is not metabolized by the activated enzymes, exposure to this compound leads to a persisting activation of AHR resulting in diverse toxic effects in the organism. To enlighten the molecular mechanisms that mediate the toxicity of xenobiotics like TCDD and related compounds, the AHR-dependent regulation of the CYP1A1 gene was investigated in two cell lines: human cervix carcinoma (HeLa) and mouse hepatoma (Hepa). Study of AHR activation and its consequence concerning expression of the CYP1A1 enzyme confirmed the TCDD-dependent formation of the AHR/ARNT complex on DRE leading to an increase of the CYP1A1 transcription in Hepa cells. In contrast, in HeLa cells formation of the AHR/ARNT heterodimer and binding of a protein complex containing AHR and ARNT to DRE occurred naturally in the absence of TCDD. Moreover, treatment with TCDD did not affect the AHR/ARNT dimer formation and binding of these proteins to DRE in these cells. Even though the constitutive complex on DRE exists in HeLa, transcription of the CYP1A1 gene was not increased. Furthermore, the CYP1A1 level in HeLa cells remained unchanged in the presence of TCDD suggesting repressional mechanism of the AHR complex function which may hinder the TCDD-dependent mechanisms in these cells. Similar to the native, the mouse CYP1A1-driven reporter constructs containing different regulatory elements were not inducible by TCDD in HeLa cells, which supported a presence of cell type specific trans-acting factor in HeLa cells able to repress both the native CYP1A1 and CYP1A1-driven reporter genes rather than species specific differences between CYP1A1 genes of human and rodent origin. The different regulation of the AHR-mediated transcription of CYP1A1 gene in Hepa and HeLa cells was further explored in order to elucidate two aspects of the AHR function: (I) mechanism involved in the activation of AHR in the absence of exogenous ligand and (II) factor that repress function of the exogenous ligand-independent AHR/ARNT complex. Since preliminary studies revealed that the activation of PKA causes an activation of AHR in Hepa cells in the absence of TCDD, the PKA-dependent signalling pathway was the proposed endogenous mechanism leading to the TCDD-independent activation of AHR in HeLa cells. Activation of PKA by forskolin or db-cAMP as well as inhibition of the kinase by H89 in both HeLa and Hepa cells did not lead to alterations in the AHR interaction with ARNT in the absence of TCDD and had no effect on binding of these proteins to DRE. Moreover, the modulators of PKA did not influence the CYP1A1 activity in these cells in the presence and in the absence of TCDD. Thus, an involvement of PKA in the regulation of the CYP1A1 Gen in HeLa cells was not evaluated in the course of this study. Repression of genes by transcription factors bound to their responsive elements in the absence of ligands has been described for nuclear receptors. These receptors interact with protein complex containing histone deacetylase (HDAC), enzyme responsible for the repressional effect. Thus, a participation of histone deacetylase in the transcriptional modulation of CYP1A1 gene by the constitutively DNA-bound AHR/ARNT complex was supposed. Inhibition of the HDAC activity by trichostatin A (TSA) or sodium butyrate (NaBu) led to an increase of the CYP1A1 transcription in the presence but not in the absence of TCDD in Hepa and HeLa cells. Since amount of the AHR and ARNT proteins remained unchanged upon treatment of the cells with TSA or NaBu, the transcriptional upregulation of CYP1A1 gene was not due to an increased expression of the regulatory proteins. These findings strongly suggest an involvement of HDAC in the repression of the CYP1A1 gene. Similar to the native human CYP1A1 also the mouse CYP1A1-driven reporter gene transfected into HeLa cells was repressed by histone deacetylase since the presence of TSA or NaBu led to an increase in the reporter activity. Induction of reporter gene did not require a presence of the promoter or negative regulatory regions of the CYP1A1 gene. A promoter-distal fragment containing three DREs together with surrounding sequences was sufficient to mediate the effects of the HDAC inhibitors suggesting that the AHR/ARNT binding to its specific DNA recognition site may be important for the CYP1A1 repression. Histone deacetylase is recruited to the specific genes by corepressors, proteins that bind to the transcription factors and interact with other members of the HDAC complex. Western blot analyses revealed a presence of HDAC1 and the corepressors mSin3A (mammalian homolog of yeast Sin3) and SMRT (silencing mediator for retinoid and thyroid hormone receptor) in both cell types, while the corepressor NCoR (nuclear receptor corepressor) was expressed exclusively in HeLa cells. Thus the high inducibility of CYP1A1 in Hepa cells may be due to the absence of NCoR in these cells in contrast to the non-responsive HeLa cells, where the presence of NCoR would support repression of the gene by histone deacetylase. This hypothesis was verified in reporter gene experiments where expression constructs coding for the particular members of the HDAC complex were cotransfected in Hepa cells together with the TCDD-inducible reporter constructs containing the CYP1A1 regulatory sequences. An overexpression of NCoR however did not decrease but instead led to a slight increase of the reporter gene activity in the cells. The expected inhibition was observed solely in the case of SMRT that slightly reduced constitutive and TCDD-induced reporter gene activity. A simultaneous expression of NCoR and SMRT shown no further effects and coexpression of HDAC1 with the two corepressors did not alter this situation. Thus, additional factors that are likely involved in the repression of CYP1A1 gene by HDAC complex remained to be identified. Taking together, characterisation of an exogenous ligand independent AHR/ARNT complex on DRE in HeLa cells that repress transcription of the CYP1A1 gene creates a model system enabling investigation of endogenous processes involved in the regulation of AHR function. This study implicates HDAC-mediated repression of CYP1A1 gene that contributes to the xenobiotic-induced expression in a tissue specific manner. Elucidation of these processes gains an insight into mechanisms leading to deleterious effects of TCDD and related compounds.

