Identifizierung und Charakterisierung von Zielantigenen alloreaktiver zytotoxischer T-Zellen mittels cDNA-Bank-Expressionsklonierung in akuten myeloischen Leukämien

Allogene hämatopoetische Stammzelltransplantationen (HSZTs) werden insbesondere zur Behandlung von Patienten mit Hochrisiko-Leukämien durchgeführt. Dabei bewirken T-Zellreaktionen gegen Minorhistokompatibilitätsantigene (mHAgs) sowohl den therapeutisch erwünschten graft-versus-leukemia (GvL)-Effekt als auch die schädigende graft-versus-host (GvH)-Erkrankung. Für die Identifizierung neuer mHAgs mittels des T-Zell-basierten cDNA-Expressionsscreenings waren leukämiereaktive T-Zellpopulationen durch Stimulation naïver CD8+-T-Lymphozyten gesunder HLA-Klasse I-identischer Buffy Coat-Spender mit Leukämiezellen von Patienten mit akuter myeloischer Leukämie (AML) generiert worden (Albrecht et al., Cancer Immunol. Immunother. 60:235, 2011). Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde mit diesen im AML-Modell des Patienten MZ529 das mHAg CYBA-72Y identifiziert. Es resultiert aus einem bekannten Einzelnukleotidpolymorphismus (rs4673: CYBA-242T/C) des Gens CYBA (kodierend für Cytochrom b-245 α-Polypeptid; syn.: p22phox), der zu einem Austausch von Tyrosin (Y) zu Histidin (H) an Aminosäureposition 72 führt. Das mHAg wurde von T-Lymphozyten sowohl in Assoziation mit HLA-B*15:01 als auch mit HLA-B*15:07 erkannt. Eine allogene T-Zellantwort gegen CYBA-72Y wurde in einem weiteren AML-Modell (MZ987) beobachtet, die ebenso wie in dem AML-Modell MZ529 polyklonal war. Insgesamt konnte bei drei von fünf getesteten HLA-B*15:01-positiven Buffy Coat-Spendern, die homozygot für CYBA-72H (H/H) waren, eine CYBA-72Y-spezifische T-Zellantwort generiert werden. Das von den T-Lymphozyten übereinstimmend in niedrigster Konzentration erkannte Peptid umfasste die Aminosäuren 69 - 77, wobei das homologe Peptid aus CYBA-72H auch in hohen Konzentrationen keine Reaktivität auslöste. Eine reziproke Immunogenität des mHAg ist bislang nicht belegt. T-Lymphozyten gegen CYBA-72Y erkannten Leukämiezellen bei acht von zwölf HLA-B*15:01-positiven Patienten (FAB-Subtypen: M1, M2, M4, M5). Da das Gen CYBA für eine Komponente des mikrobiziden Oxidasesystems von phagozytierenden Zellen kodiert, ist es überwiegend in Zellen des hämatopoetischen Systems exprimiert. Von Leukozytensubtypen, aufgereinigt aus HLA-B*15:01-positiven Buffy Coat-Spendern mit CYBA-242T-Allel, wurden Monozyten und daraus abgeleitete dendritische Zellen durch CYBA-72Y-reaktive T-Lymphozyten sehr stark, untransformierte B-Zellen in weit geringerem Maße und Granulozyten sowie T-Lymphozyten nicht erkannt. Das für CYBA-72Y kodierende Allel CYBA-242T wurde bei 56% aller getesteten gesunden Spender und Malignompatienten (n=481) nachgewiesen. Unter Berücksichtigung der Häufigkeit des präsentierenden HLA-Allels ist davon auszugehen, dass etwa 4,5% der Kaukasier das mHAg CYBA-72Y zusammen mit HLA-B*15:01 tragen. Nach bisherigen Beobachtungen führt ein immunogener CYBA-72Y-Mismatch bei allogenen HSZTs nicht notwendigerweise zu einer schweren GvH-Erkrankung. Das hier beschriebene mHAg CYBA-72Y erscheint potenziell geeignet, im Rahmen einer allogenen HSZT die präferenzielle Elimination der Empfänger-Hämatopoese unter Einschluss von myeloischen Leukämiezellen zu bewirken. Jedoch sind weiterführende Untersuchungen erforderlich, um die therapeutische Relevanz des Antigens zu belegen.

Intraflagellar transport in the developing and mature vertebrate retina

Intraflagellar transport (IFT) is required for the assembly and maintenance of cilia. In this study we analyzed the subcellular localization of IFT proteins in retinal cells by correlative high-resolution immunofluorescence and immunoelectron microscopy. The rod photoreceptor cell was used as a model system to analyze protein distribution in cilia. To date the expression of IFT proteins has been described in the ciliary region without deciphering the precise spatial and temporal subcellular localization of IFT proteins, which was the focus of my work. rnThe establishment of the pre-embedding immunoelectron method was an important first step for the present doctoral thesis. Results of this work reveal the differential localization of IFT20, IFT52, IFT57, IFT88, IFT140 in sub-ciliary compartments and also their presence in non-ciliary compartments of retinal photoreceptor cells. Furthermore, the localization of IFT20, IFT52 and IFT57 in dendritic processes of non-ciliated neurons indicates that IFT protein complexes also operate in non-ciliated cells and may participate in intracellular vesicle trafficking in eukaryotic cells in general.rnIn addition, we have investigated the involvement of IFT proteins in the ciliogenesis of vertebrate photoreceptor cilia. Electron microscopy analyses revealed six morphologically distinct stages. The first stages are characterized by electron dense centriolar satellites and a ciliary vesicle, while the formation of a ciliary shaft and of the light sensitive outer segment disks are features of the later stages. IFT proteins were expressed during all stages of photoreceptor cell development and found to be associated with the ciliary apparatus. In addition to the centriole and basal body IFT proteins are present in the photoreceptor cytoplasm, associated with centriolar satellites, post-Golgi vesicles and with the ciliary vesicle. Therewith the data provide an evidence for the involvement of IFT proteins during ciliogenesis, including the formation of the ciliary vesicle and the elongation of the primary cilium of photoreceptor cells. Moreover, the cytoplasmic localization of IFT proteins in the absence of a ciliary shaft in early stages of ciliogenesis indicates roles of IFT proteins beyond their well-established function for IFT in mature cilia and flagella. rn

