RNA-basierte Impfstoffe zur Induktion optimaler Immunantworten

Antigen-kodierende RNA wird als eine sichere und effiziente Alternative zu traditionellen Impfstoff-Formulierungen, wie Peptid-, Protein-, rekombinanten viralen oder DNA basierten Impfstoffen betrachtet. Der endg��ltige klinische Nutzen RNA-basierter Impfstoffe wird von der Optimierung verschiedener Parameter abh��ngig sein, die zur Induktion und effizienten Expansion der humoralen und zellvermittelten Immunantwort beitragen. Vor diesem Hintergrund war die Zielsetzung der vorliegenden Arbeit, die Etablierung pharmakologischer und immunologischer Parameter f��r die Generierung effektiver Immunantworten durch RNA-Impfstoffe sowie deren Wirksamkeit in vitro und im Mausmodell unter Nutzung von Modellantigenen zu testen. Zur Untersuchung und Optimierung der RNA-Pharmakokinetik, als einem Schl��sselaspekt der klinischen Medikamentenentwicklung, wurde der Einfluss von strukturellen Modifikationen auf die Transkriptstabilit��t und Translationseffizienz von Reporter-Proteinen in einer zeitabh��ngigen Kinetik evaluiert. Es wurde gezeigt, dass ein poly(A) Schwanz von 120 Adenosinen, verglichen mit einem k��rzeren, ein freies 3�� poly(A) Ende, verglichen mit einem verdeckten und eine doppelte ��-globin 3�� UTR, unabh��ngig voneinander zu einer Erh��hung der IVT-RNA Stabilit��t und zu einer Verbesserung der Translationseffizienz beitrugen und dadurch insgesamt zu einer erh��hten Proteinexpression f��hrten. Antigen-kodierende IVT-RNA mit diesen molekularen Merkmalen in Kombination f��hrte, im Vergleich zur Standard IVT-RNA, zu einer erh��hten Dichte und Stabilit��t von Peptid/MHC-Komplexen auf der Zelloberfl��che transfizierter DCs und dadurch zu einer verbesserten Stimulation von CD4+ und CD8+ T-Zellen im murinen und humanen System. Mit dem Ziel, die RNA kodierte Antigenform f��r die Induktion einer verst��rkten Antik��rperantwort zu modifizieren, wurde im zweiten Teil der Arbeit ein Antigen-IgM Fusionskonstrukt hergestellt und hinsichtlich seiner Eignung als neues Impfstoff-Format untersucht. Die Ausgangshypothese, dass die RNA kodierten Antigen-IgM Fusionsproteine polymerisieren, von transfizierten Zellen sezerniert werden und aufgrund der repetitiven Antigenstruktur im Vergleich mit dem monomeren Antigen zu einer Verst��rkung der Antik��rperantwort f��hren, wurde in vitro und in vivo im Mausmodell best��tigt. Die Entwicklung und Evaluierung von Zytokinfusionsproteinen zur selektiven Verst��rkung der antigenspezifischen Immunantworten bildeten den dritten Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit. Zur weiteren Verst��rkung der Antik��rperantwort wurde basierend auf den Resultaten aus dem zweiten Teil ein IL2-IgM Fusionskonstrukt hergestellt. Die Ko-Transfektion von Antigen-IgM und IL2-IgM kodierender IVT-RNA f��hrte zu einer signifikant st��rkeren Antik��rperantwort als die Ko-Transfektion von Antigen-IgM und IL2. F��r die Initiierung einer erfolgreichen anti-Tumor-Immunantwort ist das Priming antigenspezifischer T-Zellen essentiell. Um die Effizienz dieses Prozesses zu steigern, wurde ein bifunktionelles IL2-mCD40L Fusionskonstrukt hergestellt und sein Einfluss auf die Effektorfunktion von DCs in vitro und in vivo untersucht. Es wurde gezeigt, dass ein RNA kodiertes IL2-mCD40L Fusionsprotein als genetisches Adjuvanz zu einer Effizienzsteigerung des Priming zytotoxischer T-Zellen f��hrt. Somit wurden in dieser Arbeit durch die Optimierung der Pharmakokinetik, die Modifikation der Antigenform und die Herstellung und Evaluierung von Zytokinfusionskonstrukten als genetische Adjuvantien, RNA-basierte Impfstoffe f��r eine optimierte Induktion von antigenspezifischen Immunantworten weiter verbessert.

Induktion und Analyse spezifischer Immunantworten nach intranodaler Immunisierung mit RNA im murinen Modell

