Ruolo della fosfolipasi C-β1 nel differenziamento miogenico: identificazione di nuovi target nucleari

The expression of phospholipase C-β1 (PLC-β1) and cyclin D3 is highly induced during skeletal myoblast differentiation. We have previously shown that PLC-β1 activates cyclin D3 promoter during the differentiation of myoblasts to myotubes, indicating that PLC-β1 is a crucial regulator of mouse cyclin D3 gene. Here we report that PLC-β1 catalytic activity plays a role in the increase of cyclin D3 levels and in the induction of differentiation of C2C12 skeletal muscle cells. PLC-β1 mutational analysis revealed the importance of His331 and His378 for the catalytic activity. We show that following insulin administration, cyclin D3 mRNA levels are lower in cells overexpressing the PLC-β1 catalytically inactive form, as compared to wild type cells. We describe a novel signaling pathway elicited by PLC-β1 that modulates Activator Protein-1 (AP-1) activity. Indeed, gel mobility shift assays indicate that there is a c-jun binding site located in cyclin D3 promoter region specifically regulated by PLC-β1 and that c-jun binding activity is significantly increased by insulin stimulation and PLC-β1 overexpression. Moreover, mutation of c-jun/AP-1 binding site decreases the basal cyclin D3 promoter activity and eliminates its induction by insulin and PLC-β1 overexpression. Interestingly, we observed that the ectopic expression of the Inositol Polyphosphate Multikinase (IPMK) in C2C12 myoblasts enhances cyclin D3 gene expression and that the mutation of c-jun site in cyclin D3 promoter determines an impairment of IPMK-dependent promoter induction. These results indicate that PLC-β1 activates a c-jun/AP-1 target gene, i.e. cyclin D3, during myogenic differentiation through IPMK signaling.

Untersuchungen über Wechselwirkungen zwischen Proteinen der Leber und dem großen Hüllprotein des Hepatitis-B-Virus

Zusammenfassung:Im Infektionszyklus des Hepatitis-B-Virus spielt das große L-Hüllprotein mit seiner einzigartigen PräS1-Domäne eine zentrale Rolle. Es vermittelt die Bindung und Aufnahme in die Leberzelle, die Verpackung der Nukleokapside in die Virushülle, die Regulation der cccDNA-Amplifikation und eine transkriptionelle Aktivierung in der Wirtszelle. Zur Erfüllung seiner vielfältigen Aufgaben benötigt das L-Protein Unterstützung durch Wirtzellfaktoren, von denen einige im Rahmen dieser Untersuchung durch Verwendung von PräS1-Konstrukten als Fängerproteine im Hefe-Zwei-Hybrid-System identifiziert wurden. Mehrere Klone, die im Hefe-Zwei-Hybrid-Test mit dem C-terminalen PräS1-Fängerprotein (Aminosäure 44-108) isoliert worden waren, enthielten Teile der cDNA von gamma2-Adaptin, einem mutmaßlichen Mitglied der Clathrin-Adaptor-Proteine. Diese sind für intrazelluläre Membrantransportprozesse mittels clathrinumhüllter Vesikel verantwortlich. Unter den interagierenden Klonen, die mit dem N-terminalen Konstrukt des L-Proteins (Aminosäure 1-70) isoliert worden waren, befand sich überproportional häufig eine cDNA, die der schweren Kette H4 der Inter-Alpha-Trypsin-Inhibitor-Familie homolog war. H4 besitzt vermutlich bei der 'Akute-Phase-Reaktion', die Entzündungen folgt, und bei der Stabilisierung der extrazellulären Matrix physiologische Bedeutung. Weitere Klone kodierten für die Serinprotease C1r. Diese ist Bestandteil des C1-Komplex, der ersten Komponente des klassischen Komplementsystems. Die Spezifität der Bindung zwischen den positiven Klonen und der PräS1-Domäne wurde in weiteren biochemischen Interaktionstests bestätigt, sodaß H4, C1r und gamma2-Adaptin als Wirtszellfaktoren in der Physiologie des Hepatitis-B-Virus wahrscheinlich eine Rolle spielen.Abstract:Little is known about host cell factors necessary for hepatitis B virus assembly and infectivity. Central to virogenesis is the large L envelope protein that mediates hepatocyte receptor binding, envelopment of viral capsids, regulation of supercoiled DNA amplification and transcriptional transactivation. To assess its multiple functions and host-protein assistance involved, we here initiated a yeast two-hybrid screen using the L-specific preS1 domain as bait to screen a human liver cDNA library for L-interacting proteins. One of the most prominent cDNAs interacting with aminoacid sequence 44-108 of L-protein encodes for gamma2-adaptin, a novel clathrin adaptor-related protein responsible for protein sorting and trafficking. Among the clones interacting with the N-terminal construct of L-protein (aminoacid sequence 1-70), a frequently isolated cDNA corresponds to the gene for inter-alpha-trypsin family heavy chain H4, likely to be involved in acute inflammatory phase response and stabilization of extracellular matrices. Some other interacting clones were found to carry the cDNA for the serine protease C1r, a subunit of the C1 complex which initiates the classical complement cascade. The specificity of the interaction between the positive clones and the preS1 domain was further confirmed in independent biochemical experiments. Taken together, the results suggest a role for H4, C1r and gamma2-adaptin as host-cell factors in L-mediated process of viral biogenesis and/or pathogenesis.