Analyse der intrazellulären Freisetzung von Wirkstoffmodellen via konfokaler Laser-Raster-Mikroskopie

In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, wie man das Potential nanopartikulärer Systeme, die vorwiegend via Miniemulsion hergestellt wurden, im Hinblick auf „Drug Delivery“ ausnutzen könnte, indem ein Wirkstoffmodell auf unterschiedliche Art und Weise intrazellulär freigesetzt wurde. Dies wurde hauptsächlich mittels konfokaler Laser-Raster-Mikrokopie (CLSM) in Kombination mit dem Bildbearbeitungsprogramm Volocity® analysiert.rnPBCA-Nanokapseln eigneten sich besonders, um hydrophile Substanzen wie etwa Oligonukleotide zu verkapseln und sie so auf ihrem Transportweg in die Zellen vor einem etwaigen Abbau zu schützen. Es konnte eine Freisetzung der Oligonukleotide in den Zellen aufgrund der elektrostatischen Anziehung des mitochondrialen Membranpotentials nachgewiesen werden. Dabei war die Kombination aus Oligonukleotid und angebundenem Cyanin-Farbstoff (Cy5) an der 5‘-Position der Oligonukleotid-Sequenz ausschlaggebend. Durch quantitative Analysen mittels Volocity® konnte die vollständige Kolokalisation der freigesetzten Oligonukleotide an Mitochondrien bewiesen werden, was anhand der Kolokalisationskoeffizienten „Manders‘ Coefficients“ M1 und M2 diskutiert wurde. Es konnte ebenfalls aufgrund von FRET-Studien doppelt markierter Oligos gezeigt werden, dass die Oligonukleotide weder beim Transport noch bei der Freisetzung abgebaut wurden. Außerdem wurde aufgeklärt, dass nur der Inhalt der Nanokapseln, d. h. die Oligonukleotide, an Mitochondrien akkumulierte, das Kapselmaterial selbst jedoch in anderen intrazellulären Bereichen aufzufinden war. Eine Kombination aus Cyanin-Farbstoffen wie Cy5 mit einer Nukleotidsequenz oder einem Wirkstoff könnte also die Basis für einen gezielten Wirkstofftransport zu Mitochondrien liefern bzw. die Grundlage schaffen, eine Freisetzung aus Kapseln ins Zytoplasma zu gewährleisten.rnDer vielseitige Einsatz der Miniemulsion gestattete es, nicht nur Kapseln sondern auch Nanopartikel herzustellen, in welchen hydrophobe Substanzen im Partikelkern eingeschlossen werden konnten. Diese auf hydrophobe Wechselwirkungen beruhende „Verkapselung“ eines Wirkstoffmodells, in diesem Fall PMI, wurde bei PDLLA- bzw. PS-Nanopartikeln ausgenutzt, welche durch ein HPMA-basiertes Block-Copolymer stabilisiert wurden. Dabei konnte gezeigt werden, dass das hydrophobe Wirkstoffmodell PMI innerhalb kürzester Zeit in die Zellen freigesetzt wurde und sich in sogenannte „Lipid Droplets“ einlagerte, ohne dass die Nanopartikel selbst aufgenommen werden mussten. Daneben war ein intrazelluläres Ablösen des stabilisierenden Block-Copolymers zu verzeichnen, welches rn8 h nach Partikelaufnahme erfolgte und ebenfalls durch Analysen mittels Volocity® untermauert wurde. Dies hatte jedoch keinen Einfluss auf die eigentliche Partikelaufnahme oder die Freisetzung des Wirkstoffmodells. Ein großer Vorteil in der Verwendung des HPMA-basierten Block-Copolymers liegt darin begründet, dass auf zeitaufwendige Waschschritte wie etwa Dialyse nach der Partikelherstellung verzichtet werden konnte, da P(HPMA) ein biokompatibles Polymer ist. Auf der anderen Seite hat man aufgrund der Syntheseroute dieses Block-Copolymers vielfältige Möglichkeiten, Funktionalitäten wie etwa Fluoreszenzmarker einzubringen. Eine kovalente Anbindung eines Wirkstoffs ist ebenfalls denkbar, welcher intrazellulär z. B. aufgrund von enzymatischen Abbauprozessen langsam freigesetzt werden könnte. Somit bietet sich die Möglichkeit mit Nanopartikeln, die durch HPMA-basierte Block-Copolymere stabilisiert wurden, gleichzeitig zwei unterschiedliche Wirkstoffe in die Zellen zu bringen, wobei der eine schnell und der zweite über einen längeren Zeitraum hinweg (kontrolliert) freigesetzt werden könnte.rnNeben Nanokapseln sowie –partikeln, die durch inverse bzw. direkte Miniemulsion dargestellt wurden, sind auch Nanohydrogelpartikel untersucht worden, die sich aufgrund von Selbstorganisation eines amphiphilen Bock-Copolymers bildeten. Diese Nanohydrogelpartikel dienten der Komplexierung von siRNA und wurden hinsichtlich ihrer Anreicherung in Lysosomen untersucht. Aufgrund der Knockdown-Studien von Lutz Nuhn konnte ein Unterschied in der Knockdown-Effizienz festgestellt werden, je nach dem, ob 100 nm oder 40 nm große Nanohydrogelpartikel verwendet wurden. Es sollte festgestellt werden, ob eine größenbedingte, unterschiedlich schnelle Anreicherung dieser beiden Partikel in Lysosomen erfolgte, was die unterschiedliche Knockdown-Effizienz erklären könnte. CLSM-Studien und quantitative Kolokalisationsstudien gaben einen ersten Hinweis auf diese Größenabhängigkeit. rnBei allen verwendeten nanopartikulären Systemen konnte eine Freisetzung ihres Inhalts gezeigt werden. Somit bieten sie ein großes Potential als Wirkstoffträger für biomedizinische Anwendungen.rn