Die Wirksamkeit einer Vakzine ist von vielen Parametern abh��ngig. Dazu geh��ren unter anderen: das ausgew��hlte Antigen, die Formulation in der das Antigen benutzt wird sowie die Applikationsroute. Antigen-kodierende Ribonukleins��uren (RNA) gilt heutzutage als eine sichere und effiziente Alternative zu traditionellen Impfstoff-Formulierungen, wie Peptiden, rekombinanten Proteinen, viralen Systemen oder DNA basierten Impfstoffen. Bez��glich des Applikationsortes repr��sentiert der Lymphknoten ein optimales Milieu f��r die Interaktion zwischen antigenpr��sentierenden Zellen und T-Zellen. Vor diesem Hintergrund war die Zielsetzung dieser Arbeit, ein auf direktem in vivo Transfer von Antigen-kodierender in vitro transkribierter RNA (IVT-RNA) basierendes Impfverfahren zu entwickeln, zu charakterisieren und auf seine anti-tumorale Wirksamkeit zu testen. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass dendritische Zellen (DCs) in vitro hocheffizient mit IVT-RNA transfiziert werden k��nnen und eine hohe stimulatorische Kapazit��t besitzen. Durch Sequenzmodifikation der IVT-RNA konnten wir die Transkriptstabilit��t und Translationseffizienz erh��hen was zu einer Steigerung der stimulatorischen Kapazit��t in vivo f��hrte. Dar��ber hinaus untersuchten wir die Auswirkung der Insertion eines Signalpeptides 5��� sowie einer C-terminalen transmembran- und zytosolischen-Dom��ne eines MHC-Klasse-I-Molek��ls am 3��� der Antigen-kodierenden Sequenz auf die Effizienz der MHC-Klasse-I und -II Pr��sentation. Wir konnten in vitro und in vivo nachweisen, dass diese Modifikation zu einer gesteigerten, simultanen Stimulation von antigenspezifischen CD4+ und CD8+ T-Zellen f��hrt. Auf der Basis der optimierten Vektorkassetten etablierten wir die intranodale (i.n.) Transfektion von antigenpr��sentierenden Zellen in der Maus. Dazu nutzten wir verschiedene Reportersysteme (eGFP-RNA, fluoreszensmarkierte RNA) und konnten zeigen, dass die intranodale Applikation von IVT-RNA zu selektiven Transfektion und Maturation lymphknotenresidenter DCs f��hrt. Zur Untersuchung der immunologischen Effekte wurden in erster Linie auf Influenza-Hemagglutinin-A und Ovalbumin basierende Modellantigensysteme verwendet. Beide Antigene wurden als Antigen-MHC-Fusionskonstrukte genutzt. Als Responderzellen wurden TCR-transgene Lymphozyten verwendet, die MHC-Klasse-I oder -Klasse-II restringierte Epitope des Influenza-Hemagglutinin-A bzw. des Ovalbumin-Proteins erkennen. Wir konnten in vivo zeigen, dass die intranodale Immunisierung mit IVT-RNA zu einer effizienten Stimulation und Expansion von antigenspezifischen CD4+ und CD8+ T-Zellen in einer dosisabh��ngigen Weise f��hrt. Funktionell konnte gezeigt werden, dass diese T-Zellen Zytokine sezernieren und zur Zytolyse bef��higt sind. Wir waren in der Lage durch repetitive i.n. RNA Immunisierung ein ���Priming��� CD8+ T-Zellen in naiven M��usen sowohl gegen virale als auch gegen Tumor assoziierte Antigene zu erreichen. Die geprimten T-Zellen waren bef��higt eine zytolytische Aktivit��t gegen mit spezifischem Peptid beladene Targetzellen zu generieren. Dar��ber hinaus waren wir in der Lage Ged��chtnisszellen expandieren zu k��nnen. Abschlie��end konnten wir in Tumormodellen sowohl in prophylaktischen als auch in therapeutischen Experimenten zeigen dass die i.n. RNA Vakzination die Potenz zur Induktion einer anti-tumoralen Immunit��t besitzt.

Aktivit��tsabh��ngige Kontrolle der Apoptose in neonatalen kortikalen Neuronen und Etablierung eines Biosensors zur Echtzeitanalyse der Caspase-3-Aktivierung

Die Apoptose spielt eine entscheidende Rolle w��hrend der normalen Entwicklung des zentralen Nervensystems. Elektrische Aktivit��t und die Versorgung mit trophischen Faktoren sind ausschlaggebend f��r das ��berleben von Neuronen. Um zu untersuchen, welche zellul��ren Prozesse die aktivit��tsabh��ngige Apoptose in organotypischen Schnittkulturen des neugeborenen Neokortex beeinflussen, wurde in der vorliegenden Arbeit immunzytochemisch das Auftreten aktivierter Caspase-3, nach pharmakologischer Beeinflussung von Ionenkan��len und membranst��ndigen Rezeptoren analysiert. Die Unterdr��ckung neuronaler Aktivit��t durch den Natriumionenkanalblocker TTX f��hrte zu einem signifikanten Verlust kortikaler Neuronen. Ein ��hnlicher Anstieg der Zahl apoptotischer Neurone konnte durch Applikation von Antagonisten ionotroper Glutamatrezeptoren, GABAA-Rezeptoren oder neuronaler Gap Junctions induziert werden. Jedoch konnte bei einigen Antagonisten die apoptosef��rdernde Wirkung erst nach l��ngerer Einwirkung beobachtet werden. Im Weiteren wurde eine Methode etabliert, mit deren Hilfe eine Echtzeitanalyse der Apoptose kortikaler Neurone unter dem Entzug trophischer Faktoren in Gegenwart unterschiedlicher extrazellul��rer Kaliumkonzentrationen erm��glicht wurde. Dazu wurden dissoziierte kortikale Kulturen mit dem pCaspase3-sensor Vektor transfiziert. Das durch dieses Plasmid codierte fluoreszente Protein wird Caspase-3 abh��ngig gespalten. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass der Caspase3-sensor spezifisch f��r die Aktivierung der Caspase-3 ist, und dass die ��berlebensf��higkeit der transfizierten Neurone durch das Transfektionsprotokoll nicht beeinflusst wird.

Human papillomavirus (HPV) and associated diseases: between applied diagnostic and basic research

Human Papillomavirus (HPV) is the cause of cervical cancers (among these, adenocarcinoma, AdCa) and is associated to a subgroup of oropharyngeal carcinomas (OPSCCs). Even if the risk for cancer development is linked to the infection by some viral genotypes, mainly HPV16 and 18, viral DNA alone seems not to be sufficient for diagnosis. Moreover, the role of the virus in OPSCCs has not been totally clarified yet. In the first part of the thesis, the performances concerning viral genotyping in clinical cervical samples of a new pyrosequencing-based test and a well-known hybridization-based assay have been compared. Similar results between the methods have been obtained. However, the former showed advantages in detecting intratype variants, higher specificity and a broader spectrum of detectable HPV types. The second part deals with the evaluation of virological markers (genotyping, viral oncoproteins expression, viral load, physical state and CpG methylation of HPV16 genome) in the diagnosis/prognosis of cervical AdCa and HPV-associated OPSCCs. HPV16 has been confirmed the most prevalent genotype in both the populations. Interestingly, the mean methylation frequency of viral DNA at the early promoter showed the tendency to be associated to invasion for cervical AdCa and to a worse prognosis for OPSCCs, suggesting a promising role as diagnostic/prognostic biomarker. The experiments of the third part were performed at the DKFZ in Heidelberg (Germany) and dealt with the analysis of the response to IFN-k transfection in HPV16-positive cervical cancer and head&neck carcinoma cell lines to evaluate its potential role as new treatment. After 24h, we observed increased IFN-b expression which lead to the up-regulation of genes involved in the antigens presentation pathway (MHC class I and immunoproteasome) and antiviral response as well, in particular in cervical cancer cell lines. This fact suggested also the presence of different HPV-mediated carcinogenic pathways between the two anatomical districts.