Cis- und trans-Regulation bei Drosophila-T-Box-Genen

Die räumliche und zeitliche Organisation von Genexpression ist für die Entwicklung und das Funktionieren eines jeden Lebewesens von immenser Bedeutung. Dazu laufen eine Vielzahl von Regulationsprozessen auf unterschiedlichen Ebenen ab. In dieser Arbeit wurden im ersten Teil Untersuchungen zur Genregulation des Drosophila optomotor-blind Genes und zur Funktion des Omb Proteins durchgeführt. Eine Mutante, der ein großer Teil der upstream regulatory region (URR) fehlt wurde erzeugt, aus einer Vielzahl von Linien isoliert und molekular charakterisiert. Die biologischen Auswirkungen dieser Deletion werden in Shen et al. (2008) beschrieben. Plasmide zur Erzeugung transgener Fliegen, mit deren Hilfe eine bereits von Sivasankaran et al. (2000) durchgeführte Enhancer-reporter-Analyse vervollständigt werden sollte, wurden hergestellt. Die bereits bekannte Inversion In(1)ombH31 wurde molekular kartiert. Eine Reihe von Konstrukten mit Punktmutationen in der Omb T-Domäne wurden generiert, die unter anderem über deren Funktion hinsichtlich DNA-Protein Interaktion und einer potentiellen Metallionenbindefähigkeit (ATCUN) hin Aufschluss geben sollen. Des Weiteren wurde eine Reihe von P-Element-Deletionslinien auf den Verlust eines alternativen omb Transkriptionsstartpunktes hin untersucht, mit dem Ziel eine vollständige Protein-Nullmutante zur Verfügung zu haben. Der zweite Abschnitt dieser Arbeit befasste sich mit der Erzeugung von Dpp-GFP-Fusionskonstrukten, mit deren Hilfe weitere Erkenntnisse über den Dpp-Langstreckentransport erhofft werden. Es wurde außerdem damit begonnen bei einem weitern Drosophila T-Box Transkriptionsfaktor, Optomotor-blind related gene-1 (Org-1), eine Reihe von Varianten mit homopolymeren polyAlanin und polyGlutamin Expansionen unterschiedlicher Länge herzustellen. Durch Experimente mit diesen Konstrukten soll Aufschluss darüber gewonnen werden, ob Glutamin-Expansionen, wie in der Literatur vorgeschlagen, aktivierend und Alanin-Expansionen in Transkriptionsfaktoren vielleicht reprimierend auf Genaktivität wirken. Letztlich wurden in dieser Arbeit im Rahmen des DROSDEL Projektes (Ryder et al., 2004, 2007) Deletionen in der distalen Hälfte des Chromosomenarms 3R hergestellt. Der DROSDEL Deletionskit, der durch eine Kooperation europäischer Labore entstand stellt der Drosophila Forschung einen umfassenden Satz molekular basengenau definierter Defizienzen zur Verfügung.