Synthese und Charakterisierung biologischer Hybridpolymere zur gentechnologischen Anwendung

KurzfassungrnrnZiel der vorliegenden Arbeit war es eine gezielte, hochspezifische Inhibierung der Proteinbiosynthese zu erreichen. Dies kann durch eine Blockierung des mRNA-Strangs durch komplementäre DNA/RNA-Stränge (ähnlich zur Antisense-Methode) oder durch die Hydrolyse des mRNA-Strangs mit Hilfe spezieller Enzyme (RNasen) realisiert werden. Da jedoch beide Methoden nicht zu zufriedenstellenden Ergebnissen führen, wäre deshalb eine Kombination aus beiden Methoden ideal, welche in einer spezifischen, gezielten und permanenten Ausschaltung der Proteinbiosynthese resultieren würde. Um dieses Ziel zu verwirklichen, ist es nötig, ein Molekül zu synthetisieren, welches in der Lage ist selektiv an einer spezifischen Position an den RNA-Strang zu hybridisieren und anschließend den RNA-Strang an dieser zu hydrolysieren. Der große Vorteil dieses Konzepts liegt darin, dass die DNA-Sequenz für die Hybridisierung an die entsprechende RNA maßgeschneidert hergestellt werden kann und somit jede RNA gezielt angesteuert werden kann, was letztendlich zu einer spezifischen Inhibierung der korrespondierenden Proteinbiosynthese führen soll.rnDurch die Verwendung und Optimierung der Nativen Chemischen Ligation (NCL) als Konjugationsmethode konnten zwei Biomakromoleküle in Form einer 46-basenlangen DNA (komplementär zum RNA-Strang) und einer 31-aminosäurelangen RNase kovalent verknüpft werden. Durch unterschiedliche chemische und molekularbiologische Analysemethoden, wie PAGE, GPC, CE, MALDI-ToF-MS etc., war es zudem möglich, die erfolgreiche Synthese dieses biologischen Hybridpolymers als monodisperses, reines Produkt zu bestätigen. rnDie Synthese des ca. 800-basenlangen RNA-Strangs, der als Modell-Matrize für die selektive und spezifische Degradierung durch das DNA-RNase-Konjugat dienen sollte, konnte unter Zuhilfenahme gentechnologischer Standard-Methoden erfolgreich bewerkstelligt werden. Weiterhin konnte durch die Verwendung der radioaktiven cDNA-Synthese gezeigt werden, dass das DNA-RNase-Konjugat an die gewünschte Stelle des RNA-Strangs hybridisiert. Die Identifizierung einer anschließenden spezifischen Hydrolyse des RNA-Strangs durch die an den DNA-Strang angeknüpfte RNase war aufgrund der geringen katalytischen Aktivität des Enzyms bisher allerdings nicht möglich.rn

Mechanical properties and structure of gel systems

Understanding the origins of the mechanical properties and its correlation withrnthe microstructure of gel systems is of great scientific and industrial interest. Inrngeneral, colloidal gels can be classified into chemical and physical gels, accordingrnto the life time of the network bonds. The characteristic di↵erences in gelationrndynamics can be observed with rheological measurements.rnAs a model system, a mixture of sodium silicate and low concentration sulfuric acidrnwas used. Nano-sized silica particles grow and aggregate to a system-spanning gelrnnetwork. The influence of the finite solubility of silica at high pH on the gelationrnwas studied with classical and piezo rheometer. The storage modulus of therngel grew logarithmically with time with two distinct growth laws. A relaxationrnat low frequency was observed in the frequency dependent measurements. I attributernthese two behaviors as a sign of structural rearrangements due to the finiternsolubility of silica at high pH. The reaction equilibrium between formation andrndissolution of bonds leads to a finite life time of the bonds and behavior similar tornphysical gel. The frequency dependence was more pronounced for lower water concentrations,rnhigher temperatures and shorter reaction times. With two relaxationrnmodels, I deduced characteristic relaxation times from the experimental data. Besidesrnrheology, the evolution of silica gels at high pH on di↵erent length scales wasrnstudied by NMR and dynamic light scattering. The results revealed that the primaryrnparticles existed already in sodium silicate and aggregated after the mixingrnof reactants due to a chemical reaction. Throughout the aggregation process thernsystem was in its chemical reaction equilibrium. Applying large oscillatory shearrnstrain to the gel allowed for modifying the gel modulus. The e↵ect of shear andrnshear history on the rheological properties of the gel were investigated. The storagernmodulus of the final gel increased with increasing strain. This behavior can be explained with (i) shear-induced aggregate compaction and (ii) combination ofrnbreakage and new formation of bonds.rnIn comparison with the physical gel-like behavior of the silica gel at high pH, typicalrnchemical gel features were exhibited by other gels formed from various chemicalrnreactions. Influences of the chemical structure modification on the gelation wererninvestigated with the piezo-rheometer. The external stimuli can be applied to tunernthe mechanical properties of the gel systems.