Aktivierung der alpha-Sekretase ADAM10 als neuer therapeutischer Ansatz zur Behandlung der Alzheimer-Erkrankung

Die Stimulation der APP-prozessierenden ��-Sekretase ADAM10 er��ffnet eine vielversprechende M��glichkeit zur medizinischen Behandlung der Alzheimer-Krankheit. In dieser Arbeit wurden drei unterschiedliche Strategien zur therapeutischen Aktivierung von ADAM10 verfolgt: Die Aktivierung des G-Protein-gekoppelten Rezeptors PAC1 durch PACAP, die Gentherapie mit ADAM10-cDNA und die ADAM10-Promotorstimulation durch Retinoid-Rezeptor-Aktivierung. PACAP-38 stimuliert die ��-Sekretase-vermittelte APPs��-Sekretion in humanen Neuroblastomzellen. Durch Aktivierung des PAC-1-Rezeptors via intranasal verabreichtem PACAP-38, konnte eine erh��hte ��-sekretorische APP-Prozessierung bzw. verminderte Ablagerung von amyloiden Plaques in M��usen gezeigt werden. Weiterhin sollte durch Immunoliposomen-basierte Transfektion die humane ADAM10-cDNA in den Neuronen der Maus ��berexprimiert werden. Hief��r wurde die DNA in Liposomen eingeschlossen, welche an ihrer Oberfl��che mit anti-Transferrin-Antik��rpern zur ��berwindung der Blut-Hirn-Schranke gekoppelt waren. F��r die Herstellung des DNA-Transportsystems wurden die Einzelschritte wie DNA-Einschluss mit einem Reportergen-Vektor, Konjugation mit verschiedenen Antik��rpern und Gr����e der Liposomen erprobt und optimiert. Es konnte allerdings weder in vitro noch in vivo eine Immunoliposomen-vermittelte Transfektion nachgewiesen werden. In dieser Arbeit wurde zudem die Retinoid-basierte Expressionssteigerung von ADAM10 untersucht. Daf��r wurden die beiden potentiellen Retinoid-Rezeptor-Bindestellen auf dem ADAM10-Promotor durch Verwendung selektiver nukle��rer Rezeptor-Agonisten charakterisiert. Hierbei konnte erstmals gezeigt werden, dass der ADAM10-Promotor durch ein Dimer der nukle��ren Rezeptoren RAR und RXR aktiviert wird, wodurch eine erh��hte ��-sekretorischen APP-Prozessierung in Neuroblastoma-Zellen resultiert. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die RAR/RXR-Heterodimeraktivierung sowohl auf dem humanen wie auf dem murinen ADAM10-Promotor identisch ist, so dass am Mausmodell entwickelte Retinoid-basierte Therapien auf den Menschen ��bertragbar sind. F��r das Modell einer solchen Therapie wurde Acitretin verwendet, welches f��r die medizinische Behandlung humaner Hautkrankheiten seit Jahrzehnten eingesetzt wird. In dieser Arbeit konnte erstmals gezeigt werden, dass Acitretin in humanen und murinen Neuroblastoma-Zellen die Menge an ADAM10 erh��ht, wodurch die ��-sekretorische APP-Prozessierung gesteigert wird. Zudem wurden M��use mit Acitretin oral, subcutan und intranasal behandelt, wobei jedoch weder eine Ver��nderung in der APP-Prozessierung noch der Blut-Hirn-Transport von Acitretin eindeutig belegt werden konnten. Dennoch erschlie��t die ��-Sekretase-erh��hende Eigenschaft von Acitretin einen neuen Therapieansatz, zur Behandlung von Demenzformen vom Typ des Morbus Alzheimer.

Modulation der Strahlen- und Chemosensitivit��t menschlicher Tumorzellen durch Interferon

Pankreaskarzinome und maligne Melanome weisen eine hohe Resistenz gegen��ber Zytostatika und Bestrahlung in der Therapie auf. Die Behandlung eines metastasierenden Pankreaskarzinoms besteht aus einer Kombination aus 5-FU, CDDP und IR. F��r die Behandlung des malignen Melanoms ist das methylierende Agenz DTIC das Mittel erster Wahl. Das ebenfalls methylierende Agenz TMZ, welches jedoch in Deutschland noch nicht f��r die Behandlung von malignen Melanomen zugelassen ist, erlangt immer gr����ere Bedeutung. Die Ansprechrate der Tumore kann durch Kombination mit IFNs erh��ht werden. In der vorliegenden Arbeit wurde an Pankreaskarzinom- bzw. Melanomzelllinien untersucht, ob IFNs einen radio- bzw. chemosensibilisierender Effekt aus��ben und, wenn ja, welcher Mechanismus hierf��r verantwortlich ist. Es wurden zehn Pankreaskarzinom-Zelllinien (Panc-1, Su8686, Capan-1, Capan-2, Bxpc-3, PA-TU 8988T, Aspc-1, HS 766T, Mia-PaCa-2 und PA-TU 8902) untersucht. Diese zeigten eine hohe Variabilit��t in ihrer intrinsischen Radiosensitivit��t sowie in ihrer Sensitivit��t gegen��ber IFN-alpha und IFN-beta. IFN-beta erwies sich als toxischer im Vergleich zu IFN-alpha. Die radiosensibilisierende Wirkung der IFNs an Pankreaskarzinom-Zelllinien war moderat, wobei IFN-beta im Vergleich zu IFN-alpha effektiver war. Der radiosensibilisierende Effekt ging mit einer deutlichen Erh��hung der alpha-Komponente, der ��berlebenskurven einher und kam durch eine IFN-beta vermittelte Verst��rkung der IR-induzierten Apoptoserate zustande. Dies wurde sowohl durch SubG1 als auch durch Annexin V / PI Messungen gezeigt. Einen Einfluss von IFN-beta auf den Zellzyklus und die DSB-Reparatur konnte durch funktionelle Untersuchungen sowie durch PCR bzw. Western-Blot-Analysen als Grund f��r den sensibilisierdenen Effekt ausgeschlossen werden. Ein sensibilisierender Effekt von IFN-beta auf die durch TMZ-induzierte Zytotoxizit��t war f��r die Pankreaskarzinom-Zelllinien weder in MGMT-profizientem noch ���depletiertem Zustand zu beobachten. Zur Untersuchung der sensibilisierenden Eigenschaften von IFNs gegen��ber TMZ in malignen Melanomzelllinien wurden p53-Wildtyp (D05 und A375) und mutierte Zelllinien (D14 und RPMI 7951) untersucht. Gegen��ber alleiniger TMZ-Behandlung reagierten die untersuchten p53-Wildtyp Melanomzelllinien nicht sensitiver auf eine Behandlung mit TMZ als p53-mutierte Zelllinien. Der Nachweis des Spaltprodukts der Caspase-9 lieferte einen Hinweis darauf, dass in den Melanomzelllinien unabh��ngig vom p53-Status nach alleiniger TMZ-Behandlung der mitochondriale Apoptoseweg aktiviert wird. Durch eine Vorbehandlung der Zellen mit IFN-alpha oder IFN-beta konnte die TMZ-induzierte Apoptoserate in malignen Melanomzellen deutlich gesteigert werden. In p53-Wildtyp Melanomzellen war der chemosensibilisierende Effekt der IFNs besonders ausgepr��gt. IFN-beta erwies sich hierbei als effektiver, weshalb es f��r die folgenden Versuche verwendet wurde. Durch stabile Transfektion der Zelllinie D05 mit MGMT konnte das durch TMZ-induzierte Addukt O6MeG als f��r den sensibilisieredenen Effekt ausschlaggebende DNA-Sch��digung charakterisiert werden. Western-Blot-Analysen und gamma-H2AX-Immunfluoreszenz Untersuchungen konnten einen Einfluss von IFN-beta auf die Prozessierung der L��sion O6MeG sowie einen Einfluss von IFN-beta auf die Induktion und Reparatur von TMZ verursachten DSBs ausschlie��en. Durch Experimente mit einem Fas-aktivierenden Antik��rper und durch eine stabile Transfektion der Zelllinien D05 und A375 mit DN-FADD konnte gezeigt werden, dass p53-Wildtyp Melanomzellen nicht oder nur eingeschr��nkt in der Lage sind, nach TMZ-Behandlung ��ber den Fas-Rezeptor Signalweg Apoptose zu induzieren. Ausschlaggebend hierf��r ist die geringe Pro-Caspase-8 Expression dieser Zelllinien. Eine IFN-beta Vorbehandlung bewirkte eine Reaktivierung des Fas-Rezeptor Signalweges, was mit einer verst��rkten Expression der Pro-Caspase-8 einherging. Durch Experimente mit Caspase-8 siRNA konnte diese IFN-beta induzierte Verst��rkung der Pro-Caspase-8 Expression als entscheidender Faktor f��r den sensibilisierenden Effekt ausgemacht werden. Zum ersten Mal konnte damit in dieser Arbeit gezeigt werden, dass p53-Wildtyp Melanomzellen durch eine IFN-beta vermittelte Hochregulation der Pro-Caspase-8 ihre F��higkeit wiedererlangen, nach TMZ-Behandlung ��ber den Fas-Rezeptor Signalweg Apoptose auszul��sen. Diese Arbeiten weisen einen Weg, auf welchem die hohe Resistenz von malignen Melanomzellen, welche zu 80 % das nicht mutierte p53 Gen beherbergen, ��ber eine IFN-beta induzierte Reaktivierung der Fas-Rezeptor vermittelten Apoptosekaskade ��berwunden werden kann.