Zur Zytotoxizität von enzymatisch verändertem Low Density Lipoprotein: Differenzielle Empfindlichkeit von Granulozyten und Makrophagen gegenüber E-LDL

Low density lipoprotein (LDL) wird in der Arterienwand enzymatisch gespalten. Das Produkt, E-LDL, enthält neben freiem Cholesterol unveresterte Fettsäuren und induziert die Produktion von Interleukin 8 (IL-8) in Endothelzellen. Der Transkriptionsfaktor nuclear factor-kappaB (NF-κB), der das IL-8-Gen normalerweise reguliert, wurde durch E-LDL jedoch nicht aktiviert: Das veränderte Lipoprotein bewirkte im Gegenteil eine Hemmung von NF-κB vor dessen Translokation in den Zellkern. In E-LDL enthaltene freie Fettsäuren waren für die Hemmung verantwortlich. Dagegen aktivierte E-LDL den Transkriptionsfaktor AP-1, wie durch Phosphorylierung von c-jun gezeigt wurde. IL-8 lockt polymorphkernige Granulozyten (PMN) an, die jedoch in der frühen atherosklerotischen Läsion nicht vorkommen. Die vorliegende Arbeit bietet eine mögliche Erklärung für ihre Abwesenheit: PMN zeigten sich wesentlich empfindlicher gegenüber der Toxizität von E-LDL als Makrophagen. Es ist denkbar, daß sie in die Läsion zwar einwandern, nach ihrem raschen Tod dort jedoch nicht mehr detektiert werden können. E-LDL aktivierte PMN, wie durch Superoxidbildung und Peroxidasefreisetzung gezeigt wurde. Sowohl Aktivierung als auch Toxizität wurden von den in E-LDL enthaltenen freien Fettsäuren verursacht, die eine direkte Schädigung der Zellmembran bewirkten. Die E-LDL-bedingte Freisetzung proinflammatorischer Substanzen aus PMN könnte ein Grund dafür sein, daß die Depletion dieser Zellen die Läsionsentwicklung hemmt.

Development and applications of hollow fiber flow field-flow fractionation in the bioanalytical field. Studies of aggregation phenomena in complex protein samples

Recent advances in the fast growing area of therapeutic/diagnostic proteins and antibodies - novel and highly specific drugs - as well as the progress in the field of functional proteomics regarding the correlation between the aggregation of damaged proteins and (immuno) senescence or aging-related pathologies, underline the need for adequate analytical methods for the detection, separation, characterization and quantification of protein aggregates, regardless of the their origin or formation mechanism. Hollow fiber flow field-flow fractionation (HF5), the miniaturized version of FlowFFF and integral part of the Eclipse DUALTEC FFF separation system, was the focus of this research; this flow-based separation technique proved to be uniquely suited for the hydrodynamic size-based separation of proteins and protein aggregates in a very broad size and molecular weight (MW) range, often present at trace levels. HF5 has shown to be (a) highly selective in terms of protein diffusion coefficients, (b) versatile in terms of bio-compatible carrier solution choice, (c) able to preserve the biophysical properties/molecular conformation of the proteins/protein aggregates and (d) able to discriminate between different types of protein aggregates. Thanks to the miniaturization advantages and the online coupling with highly sensitive detection techniques (UV/Vis, intrinsic fluorescence and multi-angle light scattering), HF5 had very low detection/quantification limits for protein aggregates. Compared to size-exclusion chromatography (SEC), HF5 demonstrated superior selectivity and potential as orthogonal analytical method in the extended characterization assays, often required by therapeutic protein formulations. In addition, the developed HF5 methods have proven to be rapid, highly selective, sensitive and repeatable. HF5 was ideally suitable as first dimension of separation of aging-related protein aggregates from whole cell lysates (proteome pre-fractionation method) and, by HF5-(UV)-MALS online coupling, important biophysical information on the fractionated proteins and protein aggregates was gathered: size (rms radius and hydrodynamic radius), absolute MW and conformation.

Funktionelle Analyse der Meprin-Metalloproteasen alpha und beta hinsichtlich ihrer physiologischen Regulation und biologischen Bedeutung