Wet bioadhesion in tree frogs

Viele Tiere wie etwa Geckos oder Laubfrösche können mittels ihrer Haftscheiben an Oberflächen kleben. Diese Haftscheiben ermöglichen es den Tieren, sich während ihrerrnFortbewegung an Oberflächen anzuheften und wieder zu lösen unabhängig von denrnvorherrschenden Umweltbedingungen. Frösche besitzen mikro- und nanostrukturierternsowie charakteristisch geformte Haftscheiben an Finger- und Zehenenden. Ihre besonderernevolutionäre Errungenschaft, sich stark und zugleich reversibel in sowohl trockenen alsrnauch feuchten Umgebungen anzuhaften, hat die Wissenschaft zur Nachahmung und Untersuchungrndieser Strukturen inspiriert. Zum besseren Verständnis der Mechanismen vonrnAnhaftung und Loslösung bei Laubfröschen wurden weiche, elastische und mikrostrukturierternOberflächen hergestellt, indem PDMS (Polydimethylsiloxan) auf einer Siliziummaskernmit Hexagonstruktur aufgetragen und vernetzt wurde. Dadurch wurden Anordnungenrnvon hexagonalen Mikrosäulen mit spezifischen geometrischen Eigenschaften undrnunterschiedlichen Kontaktgeometrien (normale, flache Form, T-Form und konkave Formrnder Säulenenden) erhalten. Um den Einfluss der van-der-Waals, hydrodynamischen,rnKapillar-und Adhäsionskräfte zu verstehen, wurden verschiedene experimentelle Ansätzernverfolgt: Die auf eine einzelne Säule wirkenden Adhäsionskräfte wurden mittelsrnRasterkraftmikroskopie gemessen. Dazu wurden speziell hergestellte kolloidale Sensorenrnverwendet. Diese Experimente wurden sowohl mit als auch ohne Flüssigkeitsfilm auf derrnSäule durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten den Beitrag von Kapillarkraft und direktenrnKontaktkräften zur Adhäsionskraft bei Vorliegen eines Flüssigkeitsfilms. Die Adhäsionrnfiel umso größer aus, je weniger Flüssigkeit zwischen Sensor und Säule vorhanden war.rnIm Falle einer trockenen Adhäsion zeigte die Säule mit T-Form die höchste Adhäsion. Darndie Haftscheiben der Laubfrösche weich sind, können sie dynamisch ihre Form ändern,rnwas zu einer Änderung der hydrodynamischen Kraft zwischen Scheibe und Oberflächernführt. Der Einfluss der Oberflächenverformbarkeit auf die hydrodynamische Kraft wurderndaher am Modellsystem einer Kugel untersucht, welche sich einer weichen und ebenenrnOberfläche annähert. Dieses System wurde sowohl theoretisch über die Simulation finiterrnElemente als auch experimentell über die Messung mit kolloidalen Sonden untersucht.rnSowohl experimentelle Ergebnisse als auch die Simulationen ergaben eine Abnahme derrnhydrodynamischen Kraft bei Annäherung des kolloidalen Sensors an eine weiche undrnelastische Oberfläche. Beim Entfernen der Sensors von der Oberfläche verstärkte sichrndie hydrodynamische Anziehungskraft. Die Kraft, die zur Trennung eines Partikels von einer Oberfläche in Flüssigkeit notwendig ist, ist für weiche und elastischen Oberflächenrngrößer als für harte Oberflächen. In Bezug zur Bioadhäsion bei Laubfröschen konnternfestgestellt somit festgestellt werden, dass sich der hydrodynamische Anteil zur feuchtenrnBioadhäsion aufgrund der weichen Oberfläche erhöht. Weiterhin wurde der Einflussrndes Aspektverhältnisses der Säulen auf die Reibungskraft mittels eines kolloidalen Sensorsrnuntersucht. Gestreckte Säulen zeigten dabei eine höhere Reibung im Vergleich zu.rnSäulen mit einem gestreckten Hexagon als Querschnitt.