Identifizierung und ��berexpression immunregulatorischer Molek��le in dendritischen Zellen zur gezielten Modulation ihrer T-Zell-stimulierenden Eigenschaften

Die Modifizierung von dendritischen Zellen (DCs) in vitro erfolgt meist durch eine Behandlung mit Mediatoren, die den Aktivierungszustand sowie die T-Zell-polarisierenden DC-Eigenschaften ver��ndern. In dieser Doktorarbeit sollten zun��chst mediatorinduzierte tolerogene Schl��sselmolek��le identifiziert werden. Als Modell wurden murine Knochenmarkszellen unter DC-differenzierenden Bedingungen mit dem Glucocorticoid Dexamethason (DEX) behandelt. Die generierten DEX-APCs (antigenpr��sentierende Zellen) zeigten einen protolerogenen, weitgehend maturierungsresistenten Ph��notyp und eine gesteigerte Expression toleranzassoziierter Molek��le. DEX-APCs induzierten in vitro aus CD25+ depletierten allogenen T-Zellen de novo CD4+ und CD8+ regulatorische T-Zellen (Tregs). Basierend auf diesen Ergebnissen und Literaturstudien wurden protolerogene Molek��le f��r eine ��berexpression in DCs selektiert. Da DCs non-viral kaum transfizierbar sind, wurde die lentivirale Transduktion von DCs optimiert, wodurch Effizienzen bis zu 95% erreicht werden konnten. Der mit der Transduktion assoziierte physikalische Stress resultierte in einer partiellen DC-Aktivierung. Trotzdessen zeigten DCs, die die Zytokine IL-10 oder IL-21 ��berexprimierten, einen protolerogenen Ph��notyp und induzierten in vitro Tregs. Beide DC-Populationen reduzierten im therapeutischen Ansatz im murinen Krankheitsmodell der Kontaktallergie haptenspezifisch die Ohrschwellungsreaktion. Auch DCs, die andere Zytokine, intrazellul��re Proteine oder Oberfl��chenrezeptoren mit protolerogenen Eigenschaften ��berexprimierten, wiesen eine jeweils spezifische Genexpressionssignatur auf. Diese DC-Populationen waren zumeist durch eine verminderte allogene T-Zell-Aktivierungskapazit��t gekennzeichnet und ver��nderten die Th1-/Th2-Zytokinmuster in kokultivierten T-Zellen.

Untersuchungen zur Expression und Lokalisation der respiratorischen Proteine Neuroglobin (Ngb) und Cytoglobin (Cygb) in S��ugern