Im Rahmen dieser Arbeit ist es gelungen, ein besseres Verständnis der beiden Metalloproteasen Meprin α und β in ihrem proteolytischen Netzwerk hinsichtlich ihrer physiologischen Regulation durch endogene Inhibitoren, wie auch der biologischen Funktion von Meprin α für den Prozess der Angiogenese, zu erlangen. rnMit der Analyse des ersten identifizierten endogenen Meprin-Inhibitors Fetuin-A gelang die Bestimmung der Ki-Werte für Meprin α mit 4,2 x 10-5 M und 1,1 x 10-6 M für Meprin β. Des Weiteren konnte für Meprin β eine Schnittstelle im Fetuin-A validiert werden. Mit der Identifizierung von Cystatin C, einem Cystein-Protease-Inhibitor als endogener Inhibitor der Metalloprotease Meprin α, mit einem Ki-Wert von 8,5 x 10-6 M, wurden erstmals Proteasefamilie-übergreifende Inhibitionsmechanismen für Metalloproteasen offenbart.rnDie Analyse von drei potentiellen Meprin-Inhibitoren, identifiziert als Substrate in einem neuen Proteomics-Analyse-Verfahren terminal amine isotopic labeling of substrates (TAILS), ermöglichte die Charakterisierung von Elafin als spezifischen Meprin α-Inhibitor. Für Elafin ist es außerdem gelungen, die durch TAILS ermittelte Schnittstelle für Meprin α mittels Edman Sequenzierung zu validieren. Der secretory leukocyte peptidase inhibitor (SLPI), ein Elafin-Homolog, konnte als weiteres Meprin α-Substrat bestätigt werden. Außerdem gelang es, die Meprin α-Schnittstelle im SLPI zu validieren.rnEin weiteres Ziel dieser Arbeit war, ein besseres Verständnis der biologischen Funktion der Metalloprotease Meprin α zu erlangen. Hier konnte in vivo eine stark pro-angiogene Wirkung von Meprin α gezeigt werden und erstmals die Expression von Meprin α, jedoch nicht von Meprin β, in Endothelzellen nachgewiesen werden. Zugleich konnte mit der Analyse der durch die TAILS-Methode identifizierten pro-angiogenen Substrate vascular endothelial growth factor A (VEGF-A) und connective tissue growth factor (CTGF) der Regulationsmechanismus von Meprin α in der Angiogenese identifiziert werden. So ist Meprin α durch die Spaltung von CTGF in der Lage VEGF-A – gebunden und inhibiert im Komplex mit CTGF – durch proteolytische Spaltung von CTGF wieder freizusetzen. Somit wird die inhibierte VEGF-A-Aktivität wieder vollständig hergestellt. rnMit der Charakterisierung der ersten endogenen Meprin-Inhibitoren ist es gelungen, zu einem besseren Verständnis der endogenen Regulation der Meprine beizutragen und eine Proteasefamilie-übergreifende endogene Regulation aufzuzeigen. Mit der Entdeckung von Meprin α als pro-angiogene Protease und der Entschlüsselung des angiogenen Regulationsmechanismus konnte eine essentielle biologische Bedeutung dieser Protease beschrieben werden.rn

Functional characterization of the placenta specific protein PLAC1 and its use for cancer immunotherapy

Summary Antibody-based cancer therapies have been successfully introduced into the clinic and have emerged as the most promising therapeutics in oncology. The limiting factor regarding the development of therapeutical antibody vaccines is the identification of tumor-associated antigens. PLAC1, the placenta-specific protein 1, was categorized for the first time by the group of Prof. Sahin as such a tumor-specific antigen. Within this work PLAC1 was characterized using a variety of biochemical methods. The protein expression profile, the cellular localization, the conformational state and especially the interacting partners of PLAC1 and its functionality in cancer were analyzed. Analysis of the protein expression profile of PLAC1 in normal human tissue confirms the published RT-PCR data. Except for placenta no PLAC1 expression was detectable in any other normal human tissue. Beyond, an increased PLAC1 expression was detected in several cancer cell lines derived of trophoblastic, breast and pancreatic lineage emphasizing its properties as tumor-specific antigen. rnThe cellular localization of PLAC1 revealed that PLAC1 contains a functional signal peptide which conducts the propeptide to the endoplasmic reticulum (ER) and results in the secretion of PLAC1 by the secretory pathway. Although PLAC1 did not exhibit a distinct transmembrane domain, no unbound protein was detectable in the cell culture supernatant of overexpressing cells. But by selective isolation of different cellular compartments PLAC1 was clearly enriched within the membrane fraction. Using size exclusion chromatography PLAC1 was characterized as a highly aggregating protein that forms a network of high molecular multimers, consisting of a mixture of non-covalent as well as covalent interactions. Those interactions were formed by PLAC1 with itself and probably other cellular components and proteins. Consequently, PLAC1 localize outside the cell, where it is associated to the membrane forming a stable extracellular coat-like structure.rnThe first mechanistic hint how PLAC1 promote cancer cell proliferation was achieved identifying the fibroblast growth factor FGF7 as a specific interacting partner of PLAC1. Moreover, it was clearly shown that PLAC1 as well as FGF7 bind to heparin, a glycosaminoglycan of the ECM that is also involved in FGF-signaling. The participation of PLAC1 within this pathway was approved after co-localizing PLAC1, FGF7 and the FGF7 specific receptor (FGFR2IIIb) and identifying the formation of a trimeric complex (PLAC1, FGF7 and the specific receptor FGFR2IIIb). Especially this trimeric complex revealed the role of PLAC1. Binding of PLAC1 together with FGF7 leads to the activation of the intracellular tyrosine kinase of the FGFR2IIIb-receptor and mediate the direct phosphorylation of the AKT-kinase. In the absence of PLAC1, no FGF7 mediated phosphorylation of AKT was observed. Consequently the function of PLAC1 was clarified: PLAC1 acts as a co-factor by stimulating proliferation by of the FGF7-FGFR2 signaling pathway.rnAll together, these novel biochemical findings underline that the placenta specific protein PLAC1 could be a new target for cancer immunotherapy, especially considering its potential applicability for antibody therapy in tumor patients.