Nanofiber-based spectroscopy of organic molecules

This thesis reports on the experimental realization of nanofiber-based spectroscopy of organic molecules. The light guided by subwavelength diameter optical nanfibers exhibits a pronounced evanescent field surrounding the fiber which yields high excitation and emission collection efficiencies for molecules on or near the fiber surface.rnThe optical nanofibers used for the experiments presented in this thesis are realized as thernsub-wavelength diameter waist of a tapered optical fiber (TOF). The efficient transfer of thernlight from the nanofiber waist to the unprocessed part of the TOF depends critically on therngeometric shape of the TOF transitions which represent a nonuniformity of the TOF. Thisrnnonuniformity can cause losses due to coupling of the fundamental guided mode to otherrnmodes which are not guided by the taper over its whole length. In order to quantify the lossrnfrom the fundamental mode due to tapering, I have solved the coupled local mode equationsrnin the approximation of weak guidance for the three layer system consisting of fiber core andrncladding as well as the surrounding vacuum or air, assuming the taper shape of the TOFsrnused for the experiments presented in this thesis. Moreover, I have empirically studied therninfluence of the TOF geometry on its transmission spectra and, based on the results, I haverndesigned a nanofiber-waist TOF with broadband transmission for experiments with organicrnmolecules.rnAs an experimental demonstration of the high sensitivity of nanofiber-based surface spectroscopy, I have performed various absorption and fluorescence spectroscopy measurements on the model system 3,4,9,10-perylene-tetracarboxylic dianhydride (PTCDA). The measured homogeneous and inhomogeneous broadening of the spectra due to the interaction of the dielectric surface of the nanofiber with the surface-adsorbed molecules agrees well with the values theoretically expected and typical for molecules on surfaces. Furthermore, the self-absorption effects due to reasorption of the emitted fluorescence light by circumjacent surface-adsorbed molecules distributed along the fiber waist have been analyzed and quantified. With time-resolved measurements, the reorganization of PTCDA molecules to crystalline films and excimers can be observed and shown to be strongly catalyzed by the presence of water on the nanofiber surface. Moreover, the formation of charge-transfer complexes due to the interaction with localized surface defects has been studied. The collection efficiency of the molecular emission by the guided fiber mode has been determined by interlaced measurements of absorption and fluorescence spectra to be about 10% in one direction of the fiber.rnThe high emission collection efficiency makes optical nanofibers a well-suited tool for experiments with dye molecules embedded in small organic crystals. As a first experimental realization of this approach, terrylene-doped para-terphenyl crystals attached to the nanofiber-waist of a TOF have been studied at cryogenic temperatures via fluorescence and fluorescence excitation spectroscopy. The statistical fine structure of the fluorescence excitation spectrum for a specific sample has been observed and used to give an estimate of down to 9 molecules with center frequencies within one homogeneous width of the laser wavelength on average for large detunings from resonance. The homogeneous linewidth of the transition could be estimated to be about 190MHz at 4.5K.

Chemical interaction between ocean and atmosphere

The exchange of chemical constituents between ocean and atmosphere provides potentially important feedback mechanisms in the climate system. The aim of this study is to develop and evaluate a chemically coupled global atmosphere-ocean model. For this, an atmosphere-ocean general circulation model with atmospheric chemistry has been expanded to include oceanic biogeochemistry and the process of air-sea gas exchange. The calculation of seawater concentrations in the oceanic biogeochemistry submodel has been expanded from DMS, CO₂

Experimentelle Untersuchung von Phasenübergängen im kolloidalen Modellsystem harter Kugeln

Die vorliegende Arbeit behandelt den fluid-kristallinen Phasenübergang sowie den Glasübergang anhand von kolloidalen Hart-Kugel(HK)-Modellsystemen. Die Untersuchungen erfolgen dabei im Wesentlichen mit unterschiedlichen Lichtstreumethoden und daher im reziproken Raum. rnDie Analyse der Kristallisationskinetik zeigt, dass es bei der Kristallisation zu signifikanten Abweichungen vom Bild der klassischen Nukleationstheorie (CNT) kommt. Diese geht von einem einstufigen Nukleationsprozess aus, wohingegen bei den hier durchgeführten Experimenten ein mehrstufiger Prozess beobachtet wird. Vor der eigentlichen Kristallisation kommt es zunächst zur Nukleation einer metastabilen Zwischenphase, sogenannter Precursor. In einer zweiten Stufe erfolgt innerhalb der Precursor die eigentliche Nukleation der Kristallite. rnDurch weitere Analyse und den Vergleich des Kristallisations- und Verglasungsszenarios konnte das Konzept der Precursornukleation auf den Vorgang der Verglasung erweitert werden. Während die Kristallnukleation oberhalb des Glasübergangspunktes zum Erliegen kommt, bleibt der Prozess der Precursornukleation auch bei verglasenden Proben erhalten. Ein Glas erstarrt somit in einem amorphen Zustand mit lokalen Precursorstrukturen. Die Korrelation der gemessenen zeitlichen Entwicklung der strukturellen sowie der dynamischen Eigenschaften zeigt darüber hinaus, dass das bisher unverstandene Ageing-Phänomen von HK-Gläsern mit der Nukleation von Precursorn zusammenhängt.rnEin solches mehrstufiges Szenario wurde bereits in früheren Veröffentlichungen beobachtet. Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Messungen ermöglichten erstmals die Bestimmung von Kristallnukleationsratendichten (Kristall-NRD) und Ratendichten für die Precursornukleation bis über den Glasübergangspunkt hinaus. Die Kristall-NRD bestätigen die Resultate aus anderen experimentellen Arbeiten. Die weiteren Analysen der Kristall-NRD belegen, dass die fluid-kristalline Grenzflächenspannung bei der Nukleation entgegen den Annahmen der CNT nicht konstant ist, sondern mit ansteigendem Volumenbruch linear zunimmt. Die Erweiterung der CNT um eine linear zunehmende Grenzflächenspannung ermöglichte eine quantitative Beschreibung der gemessenen Kristall- sowie der Precursor-NRD, was den Schluss zulässt, dass es sich in beiden Fällen um einen Boltzmann-aktivierten Prozess handelt. rnUm die beobachteten Abweichungen des Nukleationsprozesses vom Bild der CNT näher zu untersuchen, wurden die kollektiven Partikeldynamiken in stabilen Fluiden und metastabilen Schmelzen analysiert. Im klassischen Bild wird angenommen, dass die kollektive Partikeldynamik beim Vorgang der Nukleation keine Rolle spielt. Anhand der Resultate zeigen sich Abweichungen in der Dynamik stabiler Fluide und metastabiler Schmelzen. Während die kollektive Partikeldynamik in der stabilen Schmelze von der Struktur entkoppelt ist, tritt oberhalb des Phasenübergangspunktes eine Kopplung von Struktur und Dynamik auf. Dabei treten die Abweichungen zunächst in der Umgebung des ersten Strukturfaktormaximums und somit bei den am stärksten besetzten Moden auf. Mit steigender Unterkühlung nehmen die Anzahl der abweichenden Moden sowie die Stärke der Abweichungen zu. Dieses Phänomen könnte einen signifikanten Einfluss auf den Nukleationsprozess und somit auf die Kristallisationskinetik haben. Die Analyse der Dynamik im stabilen Fluid zeigt darüber hinaus Hinweise auf eine Singularität bei Annäherung an den fluid-kristallinen Phasenübergangspunkt.rnDes Weiteren wurden im Rahmen der vorliegenden Arbeit erstmals Ratendichten für die heterogene Nukleation eines HK-Systems an einer flachen Wand mittels statischer Lichtstreuung (SLS) bestimmt. Die Ergebnisse der Messung zeigen, dass die Nukleationsbarriere der heterogenen Nukleation annähernd Null ist und folglich eine vollständige Benetzung der Wand mit einer kristallinen Monolage vorliegt. Die Erweiterung der Untersuchungen auf gekrümmte Oberflächen in Form von sphärischen Partikeln (Seeds) stellt die erste experimentelle Arbeit dar, die den Einfluss eines Ensembles von Seeds auf die Kristallisationskinetik in HK-Systemen untersucht. Die Kristallisationskinetik und die Mikrostruktur werden abhängig von Größe und Anzahldichte der Seed-Partikel signifikant beeinflusst. In Übereinstimmung mit konfokalmikroskopischen Experimenten und Simulationen spielt dabei das Radienverhältnis der Majoritäts- zur Minoritätskomponente eine entscheidende Rolle.