Die vorliegende Dissertation beinhaltet Untersuchungen zur Expression und Funktion der respiratorischen Proteine Neuroglobin (Nbg) und Cytoglobin (Cygb) in Vertebraten. rnrnUm die Expression der Globine w��hrend der Entwicklung des S��ugerhirns zu untersuchen, wurden die Hirne von Maus-Embryonen ab dem F��talstadium MF10 bis zum Tag eins nach der Geburt (T1) mit Adulttieren verglichen. Quantifiziert wurde sowohl die mRNA- als auch die Protein-Expression. Beide Globine zeigten im Verlauf der Entwicklung einen stetigen Anstieg der mRNA-Expression, wobei Ngb zu Beginn in zehnfach h��herer Konzentration vorlag und im zeitlichen Verlauf einen 130-fachen Anstieg zeigte. Cygb zeigte lediglich einen 16-fachen Anstieg bis zum Adultstadium. Auf Proteinebene konnte die Expressionszunahme beider Globine im Laufe der Entwicklung best��tigt werden. Weder in den hypoxieresistenten Fr��hembryonalstadien noch w��hrend der mit Sauerstoff-Stress verbundenen Geburt zeigte sich ein Expressionsmaximum. Dies spricht gegen eine Globin-Funktion in der Oxidanz-Abwehr. Eher ist zumindest Ngb mit der Reifung der Neurone und dem damit einhergehenden, gesteigerten oxidativen Stoffwechsel assoziiert.rnrnDes Weiteren sollte die zellul��re und intrazellul��re Lokalisation beider Globine anhand einer prim��ren Zellkultur aus dem Hippocampus pr��nataler Ratten und in immortalen Zelllinien untersucht werden. Neuroglobin wurde dabei nur in Neuronen, nicht jedoch in Gliazellen nachgewiesen. Das F��rbemuster war in allen Ngb-exprimierenden Zellen zytoplasmatisch. Cytoglobin wurde in der Prim��rkultur in den Neuronen jedoch ebenso in den mit anti-GFAP markierten Gliazellen beobachtet. In beiden Zellpopulationen war auch der Kern durch das CyGB-Antiserum markiert. rnEine genauere Untersuchung der intrazellul��ren Lokalisation sollte durch die Transfektion von Globin-pEGFP-Fusionsproteinen erfolgen. Nach Transfektion der Fusionskonstrukte wurde die GFP-F��rbung bei beiden Globinen sowohl im Zytoplasma als auch im Kern beobachtet. Eine rein nukle��re Lokalisation, die insbesondere f��r Cygb von anderen Autoren postuliert wurde, konnte somit ausgeschlossen werden. rnrnIn prim��ren Zellkulturen aus Cerebellum und Kortex, die mit Hilfe von Paraquat oxidativem Stress ausgesetzt wurden, wurde der Verlauf der Globin-mRNA-Expression mit dem unregulierten 18s rRNA-Referenzgen und mit den Antioxidanz-Enzymen Cu-Zn-SOD und Gpx verglichen. Neuroglobin zeigte einen Expressionsverlauf ��hnlich dem der beiden Antioxidanz-Enzyme, jedoch liegt seine mRNA im Hirngewebe in hundertfach niedrigerer Menge als Cu-Zn-SOD und Gpx vor. Cytoglobin zeigte keine Ver��nderung der Expression. Eine Funktion der Globine im Sinne einer ROS-Abwehr kann aus den Befunden nicht abgeleitet werden. rnrnUntersuchungen von Tumor und Normalgewebe mittels eines cDNA-Cancer-Arrays zeigten, dass NGB in Tumoren verschiedenen Ursprungs nicht exprimiert wird, CyGB dagegen keine ��nderung seiner Expression in Tumor versus Normalgewebe erf��hrt. Eine Induktion der beiden Globine z.B. durch Hypoxie in soliden Tumoren kann daher ausgeschlossen werden.rn

Studio della patogenesi di HIV-1 nel compartimento osseo: effetti della terapia antiretrovirale convenzionale e nuovi approcci all'eradicazione

L���obiettivo della tesi �� studiare il virus HIV-1 in relazione alle alterazioni sistemiche, riscontrate nel paziente HIV-infetto, in particolare alterazioni a carico del sistema scheletrico, indotte dal virus o dall���azione dei farmaci utilizzati nella terapia antiretrovirale (HAART). L���incidenza dell���osteoporosi nei pazienti HIV-positivi �� drammaticamente elevata rispetto alla popolazione sana. Studi clinici hanno evidenziato come alcuni farmaci, ad esempio inibitori della proteasi virale, portino alla compromissione dell���omeostasi ossea, con aumento del rischio fratturativo. Il nostro studio prevede un follow-up di 12 mesi dall���inizio della HAART in una coorte di pazienti na��ve, monitorando diversi markers ossei. I risultati ottenuti mostrano un incremento dei markers metabolici del turnover osseo, confermando l���impatto della HAART sull���omeostasi ossea. Successivamente abbiamo focalizzato la nostra attenzione sugli osteoblasti, il citotipo che regola la sintesi di nuova matrice ossea. Gli esperimenti condotti sulla linea HOBIT mettono in evidenza come il trattamento, in particolare con inibitori della proteasi, porti ad apoptosi nel caso in cui vi sia una concentrazione di farmaco maggiore di quella fisiologica. Tuttavia, anche concentrazioni fisiologiche di farmaci possono regolare negativamente alcuni marker ossei, come ALP e osteocalcina. Infine esiste la problematica dell���eradicazione di HIV-1 dai reservoirs virali. La HAART riesce a controllare i livelli viremici, ciononostante diversi studi propongono alcuni citotipi come potenziali reservoir di infezione, vanificando l���effetto della terapia. Abbiamo, perci��, sviluppato un nuovo approccio molecolare all���eradicazione: sfruttare l���enzima virale integrasi per riconoscere in modo selettivo le sequenze LTR virali per colpire il virus integrato. Fondendo integrasi e l���endonucleasi FokI, abbiamo generato diversi cloni. Questi sono stati transfettati stabilmente in cellule Jurkat, suscettibili all���infezione. Una volta infettate, abbiamo ottenuto una significativa riduzione dei markers di infezione. Successivamente la transfezione nella linea linfoblastica 8E5/LAV, che porta integrata nel genoma una copia di HIV, ha dato risultati molto incoraggianti, come la forte riduzione del DNA virale integrato.

Regelmechanismen und Determinanten der Transkription in Polyt��nchromosomen von Chironomus und Drosophila