Der Einfluss der Zellalterung auf die pathobiochemischen Prozesse von Morbus Alzheimer und weiteren neurodegenerativen Erkrankungen

Die am häufigsten auftretende altersassoziierte neurodegenerative Krankheit ist die Alzheimer Demenz. Ein mit entscheidender Schritt bei der Entstehung der Alzheimer Erkrankung ist wahrscheinlich die Produktion des Aβ-Peptids durch proteolytische Spaltung das Amyloid-Vorläuferproteins APP. In der vorliegenden Arbeit wurde die altersabhängige Prozessierung des Amyloid-Vorläuferproteins (APP) in Fibroblasten von Hautbiopsien von Familiärer Alzheimer-, Trisomie21 und Niemann-Pick Typ C-Krankheit untersucht. Die in dieser Arbeit verwendeten Fibroblasten wurden bis zum Erreichen des zellulären Wachstumsstopps (replikative Seneszenz) seriell passagiert und die Untersuchungen erfolgten an Zellen aufsteigender PDL. Dabei zeigte sich, dass, unabhängig von dem durch die Krankheit vorliegenden genetischen biochemischen Hintergrund, die APP-Prozessierung im Laufe der Zellalterung progressiv verringert wird. Die altersabhängig ansteigenden Cholesterinspiegel führten zu einer Reduktion der APP-Reifung und infolge dessen nahmen sowohl die intrazellulären APP-Spaltfragmente (C99, C83 und AICD) als auch die extrazellulären APP-Fragmente (sAPPα, sAPP) ab. Ebenso konnte gezeigt werden, dass die γ-Sekretase-Aktivität abnimmt. Dies war verbunden mit einem Rückgang der Proteinspiegel von Nicastrin und Presenilin, beides Komponenten des γ-Sekretase-Komplexes. Obwohl die Proteinexpression der α-Sekretase ADAM10 altersassoziiert konstant blieb, nahm die α-Sekretase-Aktivität mit steigendem Lebensalter ab. Erste Untersuchungen zeigten, dass die NAD+-abhängige Histon-Deacetylase SIRT1 eine wichtige Rolle im Bezug auf die α-Sekretase-Aktivität spielen könnte. Im Gegensatz zu den Abnahmen der α- und γ-Sekretase-Aktivitäten konnte eine erhöhte Aktivität der β-Sekretase in seneszenten Zellen beobachtet werden. Die mRNA-Menge und Proteinspiegel der ß-Sekretase BACE1 blieben dabei unverändert. Des Weiteren zeigte sich eine Zunahme der β-Sekretase-Aktivität bei Behandlung von jungen Zellen mit konditioniertem Medium seneszenter Zellen. Da sensezente Zellen einem Proliferationsstopp in der G1-Phase unterliegen, wurde der Einfluss des Zellzyklus-Inhibitors Aphidicolin auf die β-Sekretase untersucht. Hier wurde sowohl in IMR90 Fibroblasten als auch in Neuroblastoma-Zellen N2a eine Zunahme der β-Sekretase-Aktivität nach Zugabe der Inhibitoren beobachtet. Auch kommt es im Zuge der Alterung zu einer verstärkten Expression inflammatorischer Zytokine, die mit der Entstehung von Aβ-Peptiden in Verbindung gebracht werden. Deshalb wurde der Einfluss von Zytokinen auf die β-Sekretase-Aktivität untersucht. Die Zugabe von Interferon-γ und Interleukin 6 führte bei jungen IMR90-Zellen zu einem Anstieg der β-Sekretase-Aktivität, während bei alten Zellen keine Änderung zu verzeichnen war.