Austauschprozesse an Tropopausenfalten extratropischer Zyklonen

Troposphärisches Ozon ist bekannt als wichtiges Oxidationsmittel und als Vorläufergas hoch reaktiver Radikale. Es zählt zu den wichtigsten Treibhausgasen und wirkt bei hohen Konzentrationen an der Erdoberfläche giftig für alle Lebewesen. Zwar wird der Großteil des troposphärischen Ozons photochemisch produziert, ein erheblicher Anteil hat aber stratosphärischen Ursprung und wird entlang von Tropopausenfalten in Zyklonen in die Troposphäre transportiert. Dieser Transport von Luftmassen aus der Stratosphäre in diernTroposphäre (STT) kann zu einem kurzzeitigen, starken Ozonanstieg am Boden führen und langfristig die Chemie der Troposphäre beeinflussen. Die Quantifizierung des Ozoneintrages und die Identifizierung der dafür verantwortlichen Prozesse ist mit großen Unsicherheiten belastet und ein aktuelles Forschungsthema.rnAufgrund ihrer groben Auflösung ist es mit globalen Modellen nicht möglich, die Details dieser STT-Prozesse zu erfassen. Deshalb wird in dieser Arbeit das Modellsystem MECO(n) genutzt, welches das regionale Atmosphärenchemie- und Klimamodell COSMO/MESSy mit dem globalen Chemie-Klimamodell ECHAM5/MESSy (EMAC) koppelt. Eine einheitliche Prozessparametrisierung ermöglicht konsistente, simultane Simulationen in verschiedenen Modellauflösungen. Ein als Teil dieser Arbeit neu entwickeltes Submodell erlaubt die Initialisierung künstlicher, passiver Tracer in Abhängigkeit verschiedener Variablen. Mit einem auf diese Weise freigesetzten, stratosphärischen Tracer lässt sich Ozon mit stratosphärischer Herkunft von solchem, das photochemisch produziert wurde, unterscheiden.rnIm Rahmen einer Fallstudie werden die Austauschprozesse an einer Tropopausenfalte sowohl aus der Eulerischen, als auch aus der Lagrangeschen Perspektive betrachtet. Die Analyse der STT-Prozesse zeigt, dass Luftmassen aus der Stratosphäre durch turbulente und diabatische Prozesse am Rand der Tropopausenfalte in die Troposphäre gelangen und anschließend bis zum Boden transportiert werden. Diese absinkenden, stratosphärischen Luftmassen führen in den Simulationen zu Ozonanstiegen am Boden, die mit Beobachtungsdaten evaluiert werden können. Es wird gezeigt, dass die Ergebnisse der feiner auflösendenrnModellinstanz gut mit den Messungen übereinstimmen.rnIn einer Lagrangeschen Analyse lassen sich Mischungszeitskalen für STT-Prozesse bestimmen. Es wird gezeigt, dass Luftpakete, die sich länger als zehn Stunden in der Troposphäre aufhalten, diese durch den Eintrag ihrer stratosphärischen Tracereigenschaften beeinflussen und daher nicht vernachlässigbar sind. Eine weitere Studie gibt Aufschluss über die Effektivität der Mischung an Tropopausenfalten: Fast die gesamte Luftmasse, die sich zu einem bestimmten Zeitpunkt in der Tropopausenfalte befindet, gelangt innerhalb von zwei Tagen in die Troposphäre.