Die kumulative Habil.���Schrift gr��ndet sich auf 6 Originalpublikationen, die beschreiben: [Sass, H. (1982), Cell 28: 269���278]. RNA polymerase B in polytene chromosomes: Immunofluorescent and autoradiographic analysis during stimulated and repressed RNA synthesis. Elektronenmikroskopie charakterisierte das C. tentans Balbianiring BR2���Gen von Speicheldr��senchromosomen als hoch aktives 5���6 ��m langes single���copy Gen, das 33/��m RNAPolymerasen B (Pol II) transkribieren (Diss., Sass, H., 1978, Univ. T��bingen). Diese Immunfluoreszenzstudie ortet Pol II in allen Interbanden von Region IV���3B10���3B5 des nichtinduzierten BR2. Prominente Fluoreszenz im BR2���Genort 3B9/10 zeigt, das BR2���Gen ist pr��aktiv, wie erwartet. 3H���Autoradiogramme beweisen, in allen fluoreszierenden BR2, BR1, BR3, Puffs, aufgelockerten Banden, Interbanden und Loci ohne Puffing, synthetisiert Pol II RNA. Die genomweite st��ndige Pol II���Pr��senz zeigt, dass, wie beim nichtinduzierten BR2���Gen, bereits schon gebundene Pol II wohl auch andere Gene pr��aktiviert. So erfolgt die Regulation der Transkription mehr ��ber die transkriptionelle Elongation. Auch durch �����Amanitin, oder Actinomycin D, oder Hitzeschock in vivo kollabierte BR2, BR1, BR3 besitzen Pol II. [Sass, H. (1984), Chromosoma 90: 20���25]. Gene identification in polytene chromosomes: some Balbiani ring 2 gene sequences are located in an interband���like region of Chironomus tentans. Immunfluoreszenz und 3H���Autoradiographie zeigen, dass Injektionen von DRB in Larven die Balbianiringe (BR) sowie andere Puffs und deren Pol II���Konzentration dramatisch reduzieren. Trotzdem zeigen 3H���Uridin markierte Speicheldr��senchromosomen, dass RNA���Synthese doch in nichtinduzierten BR2, BR1, BR3 erfolgt, aber nur auf reduziertem Level. Das widerspricht der von Egyh��zi E. (1975, PNAS 73:947���950) propagierten ���Inhibition of Balbiani ring RNA synthesis at the initiation level��� durch DRB. Vielmehr sieht es so aus, DRB wirkt bei der transkriptionellen Elongation inhibierend. Durch in situ���Hybridisierung von Sequenzen klonierter BR2���DNA wurde in Speicheldr��senchromosom IV das BR2���Gen in Region 3B9/10 direkt identifiziert. [Sass, H. and Pederson, T. (1984), J. Mol. Biol. 180: 911���926]. Transcription���dependent localization of U1 and U2 small nuclear ribonucleoproteins at major sites of gene activity in polytene chromosomes. Immunolokalisation von Sm���, U1��� und U2snRNP���spezifischen Antigenen in Speicheldr��senchromosomen von C. tentans hat zur Entdeckung der beim Splei��en von pr�����mRNA beteiligten U1/U2snRNPs in Balbianiringen BR2, BR1, BR3 sowie anderen Puffs und aufgelockerten Banden gef��hrt. Die ��berraschenden BR���Daten zeigen erstmals: (i) Der Splei�����Apparat ist in Genloci mit intensiver RNA���Synthese schon vorhanden. (ii) Immunfluoreszenz reflektiert den Exon���Intron���Bau dieser BR���Gene. (iii) Transkription und splei��osomales Ausschneiden von Introns sind koordiniert. [Sass, H. (1989), Nucleic Acids Research 17: 10508]. Hsp82���neo transposition vectors to study insertional mutagenesis in Drosophila melanogaster and tissue culture cells; [Sass, H. (1990), Gene 89: 179���186]. P���transposable vectors expressing a constitutive and thermoinducible hsp82���neo fusion gene for Drosophila germline transformation and tissue���culture transfection. Beschrieben sind Design, Konstruktion und Expression der Genfusion hsp82���neo als ein in vivo selektierbares Reporter���/Markergen, die Transposons P{hsp82���neo/Adh} sowie P{hsp82���neo} und Transformations���Vektoren pHS22, pHS24, pHS85, pHS103 und pHS104. Sie stellen das von der Fliege gebildete Enzym bakteriellen Ursprungs, Neomycin���Phosphotransferase II, f��r die G418���Selektion bereit, um die Position, Struktur, Expression und Funktion von Genen mittels hsp82���neo���Mutagenese zu erforschen. [Sass, H. and Meselson, M. (1991), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 6795���6799]. Dosage compensation of the Drosophila pseudoobscura Hsp82 gene and the D. melanogaster Adh gene at ectopic sites in D. melanogaster. Quantitative Unterschiede in der Dosiskompensation des X���chromosomalen hsp82���Gens von D. pseudoobscura und autosomalen Adh���Gens von D. melanogaster wurden als Erh��hung der RNAMenge in D. melanogaster gemessen. Beide Transgene sind dosiskompensiert, sprang P{hsp82��� neo/Adh} in euchromatische Regionen des D. melanogaster X���Chromosoms. Beide Transgene sind nicht dosiskompensiert, insertierte P{hsp82���neo/Adh} ins �����Heterochromatin in Region 20 an der Basis des X. Keine der zehn autosomalen Insertionen ist dosiskompensiert. Die Ergebnisse lassen vermuten, dass X���chromosomale regulatorische Sequenzen, die f��r die Verst��rkung der Genaktivit��t um Faktor 2 in M��nnchen verantwortlich sind, geh��uft im X vorkommen, jedoch im ����� Heterochromatin und den Autosomen fehlen. Das Kompensationsverhalten der transponierten Gene wird durch das neue chromosomale Milieu des Insertionsortes bestimmt.

Involvement of microRNAs in Androgen Receptor-dependent Breast Cancers

Triple negative breast cancer (TNBC) is a very aggressive tumor subtype characterized by the lack of expression of estrogen receptor 1 (ESR1), due in the most of cases to an increased expression of DNA methyltransferases (DNMTs) and hypermethylation in CpG islands, resulting in gene silencing. Furthermore, in ESR1- negative breast cancers, androgen receptor (AR) is highly expressed and some studies suggest that it can drive tumor progression and might represent a therapeutic target. A correlation between microRNAs, small non-coding RNAs that regulate gene expression, and DNMTs was investigated in a TNBC cell line to restore a normal methylation pattern of ESR1, leading to its re-expression and conferring again sensitivity to selective estrogen receptor modulators (SERMs). miR-148A and miR-29B were found to be involved in the reduction of the expression of DNMT1 and DNMT3A and in a slight increase of ESR1 expression, but not at protein level. Then, we found a down-regulation of AR by miRs-7, -9, -27a, -27b, -29a, -29b, -29c, -127-3p, -127-5p and -376 at 48h post transfection and an up-regulation by miR-15a and miR-16 at every time considered. We concomitantly investigated a possible increase of Tamoxifen, Herceptin and Metformin sensitivity after AR silencing in MDA-MB 453 and T-47D cell lines. Cells seemed more sensitive when silenced for AR only in MDA-MB-453 at 24h post Tamoxifen treatment. Studies on Metformin have basically confirmed an increase of drug sensitivity due to AR silencing in both cell lines. Analysis of Herceptin showed how MDA-MB 453 samples silenced for AR have a slight decrease in the percentage of proliferating cells, demonstrating a possible increase in the response to treatment. These preliminary data provide the basis for further study of the modulation of the expression of AR by microRNAs and it will be interesting to understand the molecular mechanisms underlying these interactions.