Innovative Strategies for the Synthesis of Biologically Active Small Molecules

The post genomic era, set the challenge to develop drugs that target an ever-growing list of proteins associated with diseases. However, an increase in the number of drugs approved every year is nowadays still not observed. To overcome this gap, innovative approaches should be applied in drug discovery for target validation, and at the same time organic synthetic chemistry has to find new fruitful strategies to obtain biologically active small molecules not only as therapeutic agents, but also as diagnostic tools to identify possible cellular targets. In this context, in view of the multifactorial mechanistic nature of cancer, new chimeric molecules, which can be either antitumor lead candidates, or valuable chemical tools to study molecular pathways in cancer cells, were developed using a multitarget-directed drug design strategy. According to this approach, the desired hybrid compounds were obtained by combining in a single chemical entity SAHA analogues, targeting histone deacetylases (HDACs), with substituted stilbene or terphenyl derivatives able to block cell cycle, to induce apoptosis and cell differentiation and with Sorafenib derivative, a multikinase inhibitor. The new chimeric derivatives were characterized with respect to their cytotoxic activity and their effects on cell cycle progression on leukemia Bcr-Abl-expressing K562 cell lines, as well as their HDACs inhibition. Preliminary results confirmed that one of the hybrid compounds has the desired chimeric profile. A distinct project was developed in the laboratory of Dr Spring, regarding the synthesis of a diversity-oriented synthesis (DOS) library of macrocyclic peptidomimetics. From a biological point of view, this class of molecules is extremely interesting but underrepresented in drug discovery due to the poor synthetic accessibility. Therefore it represents a valid challenge for DOS to take on. A build/couple/pair (B/C/P) approach provided, in an efficient manner and in few steps, the structural diversity and complexity required for such compounds.

Development of strategies for vascular damage repair in Pulmonary Arterial Hypertension