Monitoring kinetic processes in polymeric colloids by fluorescence correlation spectroscopy

Polymerbasierte Kolloide mit Groen im Nanometerbereich werden als aussichts- reiche Kandidaten fur die Verkapselung und den Transport von pharmazeutischen Wirkstoen angesehen. Daher ist es wichtig die physikalischen Prozesse, die die Bil- dung, Struktur und kinetische Stabilitat der polymerbasierten Kolloide beein ussen, besser zu verstehen. Allerdings ist die Untersuchung dieser Prozesse fur nanome- tergroe Objekte kompliziert und erfordert fortgeschrittene Techniken. In dieser Arbeit beschreibe ich Untersuchungen, bei denen Zwei-Farben-Fluoreszenzkreuz- korrelationsspektroskopie (DC FCCS) genutzt wurde, um Informationen uber die Wechselwirkung und den Austausch von dispergierten, nanometergroen Kolloiden zu bekommen. Zunachst habe ich den Prozess der Polymernanopartikelherstellung aus Emul- sionstropfen untersucht, welcher einen der am haugsten angewendeten Prozesse der Nanopartikelformulierung darstellt. Ich konnte zeigen, dass mit DC FCCS eindeutig und direkt Koaleszenz zwischen Emulsionstropfen gemessen werden kann. Dies ist von Interesse, da Koaleszenz als Hauptgrund fur die breite Groenverteilung der nalen Nanopartikel angesehen wird. Weiterhin habe ich den Austausch von Mizellen bildenden Molekulen zwischen amphiphilen Diblock Kopolymermizellen untersucht. Als Modellsystem diente ein Linear-Burste Block Kopolymer, welches Mizellen mit einer dichten und kurzen Korona bildet. Mit Hilfe von DC FCCS konnte der Austausch in verschiedenen Losungsmitteln und bei verschiedenen Temperaturen beobachtet werden. Ich habe herausgefunden, dass in Abhangigkeit der Qualitat des Losungsmittels die Zeit des Austausches um Groenordnungen verschoben werden kann, was eine weitreichende Einstellung der Austauschkinetik ermoglicht. Eine Eigenschaft die all diese Kolloide gemeinsam haben ist ihre Polydispersitat. Im letzten Teil meiner Arbeit habe ich am Beispiel von Polymeren als Modellsystem untersucht, welchen Eekt Polydispersitat und die Art der Fluoreszenzmarkierung auf FCS Experimente haben. Eine Anpassung des klassischen FCS Modells kann die FCS Korrelationskurven dieser Systeme beschreiben. Die Richtigkeit meines Ansatzes habe ich mit dem Vergleich zur Gel-Permeations-Chromatographie und Brownschen Molekulardynamiksimulationen bestatigt.

Optisch detektierte Magnetresonanz an NV-Zentren in Diamant

Die rasante Entwicklung der Computerindustrie durch die stetige Verkleinerung der Transistoren führt immer schneller zum Erreichen der Grenze der Si-Technologie, ab der die Tunnelprozesse in den Transistoren ihre weitere Verkleinerung und Erhöhung ihrer Dichte in den Prozessoren nicht mehr zulassen. Die Zukunft der Computertechnologie liegt in der Verarbeitung der Quanteninformation. Für die Entwicklung von Quantencomputern ist die Detektion und gezielte Manipulation einzelner Spins in Festkörpern von größter Bedeutung. Die Standardmethoden der Spindetektion, wie ESR, erlauben jedoch nur die Detektion von Spinensembles. Die Idee, die das Auslesen von einzelnen Spins ermöglich sollte, besteht darin, die Manipulation getrennt von der Detektion auszuführen.rn Bei dem NV−-Zentrum handelt es sich um eine spezielle Gitterfehlstelle im Diamant, die sich als einen atomaren, optisch auslesbaren Magnetfeldsensor benutzen lässt. Durch die Messung seiner Fluoreszenz sollte es möglich sein die Manipulation anderer, optisch nicht detektierbaren, “Dunkelspins“ in unmittelbarer Nähe des NV-Zentrums mittels der Spin-Spin-Kopplung zu detektieren. Das vorgeschlagene Modell des Quantencomputers basiert auf dem in SWCNT eingeschlossenen N@C60.Die Peapods, wie die Einheiten aus den in Kohlenstoffnanoröhre gepackten Fullerenen mit eingefangenem Stickstoff genannt werden, sollen die Grundlage für die Recheneinheiten eines wahren skalierbaren Quantencomputers bilden. Die in ihnen mit dem Stickstoff-Elektronenspin durchgeführten Rechnungen sollen mit den oberflächennahen NV-Zentren (von Diamantplatten), über denen sie positioniert sein sollen, optisch ausgelesen werden.rnrnDie vorliegende Arbeit hatte das primäre Ziel, die Kopplung der oberflächennahen NV-Einzelzentren an die optisch nicht detektierbaren Spins der Radikal-Moleküle auf der Diamantoberfläche mittels der ODMR-Kopplungsexperimente optisch zu detektieren und damit entscheidende Schritte auf dem Wege der Realisierung eines Quantenregisters zu tun.rn Es wurde ein sich im Entwicklungsstadium befindende ODMR-Setup wieder aufgebaut und seine bisherige Funktionsweise wurde an kommerziellen NV-Zentrum-reichen Nanodiamanten verifiziert. Im nächsten Schritt wurde die Effektivität und Weise der Messung an die Detektion und Manipulation der oberflächennah (< 7 nm Tiefe) implantieren NV-Einzelzenten in Diamantplatten angepasst.Ein sehr großer Teil der Arbeit, der hier nur bedingt beschrieben werden kann, bestand aus derrnAnpassung der existierenden Steuersoftware an die Problematik der praktischen Messung. Anschließend wurde die korrekte Funktion aller implementierten Pulssequenzen und anderer Software-Verbesserungen durch die Messung an oberflächennah implantierten NV-Einzelzentren verifiziert. Auch wurde der Messplatz um die zur Messung der Doppelresonanz notwendigen Komponenten wie einen steuerbaren Elektromagneten und RF-Signalquelle erweitert. Unter der Berücksichtigung der thermischen Stabilität von N@C60 wurde für zukünftige Experimente auch ein optischer Kryostat geplant, gebaut, in das Setup integriert und charakterisiert.rn Die Spin-Spin-Kopplungsexperimente wurden mit dem sauerstoffstabilen Galvinoxyl-Radikalals einem Modell-System für Kopplung durchgeführt. Dabei wurde über die Kopplung mit einem NVZentrum das RF-Spektrum des gekoppelten Radikal-Spins beobachtet. Auch konnte von dem gekoppelten Spin eine Rabi-Nutation aufgenommen werden.rn Es wurden auch weitere Aspekte der Peapod Messung und Oberflächenimplantation betrachtet.Es wurde untersucht, ob sich die NV-Detektion durch die SWCNTs, Peapods oder Fullerene stören lässt. Es zeigte sich, dass die Komponenten des geplanten Quantencomputers, bis auf die C60-Cluster, für eine ODMR-Messanordnung nicht detektierbar sind und die NV-Messung nicht stören werden. Es wurde auch betrachtet, welche Arten von kommerziellen Diamantplatten für die Oberflächenimplantation geeignet sind, für die Kopplungsmessungen geeignete Dichte der implantierten NV-Zentren abgeschätzt und eine Implantation mit abgeschätzter Dichte betrachtet.