Molekulare Ursachen und therapeutische Intervention bei der Alzheimer-Demenz

Ein charakteristisches, neuropathologisches Merkmal der Alzheimer-Demenz (AD), der am häufigsten vorkommenden Demenz-Form des Menschen, ist das Auftreten von senilen Plaques im Gehirn der Patienten. Hierbei stellt das neurotoxische A-beta Peptid den Hauptbestandteil dieser Ablagerungen dar. Einen Beitrag zu der pathologisch erhöhten A-beta Generierung liefert das verschobene Expressionsgleichgewicht der um APP-konkurrierenden Proteasen BACE-1 und ADAM10 zu Gunsten der beta-Sekretase BACE-1. In der vorliegenden Dissertation sollten molekulare Mechanismen identifiziert werden, die zu einem pathologisch veränderten Gleichgewicht der APP-Spaltung und somit zum Entstehen und Fortschritt der AD beitragen. Des Weiteren sollten Substanzen identifiziert werden, die durch Beeinflussung der Genexpression einer der beiden Proteasen das physiologische Gleichgewicht der APP-Prozessierung wiederherstellen können und somit therapeutisch einsetzbar sind.rnAnhand eines „Screenings“ von 704 Transkriptionsfaktoren wurden 23 Faktoren erhalten die das Verhältnis ADAM10- pro BACE-1-Promotor Aktivität beeinflussten. Exemplarisch wurden zwei der molekularen Faktoren auf ihren Wirkmechanismus untersucht: Der TF „X box binding protein-1“ (XBP-1), der die so genannte „unfolded protein response“ (UPR) reguliert, erhöhte die Expression von ADAM10 in Zellkultur-Experimenten. Die Menge dieses Faktors war in AD-Patienten im Vergleich zu gesunden, Alters-korrelierten Kontrollen signifikant erniedrigt. Im Gegensatz dazu verminderte der Seneszenz-assoziierte TF „T box 2“ (Tbx2) die Menge an ADAM10 in SH-SY5Y Zellen. Die Expression des Faktors selbst war in post-mortem Kortexgewebe von AD-Patienten erhöht. Zusätzlich zu den TFs konnten in einer Kooperation mit dem Helmholtz Zentrum München drei microRNAs (miRNA 103, 107, 1306) bioinformatisch prädiziert und experimentell validiert werden, die die Expression des humanen ADAM10 reduzierten.rnIm Rahmen dieser Arbeit konnten damit körpereigene Faktoren identifiziert werden, die die Menge an ADAM10 regulieren und folglich potenziell an der Entstehung der gestörten Homöostase der APP-Prozessierung beteiligt sind. Somit ist die AD auch im Hinblick auf eine A-beta-vermittelte Pathologie als multifaktorielle Krankheit zu verstehen, in der verschiedene Regulatoren zur gestörten APP-Prozessierung und somit zur pathologisch gesteigerten A-beta Generierung beitragen können. rnEine pharmakologische Erhöhung der ADAM10 Genexpression würde zu der Freisetzung von neuroprotektivem APPs-alpha und gleichzeitig zu einer reduzierten A-beta Generierung führen. Deshalb war ein weiteres Ziel dieser Arbeit die Evaluierung von Substanzen mit therapeutischem Potenzial im Hinblick auf eine erhöhte ADAM10 Expression. Von 640 FDA-zugelassenen Medikamenten einer Substanz-Bibliothek wurden 23 Substanzen identifiziert, die die Menge an ADAM10 signifikant steigerten während die Expression von BACE-1 und APP unbeeinflusst blieb. In Zusammenarbeit mit dem Institut für Pathologie (Johannes Gutenberg Universität Mainz) wurde ein Zellkultur-basiertes Modell etabliert, um die Permeationsfähigkeit der potenziellen Kandidaten-Substanzen über die Blut-Hirn Schranke (BHS) zu untersuchen. Von den 23 Medikamenten konnten neun im Rahmen des etablierten Modells als BHS-gängig charakterisiert werden. Somit erfüllen diese verbleibenden Medikamente die grundlegenden Anforderungen an ein AD-Therapeutikum. rnADAM10 spaltet neben APP eine Vielzahl anderer Substrate mit unterschiedlichen Funktionen in der Zelle. Zum Beispiel reguliert das Zelladhäsionsmolekül Neuroligin-1 (NL-1), das von ADAM10 prozessiert wird, die synaptische Funktion exzitatorischer Neurone. Aus diesem Grund ist die Abschätzung potenzieller, Therapie-bedingter Nebenwirkungen sehr wichtig. Im Rahmen eines Forschungsaufenthalts an der Universität von Tokio konnte in primären, kortikalen Neuronen der Ratte bei einer Retinoid-induzierten Erhöhung von ADAM10 neben einer vermehrten alpha-sekretorischen APP-Prozessierung auch eine gesteigerte Spaltung von NL-1 beobachtet werden. Dies lässt vermuten, dass bei einer Behandlung mit dem Retinoid Acitretin neben einer vermehrten APP-Spaltung durch ADAM10 auch die Regulation glutamaterger Neurone durch die Spaltung von NL-1 betroffen ist. Anhand eines geeigneten Alzheimer-Tiermodells sollten diese Befunde weiter analysiert werden, um so auf einen sicheren therapeutischen Ansatz bezüglich einer vermehrten ADAM10 Genexpression schließen zu können.rn