Pulmonary arterial hypertension (PAH) is a progressive and rare disease with so far unclear pathogenesis, limited treatment options and poor prognosis. Unbalance of proliferation and migration in pulmonary arterial smooth muscle cells (PASMCs) is an important hallmark of PAH. In this research Sodium butyrate (BU) has been evaluated in vitro and in vivo models of PAH. This histone deacetylase inhibitor (HDACi) counteracted platelet-derived growth factor (PDGF)-induced ki67 expression in PASMCs, and arrested cell cycle mainly at G0/G1 phases. Furthermore, BU reduced the transcription of PDGFRbeta, and that of Ednra and Ednrb, two major receptors in PAH progression. Wound healing and pulmonary artery ring assays indicated that BU inhibited PDGF-induced PASMC migration. BU strongly inhibited PDGF-induced Akt phosphorylation, an effect reversed by the phosphatase inhibitor calyculinA. In vivo, BU showed efficacy in monocrotaline-induced PAH in rats. Indeed, the HDACi reduced both thickness of distal pulmonary arteries and right ventricular hypertrophy. Besides these studies, Serial Analysis of Gene Expression (SAGE) has be used to obtain complete transcriptional profiles of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) isolated from PAH and Healthy subjects. SAGE allows quantitative analysis of thousands transcripts, relying on the principle that a short oligonucleotide (tag) can uniquely identify mRNA transcripts. Tag frequency reflects transcript abundance. We enrolled patients naïve for a specific PAH therapy (4 IPAH non-responder, 3 IPAH responder, 6 HeritablePAH), and 8 healthy subjects. Comparative analysis revealed that significant differential expression was only restricted to a hundred of down- or up-regulated genes. Interestingly, these genes can be clustered into functional networks, sharing a number of crucial features in cellular homeostasis and signaling. SAGE can provide affordable analysis of genes amenable for molecular dissection of PAH using PBMCs as a sentinel, surrogate tissue. Altogether, these findings may disclose novel perspectives in the use of HDACi in PAH and potential biomarkers.

Modulation der Strahlen- und Chemosensitivität menschlicher Tumorzellen durch Interferon