Polykation-DNA-Komplexe : Eigenschaften und Anwendung in der Gentransfektion

Polykationen bilden mit DNA spontan Komplexe. Triebkraft ist der Entropiegewinn durch Freisetzung der Gegenionen auf den Polyelektrolyten. Solche Komplexe k��nnen in der Gentechnik verwendet werden, um fremde DNA in eine Zelle einzuschleusen. Dies bezeichnet man als Gentransfektion. In dieser Arbeit werden erstmals b��rstenf��rmige Polykationen mit wurmf��rmiger Topologie zur Gentransfektion verwendet. Dazu wurde die Komplexierung von DNA mit B��rstenpolymeren mit Poly-L-Lysin- und Polyvinylpyridinium-Seitenketten und linearen Polykationen untersucht. Die Komplexbildung verl��uft in allen F��llen kinetisch kontrolliert, alle Polykationen bilden sph��rische Komplexe, die Topologie hat keinen Einfluss auf die Komplexgr����e. Komplexe aus B��rstenpolymeren transfizieren mehr als 25% der gesamten Zellpopulation bei Schweinehirnendothelzellen. Gegen��ber dem kommerziellen Transfektionsmittel Lipofektamin konnte eine deutliche Steigerung um bis zu 400% erreicht werden. Komplexe, die mit linearen Analoga gebildet wurden, zeigten bei gleicher Komplexgr����e Transfektionsraten unter 5%. Freisetzungsversuche zeigen, dass die Komplexe, die gut transfizieren, recht labil sind, also die DNA unter Kompetitoreinfluss freisetzen k��nnen. Stabile Komplexe haben geringe Transfektionseffizienzen. Ebenso wichtig ist der Schutz der DNA vor Abbau durch DNase. Die PVP-B��rste bietet als einziges der untersuchten Polykationen diesen Schutz und zeigt auch die besten Transfektionsraten. Zus��tzlich zu der medizinischen Anwendung wurde die Kinetik der Komplexbildung untersucht. Dazu wurde ein spezieller Aufbau entwickelt, der es erm��glicht die Streuintensit��t der Komplexl��sung bei kleinen Streuwinkeln zeitaufgel��st im Millisekundenbereich zu detektieren. Die Komplexbildung verl��uft diffusionskontrolliert, im Bereich von Ladungsverh��ltnissen (positive zu negativen Ladungen) von 1.8 bis 4.0 schlie��t sich ein fraktales Wachstum an.

Functionalization and detection of RNA and its modifications

Unterschiedlich substituierte Reagenzien, basierend auf dem Cumarin K��rper, wurden untersucht und Struktur-Funktions-Beziehungsstudien zeigten eine Selektivit��t f��r ein nat��rlich vorkommendes, modifiziertes Nukleosid, 4-Thiouridine (s4U). Im Verlauf dieser Experimente, fiel ein multifunktionales Cumarin, namens PBC, aus mehreren Gr��nden auf. Neben seiner 2000 fachen Selektivit��t f��r s4U gegen��ber Uridin, besitzt PBC ein zus��tzliches terminales Alkin f��r Konjugationsreaktionen mit Aziden. Es wurde zus��tzlich zur Fluoreszenzmarkierung von small interfering RNA benutzt, deren Fluoreszenz in Zellen beobachtet werden konnte. Mit PBC kommt ein neues chemisches Reagenz zur Detektion von modifizierten Nukleosiden zum bereits vorhandenen Repertoire hinzu.rnDiese Arbeit zeigt zus��tzlich eine neue Labelingstrategie, basierend auf einem kleinen, multifunktionalen chemischen Reagenz, welches spezifisch mit Uridinen in RNA reagiert. Dieses Cumarin-basierte Reagenz, namens N3BC, hat den Vorteil (I) post-transkriptionell gegen��ber allen m��glichen RNAs einsetzbar zu sein, (II) Fluoreszenz zu zeigen und (III) eine weitere funktionelle Gruppe zu besitzen, die in Biokonjugationsreaktionen einsetzbar ist. Die letzteren umfassen z.B. die durch UV ausgel��sten crosslinking Experimente mit verwandten Proteinen, sowie die bioorthognale CuAAC Reaktion mit fluoreszenten Alkin-Farbstoffen.rnF��r verl��ssliche Detektion wurden mehrere LC-MS/MS Methoden, zur Identifizierung und Quantifizierung von bis zu 21 Ribonukleosiden und 5 Deoxyribonukleosiden in einem Einzellauf, entwickelt. Zus��tzlich wurden diese Methoden in mehreren Studien, haupts��chlich von Methyltransferasen, angewandt. rn

Antigenspezifische DNA-Immunisierung in Kombination mit IDO-kodierenden Plasmiden zur Therapie der experimentellen Typ I-Allergie