Unfolded protein response suppresses CEBPA by induction of calreticulin in acute myeloid leukaemia

The unfolded protein response (UPR) is triggered by the accumulation of misfolded proteins within the endoplasmic reticulum (ER). The role of the UPR during leukemogenesis is unknown so far. Here, we studied the induction of mediators of the UPR in leukaemic cells of AML patients. Increased expression of the spliced variant of the X-box binding protein 1 (XBP1s) was detected in 17.4% (16 of 92) of AML patients. Consistent with activated UPR, this group also had increased expression of ER-resident chaperones such as the 78 kD glucose-regulated protein (GRP78) and of calreticulin. Conditional expression of calreticulin in leukaemic U937 cells was found to increase calreticulin binding to the CEBPA mRNA thereby efficiently blocking translation of the myeloid key transcription factor CEBPA and ultimately affecting myeloid differentiation. Consequently, leukaemic cells from AML patients with activated UPR and thus increased calreticulin levels showed in fact suppressed CEBPA protein expression. We identified two functional ER stress response elements (ERSE) in the calreticulin promoter. The presence of NFY and ATF6, as well as an intact binding site for YY1 within these ERSE motifs were essential for mediating sensitivity to ER stress and activation of calreticulin. Thus, we propose a model of the UPR being activated in a considerable subset of AML patients through induction of calreticulin along the ATF6 pathway, thereby ultimately suppressing CEBPA translation and contributing to the block in myeloid differentiation.