Pankreaskarzinome und maligne Melanome weisen eine hohe Resistenz gegenüber Zytostatika und Bestrahlung in der Therapie auf. Die Behandlung eines metastasierenden Pankreaskarzinoms besteht aus einer Kombination aus 5-FU, CDDP und IR. Für die Behandlung des malignen Melanoms ist das methylierende Agenz DTIC das Mittel erster Wahl. Das ebenfalls methylierende Agenz TMZ, welches jedoch in Deutschland noch nicht für die Behandlung von malignen Melanomen zugelassen ist, erlangt immer größere Bedeutung. Die Ansprechrate der Tumore kann durch Kombination mit IFNs erhöht werden. In der vorliegenden Arbeit wurde an Pankreaskarzinom- bzw. Melanomzelllinien untersucht, ob IFNs einen radio- bzw. chemosensibilisierender Effekt ausüben und, wenn ja, welcher Mechanismus hierfür verantwortlich ist. Es wurden zehn Pankreaskarzinom-Zelllinien (Panc-1, Su8686, Capan-1, Capan-2, Bxpc-3, PA-TU 8988T, Aspc-1, HS 766T, Mia-PaCa-2 und PA-TU 8902) untersucht. Diese zeigten eine hohe Variabilität in ihrer intrinsischen Radiosensitivität sowie in ihrer Sensitivität gegenüber IFN-alpha und IFN-beta. IFN-beta erwies sich als toxischer im Vergleich zu IFN-alpha. Die radiosensibilisierende Wirkung der IFNs an Pankreaskarzinom-Zelllinien war moderat, wobei IFN-beta im Vergleich zu IFN-alpha effektiver war. Der radiosensibilisierende Effekt ging mit einer deutlichen Erhöhung der alpha-Komponente, der Überlebenskurven einher und kam durch eine IFN-beta vermittelte Verstärkung der IR-induzierten Apoptoserate zustande. Dies wurde sowohl durch SubG1 als auch durch Annexin V / PI Messungen gezeigt. Einen Einfluss von IFN-beta auf den Zellzyklus und die DSB-Reparatur konnte durch funktionelle Untersuchungen sowie durch PCR bzw. Western-Blot-Analysen als Grund für den sensibilisierdenen Effekt ausgeschlossen werden. Ein sensibilisierender Effekt von IFN-beta auf die durch TMZ-induzierte Zytotoxizität war für die Pankreaskarzinom-Zelllinien weder in MGMT-profizientem noch –depletiertem Zustand zu beobachten. Zur Untersuchung der sensibilisierenden Eigenschaften von IFNs gegenüber TMZ in malignen Melanomzelllinien wurden p53-Wildtyp (D05 und A375) und mutierte Zelllinien (D14 und RPMI 7951) untersucht. Gegenüber alleiniger TMZ-Behandlung reagierten die untersuchten p53-Wildtyp Melanomzelllinien nicht sensitiver auf eine Behandlung mit TMZ als p53-mutierte Zelllinien. Der Nachweis des Spaltprodukts der Caspase-9 lieferte einen Hinweis darauf, dass in den Melanomzelllinien unabhängig vom p53-Status nach alleiniger TMZ-Behandlung der mitochondriale Apoptoseweg aktiviert wird. Durch eine Vorbehandlung der Zellen mit IFN-alpha oder IFN-beta konnte die TMZ-induzierte Apoptoserate in malignen Melanomzellen deutlich gesteigert werden. In p53-Wildtyp Melanomzellen war der chemosensibilisierende Effekt der IFNs besonders ausgeprägt. IFN-beta erwies sich hierbei als effektiver, weshalb es für die folgenden Versuche verwendet wurde. Durch stabile Transfektion der Zelllinie D05 mit MGMT konnte das durch TMZ-induzierte Addukt O6MeG als für den sensibilisieredenen Effekt ausschlaggebende DNA-Schädigung charakterisiert werden. Western-Blot-Analysen und gamma-H2AX-Immunfluoreszenz Untersuchungen konnten einen Einfluss von IFN-beta auf die Prozessierung der Läsion O6MeG sowie einen Einfluss von IFN-beta auf die Induktion und Reparatur von TMZ verursachten DSBs ausschließen. Durch Experimente mit einem Fas-aktivierenden Antikörper und durch eine stabile Transfektion der Zelllinien D05 und A375 mit DN-FADD konnte gezeigt werden, dass p53-Wildtyp Melanomzellen nicht oder nur eingeschränkt in der Lage sind, nach TMZ-Behandlung über den Fas-Rezeptor Signalweg Apoptose zu induzieren. Ausschlaggebend hierfür ist die geringe Pro-Caspase-8 Expression dieser Zelllinien. Eine IFN-beta Vorbehandlung bewirkte eine Reaktivierung des Fas-Rezeptor Signalweges, was mit einer verstärkten Expression der Pro-Caspase-8 einherging. Durch Experimente mit Caspase-8 siRNA konnte diese IFN-beta induzierte Verstärkung der Pro-Caspase-8 Expression als entscheidender Faktor für den sensibilisierenden Effekt ausgemacht werden. Zum ersten Mal konnte damit in dieser Arbeit gezeigt werden, dass p53-Wildtyp Melanomzellen durch eine IFN-beta vermittelte Hochregulation der Pro-Caspase-8 ihre Fähigkeit wiedererlangen, nach TMZ-Behandlung über den Fas-Rezeptor Signalweg Apoptose auszulösen. Diese Arbeiten weisen einen Weg, auf welchem die hohe Resistenz von malignen Melanomzellen, welche zu 80 % das nicht mutierte p53 Gen beherbergen, über eine IFN-beta induzierte Reaktivierung der Fas-Rezeptor vermittelten Apoptosekaskade überwunden werden kann.