Derzeit stellt die allergenspezifische Immuntherapie die einzige nicht allein antisymptomatische Behandlungsform zur langfristigen Therapie von Typ I-Allergien dar, welche grundlegende ��nderungen im immunologischen Geschehen induziert. Sie ist jedoch verbesserungsw��rdig in Bezug auf Behandlungsdauer, Erfolgschancen und Nebenwirkungen. Daher wurde in dieser Arbeit eine Strategie zur Therapie von Typ I-Allergien entwickelt und evaluiert, welche auf der Inhibition allergenspezifischer T-Zellen durch Dendritische Zellen (DC), die selektiv nach DNA-Immunisierung sowohl das relevante Allergen als auch Indolamin 2,3-dioxygenase (IDO) konstitutiv produzieren, basiert. IDO ist ein Enzym aus dem Tryptophan-Stoffwechsel, dessen Produktion durch DC einen lokalen immunsuppressiven Mechanismus induziert und in verschiedenen Situationen mit der Induktion peripherer Toleranz assoziiert ist. Zun��chst wurden Plasmide hergestellt, die entweder IDO alleine oder IDO zusammen mit dem Antigen unter der Kontrolle des ubiquit��r aktiven CMV- bzw. des DC-spezifischen Fascin-Promotors kodieren. Die ��berpr��fung der IDO-Expression durch die monocistronischen Plasmide anhand von Transfektionsexperimenten in vitro ergab, dass die IDO-Expression unter der Kontrolle des CMV-Promotors sehr viel st��rker ausfiel als unter der Kontrolle des Fascin-Promotors. Nach Transfektion mit den bicistronischen Vektoren, in denen die Transgene f��r das Antigen und IDO durch eine IRES-Sequenz verbunden waren, war die IDO-Expression jedoch insgesamt sehr schwach. Im Rahmen der ��berpr��fung der Funktionalit��t der IDO-Expressionplasmide in vivo unter Verwendung der Genpistole wurden daher lediglich Plasmide getestet, die alleine IDO unter der Kontrolle des CMV-Promotors bzw. des Fascin-Promotors kodieren. Auch in vivo wurde eine st��rkere IDO-Expression nach biolistischer Transfektion mit solchen Vektoren beobachtet, in denen der CMV-Promotor zur Expressionskontrolle verwendet wurde. Die Analyse des Einflusses einer Koexpression von IDO auf die durch biolistische Immunisierung mit einem antigenkodierenden Vektor induzierte systemische Immunantwort offenbarte einen inhibitorischer Effekt f��r den Fall, dass die Antigenproduktion mittels des Fascin-Promotors auf DC fokussiert war und die Expression des koapplizierten IDO-Transgens unter der Kontrolle des CMV-Promotors stand. In diesem Fall wurde eine Reduktion der antigenspezifischen IgG1- und IgG2a-Produktion, eine verringerte Sekretion von IFN-y durch restimulierte Milz- und Lymphknotenzellen sowie eine Reduktion der Zahl antigenspezifischer CD8+ Effektor-T-Zellen nachgewiesen. Im Mausmodell der IgE-vermittelten Typ I-Allergie wurde weiterhin gezeigt, dass nach prophylaktischer biolistischer Vakzinierung unter Verwendung dieser Vektorkombination eine Inhibition der durch die Vakzinierung bedingten antigenspezifischen Th1-Immunantwort ausgel��st wurde. Die Suppression der Th2-Antwort, welche durch Transfektion mit dem Antigenkodierenden Vektor unter Kontrolle des Fascin-Promotors bewirkt wurde, wurde durch Kotransfektion mit den IDO-kodierenden Vektoren aufrecht erhalten.

Synthese und Charakterisierung von Polymeren mit peptidischen Seitenketten

Die Forschung im Bereich der Drug Delivery-Systeme konzentriert sich auf biokompatible und wenig immunogene Tr��germolek��le. Eine Klasse vielversprechender Tr��gersysteme stellen Peptid basierte Polymere dar, die neben einer hohen Biokompatibilit��t auch eine Sensitivit��t gegen��ber externen Einfl��ssen aufweisen. Der zwitterionische Charakter von Aminos��uren und Peptiden verhindert die Adsorption von Serumproteinen und ein ���antifouling��� Verhalten kann festgestellt werden, sodass diese Molek��le f��r den Einsatz als Wirkstofftr��gersystem sehr geeignet scheinen. In Kombination mit einer b��rstenartigen Struktur entstehen Systeme mit einer einzigartigen Peptidarchitektur, die sich durch eine hohe Dichte funktioneller Gruppen f��r Konjugationsreaktionen auszeichnen und deren formabh��ngige Zellaufnahme sie besonders attraktiv f��r die Anwendung als ���Nanocarrier��� macht.rnrnDas zwitterionische Poly-(��-N-Methacryloyl-L-Lysin) (Mw = 721,000 g���mol 1) wurde durch freie radikalische Polymerisation dargestellt und seine Konformation in Abh��ngigkeit von Ionenst��rke und pH-Wert untersucht. Die Biokompatibilit��t des Systems konnte durch Toxizit��tstests und dynamische Lichtstreuung in humanem Blutserum nachgewiesen werden. Zusammen mit der vernachl��ssigbaren unspezifischen Aufnahme in dendritische Zellen aus Knochenmark erf��llt das System damit alle Bedingungen, die an ein polymeres Wirkstofftr��gersystem gestellt werden. Dar��ber hinaus k��nnen Komplexe des Polymers mit DNA in Gegenwart von divalenten Metallionen f��r die Gentransfektion verwendet werden.rnrnDurch Kopplung von ��-N-Methacryloyl-L-Lysin mit der Elastin-��hnlichen Polypeptid Pentasequenz Valin-Prolin-Glycin-Glycin-Glycin konnte ein Hexapeptid-Makromonomer dargestellt werden, welches anschlie��end mittels ���grafting through��� Polymerisation zur Polymerb��rste umgesetzt wurde. Die wurmartige Struktur der Polymerb��rsten wurde in AFM-Aufnahmen gezeigt und eine hohe Kettensteifigkeit der Polymerb��rsten ��ber dynamische und statische Lichtstreuung nachgewiesen. Zirkulardichroismus-Messungen lieferten Informationen ��ber struktur-, salz- und temperaturabh��ngige Ver��nderungen der Konformation. Toxizit��tstests und dynamische Lichtstreuung in humanem Blutserum best��tigten die erwartete Biokompatibilit��t.rnrnBasierend auf zwei Elastin-��hnlichen Polypeptiden mit ��hnlicher Peptidsequenz wurden insgesamt vier unterschiedliche Makromonomere mit jeweils 20 Pentapeptid-Wiederholungseinheiten dargestellt. ��ber anschlie��ende ���grafting through��� Polymerisation entstanden molekulare B��rstenmolek��le mit variierenden externen funktionellen Gruppen, die f��r zuk��nftige Konjugationsreaktionen verwendet werden k��nnen. Der Einfluss von Ionenst��rke und Temperatur auf die Konformation der Makromonomere und Polymere wurde mittels Zirkulardichroismus- und Tr��bungskurven-Messungen untersucht und ein starker Einfluss der hohen Seitenkettendichte auf das Verhalten der Polymerb��rsten wurde festgestellt. ��ber dynamische Lichtstreuung konnte ein von den externen funktionellen Gruppen abh��ngiges Aggregationsverhalten in humanem Blutserum nachgewiesen werden.rnrnDie in dieser Arbeit synthetisierten Polymerb��rsten mit peptidischen Seitenketten stellen damit biokompatible und vielversprechende Tr��gersysteme f��r die Konjugation mit Biomolek��len dar, die zuk��nftig als Drug Delivery-Systeme ihren Einsatz finden k��nnen.rn