Inflammation-associated autophagy-related programmed necrotic death of human neutrophils characterized by organelle fusion events

The most common form of neutrophil death, under both physiological and inflammatory conditions, is apoptosis. In this study, we report a novel form of programmed necrotic cell death, associated with cytoplasmic organelle fusion events, that occurs in neutrophils exposed to GM-CSF and other inflammatory cytokines upon ligation of CD44. Strikingly, this type of neutrophil death requires PI3K activation, a signaling event usually involved in cellular survival pathways. In the death pathway reported in this study, PI3K is required for the generation of reactive oxygen species, which somehow trigger the generation of large cytoplasmic vacuoles, generated by the fusion of CD44-containing endosomes with autophagosomes and secondary, but not primary, granules. Neutrophils demonstrating vacuolization undergo rapid cell death that depends on receptor-interacting protein 1 kinase activity and papain family protease(s), but not caspases, that are most likely activated and released, respectively, during or as a consequence of organelle fusion. Vacuolized neutrophils are present in infectious and autoimmune diseases under in vivo conditions. Moreover, isolated neutrophils from such patients are highly sensitive toward CD44-mediated PI3K activation, reactive oxygen species production, and cell death, suggesting that the newly described autophagy-related form of programmed neutrophil necrosis plays an important role in inflammatory responses.

Characterization of the bovine IkappaB kinases (IKK)alpha and IKKbeta, the regulatory subunit NEMO and their substrate IkappaBalpha

The Nuclear factor (NF)-kappaB signalling pathway plays a critical role in the regulation and coordination of a wide range of cellular events such as cell growth, apoptosis and cell differentiation. Activation of the IKK (inhibitor of NF-kappaB kinase) complex is a crucial step and a point of convergence of all known NF-kappaB signalling pathways. To analyse bovine IKKalpha (IKK1), IKKbeta (IKK2) and IKKgamma (or NF-kappaB Essential MOdulator, NEMO) and their substrate IkappaBalpha (Inhibitor of NF-kappaB), the corresponding cDNAs of these molecules were isolated, sequenced and characterized. A comparison of the amino acid sequences with those of their orthologues in other species showed a very high degree of identity, suggesting that the IKK complex and its substrate IkappaBalpha are evolutionarily highly conserved components of the NF-kappaB pathway. Bovine IKKalpha and IKKbeta are related protein kinases showing 50% identity which is especially prominent in the kinase and leucine zipper domains. Co-immunoprecipitation assays and GST-pull-down experiments were carried out to determine the composition of bovine IKK complexes compared to that in human Jurkat T cells. Using these approaches, the presence of bovine IKK complexes harbouring IKKalpha, IKKbeta, NEMO and the interaction of IKK with its substrate IkappaBalpha could be demonstrated. Parallel experiments using human Jurkat T cells confirmed the high degree of conservation also at the level of protein-protein interactions. Finally, a yeast two-hybrid analysis showed that bovine NEMO molecules, in addition to the binding to IKKalpha and IKKbeta, also strongly interact with each other.

Patient-related risk factors leading to aseptic stem loosening in total hip arthroplasty: a case-control study of 5,035 patients

BACKGROUND: We hypothesized that certain patient characteristics have different effects on the risk of early stem loosening in total hip arthroplasty (THA). We therefore conducted a case-control study using register-database records with the aim of identifying patient-specific risk factors associated with radiographic signs of aseptic loosening of the femoral component in THA. METHOD: Data were derived from a multinational European registry and were collected over a period of 25 years. 725 cases with radiographic signs of stem loosening were identified and matched to 4,310 controls without any signs of loosening. Matching criteria were type of implant, size of head, date of operation, center of primary intervention, and follow-up time. The risk factors analyzed were age at operation, sex, diagnosis and previous ipsilateral operations, height, weight, body mass index and mobility based on the Charnley classification. RESULTS: Women showed significantly lower risk of radiographic loosening than men (odds ratio (OR) 0.64). Age was also a strong factor: risk decreased by 1.8% for each additional year of age at the time of surgery. Height and weight were not associated with risk of loosening. A higher body mass index, however, increased the risk of stem loosening to a significant extent (OR 1.03) per additional unit of BMI. Charnley Class B, indicating restricted mobility, was associated with lower risk of loosening (OR 0.78). INTERPRETATION: An increased activity level, as seen in younger patients and those with unrestricted mobility, is an important factor in the etiology of stem loosening. If combined with high BMI, the risk of stem loosening within 10 years is even higher. A younger person should not be denied the benefits of a total hip arthroplasty but must accept that the risk of future failure is increased.