Activity and mechanisms of action of novel organosulfur derivatives of the HDAC inhibitor Valproic Acid in human experimental models of non-small-cell lung cancer

Non-small-cell lung cancer (NSCLC) represents the leading cause of cancer death worldwide, and 5-year survival is about 16% for patients diagnosed with advanced lung cancer and about 70-90% when the disease is diagnosed and treated at earlier stages. Treatment of NSCLC is changed in the last years with the introduction of targeted agents, such as gefitinib and erlotinib, that have dramatically changed the natural history of NSCLC patients carrying specific mutations in the EGFR gene, or crizotinib, for patients with the EML4-ALK translocation. However, such patients represent only about 15-20% of all NSCLC patients, and for the remaining individuals conventional chemotherapy represents the standard choice yet, but response rate to thise type of treatment is only about 20%. Development of new drugs and new therapeutic approaches are so needed to improve patients outcome. In this project we aimed to analyse the antitumoral activity of two compounds with the ability to inhibit histone deacethylases (ACS 2 and ACS 33), derived from Valproic Acid and conjugated with H2S, in human cancer cell lines derived from NSCLC tissues. We showed that ACS 2 represents the more promising agent. It showed strong antitumoral and pro-apoptotic activities, by inducing membrane depolarization, cytocrome-c release and caspase 3 and 9 activation. It was able to reduce the invasive capacity of cells, through inhibition of metalloproteinases expression, and to induce a reduced chromatin condensation. This last characteristic is probably responsible for the observed high synergistic activity in combination with cisplatin. In conclusion our results highlight the potential role of the ACS 2 compound as new therapeutic option for NSCLC patients, especially in combination with cisplatin. If validated in in vivo models, this compound should be worthy for phase I clinical trials.

Involvement of the opioid system and BDNF in neuroplastic alterations occurring in neuropathic pain conditions

Chronic pain affects one in five adults, reducing quality of life and increasing risk of developing co-morbidities such as depression. Neuropathic pain results by lesions to the nervous system that alter its structure and function leading to spontaneous pain and amplified responses to noxious and innocuous stimuli. The Opioid System is probably the most important system involved in control of nociceptive transmission. Dynorphin and nociceptin systems have been suggested key mediators of some neuropathic pain aspects. An important role also for BDNF has been recently suggested since its involvement in the peripheral and central sensitization phenomena is known. We studied neuroplastic alterations occurring in chronic pain in mice subjected to the chronic constriction injury (CCI). We investigated gene expression alterations of both BDNF and Opioid System at spinal level at different intervals of time. A transient upregulation of pBDNF and pDYN was observed in spinal cord, while increasing upregulation of ppN/OFQ was found in the DRGs of injured mice. Development of neuropathic behavioral signs has been observed in ICR/CD-1 and BDNF+/+ mice, subjected to CCI. A different development of these signs was observed in BDNF+/-. We also studied gene expression changes of investigated systems in different brain areas fourteen days after surgery. We found pBDNF, pDYN, pKOP, ppN/OFQ and pNOP gene expression alterations in several areas of CCI mice. In the same brain regions we also determined bioactive nociceptin peptide levels, and elevated N/OFQ levels were observed in the amygdala area. Histone modifications studies have been performed in BDNF and DYN gene promoters of CCI animal spinal cord showing selected alterations in pDYN gene promoter. In addition, a preliminary characterization of the innovative NOP-EGFP mice was performed. Overall, our results could be useful to understand which and how neuropeptidergic systems are involved in neuroplastic mechanism occurring in neuropathic pain.

Transcriptional dynamics of the human DMD locus

The human DMD locus encodes dystrophin protein. Absence or reduced levels of dystrophin (DMD or BMD phenotype, respectively) lead to progressive muscle wasting. Little is known about the complex coordination of dystrophin expression and its transcriptional regulation is a field of intense interest. In this work we found that DMD locus harbours multiple long non coding RNAs which orchestrate and control transcription of muscle dystrophin mRNA isoforms. These lncRNAs are tissue-specific and highly expressed during myogenesis, suggesting a possible role in tissue-specific expression of DMD gene isoforms. Their forced ectopic expression in human muscle and neuronal cells leads to a specific and negative regulation of endogenous dystrophin full lenght isoforms. An intriguing aspect regarding the transcription of the DMD locus is the gene size (2.4Mb). The mechanism that ensures the complete synthesis of the primary transcript and the coordinated splicing of 79 exons is still completely unknown. By ChIP-on-chip analyses, we discovered novel regions never been involved before in the transcription regulation of the DMD locus. Specifically, we observed enrichments for Pol II, P-Ser2, P-Ser5, Ac-H3 and 2Me-H3K4 in an intronic region of 3Kb (approximately 21Kb) downstream of the end of DMD exon 52 and in a region of 4Kb spanning the DMD exon 62. Interestingly, this latter region and the TSS of Dp71 are strongly marked by 3Me-H3K36, an histone modification associated with the regulation of splicing process. Furthermore, we also observed strong presence of open chromatin marks (Ac-H3 and 2Me-H3K4) around intron 34 and the exon 45 without presence of RNA pol II. We speculate that these two regions may exert an enhancer-like function on Dp427m promoter, although further investigations are necessary. Finally, we investigated the nuclear-cytoplasmic compartmentalization of the muscular dystrophin mRNA and, specifically, we verified whether the exon skipping therapy could influence its cellular distribution.

Molecular basis of Osteoarthritis and aspects of cellular senescence in disease

The aim of this study is to investigate on some molecular mechanisms contributing to the pathogenesis of osteoarthritis (OA) and in particular to the senescence of articular chondrocytes. It is focused on understanding molecular events downstream GSK3β inactivation or dependent on the activity of IKKα, a kinase that does not belong to the phenotype of healthy articular chondrocytes. Moreover, the potential of some nutraceuticals on scavenging ROS thus reducing oxidative stress, DNA damage, and chondrocyte senescence has been evaluated in vitro. The in vitro LiCl-mediated GSK3β inactivation resulted in increased mitochondrial ROS production, that impacted on cellular proliferation, with S-phase transient arrest, increased SA-β gal and PAS staining, cell size and granularity. ROS are also responsible for the of increased expression of two major oxidative lesions, i.e. 1) double strand breaks, tagged by γH2AX, that associates with activation of GADD45β and p21, and 2) 8-oxo-dG adducts, that associate with increased IKKα and MMP-10 expression. The pattern observed in vitro was confirmed on cartilage from OA patients. IKKa dramatically affects the intensity of the DNA damage response induced by oxidative stress (H2O2 exposure) in chondrocytes, as evidenced by silencing strategies. At early time point an higher percentage of γH2AX positive cells and more foci in IKKa-KD cells are observed, but IKKa KD cells proved to almost completely recover after 24 hours respect to their controls. Telomere attrition is also reduced in IKKaKD. Finally MSH6 and MLH1 genes are up-regulated in IKKαKD cells but not in control cells. Hydroxytyrosol and Spermidine have a great ROS scavenging capacity in vitro. Both treatments revert the H2O2 dependent increase of cell death and γH2AX-foci formation and senescence, suggesting the ability of increasing cell homeostasis. These data indicate that nutraceuticals represent a great challenge in OA management, for both therapeutical and preventive purposes.

Mechanismen der Resistenz und Sensitivierung von menschlichen malignen Melanomzellen gegenüber DNA-alkylierenden Zytostatika