CD40 ligation protects bronchial epithelium against oxidant-induced caspase-independent cell death

CD40 and its ligand regulate pleiotropic biological responses, including cell proliferation, differentiation, and apoptosis. In many inflammatory lung diseases, tissue damage by environmental or endogenous oxidants plays a major role in disease pathogenesis. As the epithelial barrier is a major target for these oxidants, we postulated that CD40, the expression of which is increased in asthma, plays a role in the regulation of apoptosis of bronchial epithelial cells exposed to oxidants. Using 16HBE 14o- cells exposed to oxidant stress, we found that ligation of CD40 (induced by G28-5 monoclonal antibodies) enhanced cell survival and increased the number of cells in G2/M (interphase between DNA synthesis and mitosis) of the cell cycle. This was associated with NF-kappaB and activator protein-1 activation and increased expression of the inhibitor of apoptosis, c-IAP1. However, oxidant stress-induced apoptosis was found to be caspase- and calpain-independent implicating CD40 ligation as a regulator of caspase-independent cell death. This was confirmed by the demonstration that CD40 ligation prevented mitochondrial release and nuclear translocation of apoptosis inducing factor. In conclusion, we demonstrate a novel role for CD40 as a regulator of epithelial cell survival against oxidant stress. Furthermore, we have identified, for the first time, an endogenous inhibitory pathway of caspase-independent cell death.

Activation of the unfolded protein response is associated with favorable prognosis in acute myeloid leukemia

PURPOSE: The unfolded protein response is triggered by the accumulation of misfolded proteins within the endoplasmic reticulum. Previous studies suggest that the unfolded protein response is activated in some cancer cell lines and involved in tumor development. The role of the unfolded protein response during leukemogenesis is unknown thus far. EXPERIMENTAL DESIGN: Here, we assessed the induction of key effectors of the unfolded protein response in leukemic cells at diagnosis of 105 acute myeloid leukemia (AML) patients comprising all subtypes. We determined the formation of the spliced variant of the X-box-binding protein 1 (XBP1) mRNA, as well as expression levels of calreticulin, GRP78, and CHOP mRNA. RESULTS: The formation of the spliced variant of XBP1s was detectable in 16.2% (17 of 105) of AML patients. Consistent with activated unfolded protein response, this group also had significantly increased expression of calreticulin, GRP78, and CHOP. AML patients with activated unfolded protein response had lower WBC counts, lactate dehydrogenase levels, and more frequently, secondary AML. The incidence of fms-related tyrosine kinase 3 (FLT3) mutations was significantly lower in patients with activated unfolded protein response. In addition, an association was observed between activated unfolded protein response and deletion of chromosome 7. Finally, the clinical course of AML patients with activated unfolded protein response was more favorable with lower relapse rate (P = 0.0182) and better overall (P = 0.041) and disease-free survival (P = 0.022). CONCLUSIONS: These results suggest that the unfolded protein response is activated in a considerable subset of AML patients. AML patients with activated unfolded protein response present specific clinical characteristics and a more favorable course of the disease.

Zyxin interacts with the SH3 domains of the cytoskeletal proteins LIM-nebulette and Lasp-1

Zyxin is a versatile component of focal adhesions in eukaryotic cells. Here we describe a novel binding partner of zyxin, which we have named LIM-nebulette. LIM-nebulette is an alternative splice variant of the sarcomeric protein nebulette, which, in contrast to nebulette, is expressed in non-muscle cells. It displays a modular structure with an N-terminal LIM domain, three nebulin-like repeats, and a C-terminal SH3 domain and shows high similarity to another cytoskeletal protein, Lasp-1 (LIM and SH3 protein-1). Co-precipitation studies and results obtained with the two-hybrid system demonstrate that LIM-nebulette and Lasp-1 interact specifically with zyxin. Moreover, the SH3 domain from LIM-nebulette is both necessary and sufficient for zyxin binding. The SH3 domains from Lasp-1 and nebulin can also interact with zyxin, but the SH3 domains from more distantly related proteins such as vinexin and sorting nexin 9 do not. On the other hand, the binding site in zyxin is situated at the extreme N terminus as shown by site-directed mutagenesis. LIM-nebulette and Lasp-1 use the same linear binding motif. This motif shows some similarity to a class II binding site but does not contain the classical PXXP sequence. LIM-nebulette reveals a subcellular distribution at focal adhesions similar to Lasp-1. Thus, LIM-nebulette, Lasp-1, and zyxin may play an important role in the organization of focal adhesions.