Das metastasierende maligne Melanom ist durch eine geringe p53-Mutations-Rate und eine hohe Resistenz gegenüber Chemotherapie mit alkylierenden Agenzien wie Fotemustin (FM) und Temozolomid (TMZ) gekennzeichnet. In der vorliegenden Arbeit wurde die Rolle von p53 in der Resistenz von malignen Melanomzellen gegenüber FM untersucht und Möglichkeiten zur Sensitivierung von Melanomzellen gegenüber TMZ und FM aufgezeigt.rnAusgangspunkt war die Beobachtung, dass p53 Wildtyp (p53wt) Melanomzellen resistenter gegenüber FM sind als p53 mutierte (p53mt) Zellen. In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, dass eine FM-Behandlung in p53wt Zellen eine Stabilisierung von p53 und eine Induktion des p53-Zielproteins p21 bewirkte. Mithilfe einer p53wt Zelllinie, welche einen p53 Knockdown trägt, konnte gezeigt werden, dass p53 für die geringe Apoptose-Rate nach FM-Behandlung verantwortlich ist. Eine Untersuchung der Interstrang-Crosslink (ICL)-Reparaturkapazität zeigte, dass p53mt Zellen im Gegensatz zu p53wt Zellen nicht in der Lage sind, FM-induzierte ICL zu reparieren. Dies ging mit einer im Vergleich zu p53wt Zellen starken DNA-Schadensantwort einher. Die Gene für die Proteine DDB2 und XPC wurden als durch FM regulierte DNA-Reparatur-Gene identifiziert, deren Induktion p53-abhängig und lang anhaltend (bis zu 144 h) erfolgt. Da XPC Knockdown-Zellen sensitiver als ihre Kontrollzellen gegenüber FM reagierten, konnte die biologische Relevanz von XPC bei der ICL-Reparatur bestätigt werden. Anhand von Xenograft-Tumoren wurde gezeigt, dass FM auch in situ eine Induktion von DDB2 und XPC auslöst. Die Beobachtung, dass DNA-Reparatur-Gene nach FM-Behandlung hochreguliert werden, liefert eine Erklärung für das schlechte Ansprechen von Melanomen auf eine Therapie mit ICL-induzierenden Chemotherapeutika.rnDes Weiteren befasste sich die vorliegende Arbeit mit Möglichkeiten zur Sensitivierung von Melanomzellen gegenüber den Chemotherapeutika TMZ und FM. In diesem Zusammenhang wurde Valproinsäure (VPA), ein in der Epilepsie-Therapie verwendetes Medikament und Histondesacetylase (HDAC)-Hemmer, bezüglich der chemosensitivierenden Wirkung untersucht. Zunächst konnte der in der Literatur häufig beschriebene stabilisierende Effekt von VPA auf „wildtypisches“ p53-Protein und destabilisierende Effekt auf mutiertes p53-Protein bestätigt werden. Zwei der vier untersuchten Zelllinien konnten mithilfe von VPA gegenüber TMZ sensitiviert werden, während nur eine der vier untersuchten Zelllinien gegenüber FM sensitiviert werden konnte. VPA begünstigt die Induktion von Apoptose, während der Effekt auf die Induktion von Nekrose nur gering ausfiel. Eine Wirkung von VPA auf die Aktivität des Resistenz-vermittelnden Enzyms O6-Methylguanin-DNA-Methyltransferase (MGMT) wurde nicht beobachtet. Zudem wurde ausgeschlossen, dass die Sensitivierung gegenüber TMZ und FM, welche S-Phase abhängige Gentoxine sind, auf einer VPA-induzierten Erhöhung der Proliferation beruht. Mithilfe einer Zelllinie, welche stabil dominant-negatives FADD (Fas-associated death domain) exprimiert, konnten keine Hinweise auf eine Beteiligung des extrinsischen Apoptose-Signalwegs an der VPA-vermittelten Sensitivierung gewonnen werden. Gleichzeitig wurde gezeigt, dass VPA keine Induktion der niedrig exprimierten Procaspase-8 verursachte. Mithilfe eines PCR-Arrays wurden transaktivierende und –reprimierende Effekte von VPA auf die Genexpression gezeigt, wobei das proapoptotische Protein BAX (Breakpoint cluster-2-associated x protein) als ein in der Sensitivierung involviertes Kandidatengen identifiziert wurde. Obwohl eine vollständige Aufklärung der dem Sensitivierungseffekt von VPA zu Grunde liegenden Mechanismen nicht erbracht werden konnte, zeigen die in dieser Arbeit erlangten Beobachtungen einen vielversprechenden Weg zur Überwindung der Resistenz von Melanomzellen gegenüber DNA-alkylierenden Zytostatika auf.rn