Analysen zur molekularen Charakterisierung von Proteinen des humanen Usher-Syndroms und Evaluation genbasierter Therapiestrategien

Analysen zur molekularen Charakterisierung von Proteinen des humanen Usher-Syndroms und Evaluation genbasierter Therapiestrategien rnDas humane Usher Syndrom (USH) ist die häufigste Form vererbter Taub-Blindheit. In der vorliegenden Dissertation wurde diese komplexe Erkrankung auf verschiedenen Ebenen analysiert: in Arbeiten zur Expression und Lokalisation von USH-Proteinen, der Analyse der USH-Proteinnetzwerke und deren Funktionen sowie darauf aufbauend die Entwicklung von Therapiestrategien für USH.rnIm Rahmen der Arbeit wurde die Expression und (sub)-zelluläre Lokalisation des USH1D-Genproduktes CDH23 in der Retina und Cochlea analysiert. CDH23-Isoformen werden in der Maus zeitlich und räumlich differentiell exprimiert. In den Retinae von Mäusen, nicht humanen Primaten und Menschen zeigten Analysen eine unterschiedliche Expression und Lokalisation des Zell-Zelladhäsionsmoleküls CDH23, was auf Funktions-unterschiede der einzelnen Isoformen in den analysierten Spezies hindeutet.rnAnalysen zur Aufklärung der USH-Proteinnetzwerke ergaben eine potentielle Interaktion des USH1G-Gerüstproteins SANS mit dem Golgi- und Centrosom-assoziierten Protein Myomegalin. Die direkte Interaktion der Proteine konnte durch unabhängige Experimente verifiziert werden. Beide Interaktionspartner sind in den Retinae verschiedener Spezies partiell ko-lokalisiert und partizipieren im periciliären USH-Proteinnetzwerk. Die Assoziation von SANS und Myomegalin mit dem Mikrotubuli-Cytoskelett weist auf eine Funktion des Proteinkomplexes in gerichteten Transportprozessen innerhalb der Photorezeptoren hin und bekräftigt die Hypothese einer Rolle von SANS und assoziierten Netzwerken mit Transportprozessen.rnDas hier gewonnene erweiterte Verständnis der molekularen Grundlagen sowie die Aufklärung der zellulären Funktion der Proteinnetzwerke ermöglichen die Entwicklung therapeutischer Strategien für USH. Ein Fokus der vorliegenden Arbeit lag auf der Entwicklung genbasierter Therapiestrategien und deren Evaluation, wobei der Schwerpunkt auf der Therapiestrategie der Genreparatur lag. Die mit Hilfe von Zinkfinger-Nukleasen (ZFN) induzierte Homologe Rekombination für die Genkorrektur wurde exemplarisch an der 91C>T/p.R31X-Mutation im USH1C-Gen gezeigt. Effiziente ZFN wurden identifiziert, generiert und erfolgreich im Zellkulturmodellsystem eingesetzt. Die Analysen demonstrierten eine Reparatur der Mutation durch Homologe Rekombination auf genomischer Ebene und die Expression des wiederhergestellten Proteins. Durch die Genkorrektur im endogenen Lokus sind Größe des Gens, Isoformen oder die Art der Mutation keine limitierenden Faktoren für die Therapie. Die in der vorliegenden Arbeit durchgeführten Experimente unterstreichen das enorme Potential ZFN-basierter Therapiestrategien hin zu personalisierten Therapieformen nicht nur für USH sondern auch für andere erbliche Erkrankungen, deren genetische Grundlagen bekannt sind.rn

Konfokalmikroskopie an stabilen und metastabilen kolloidalen Hartkugel-Fluiden : interne Struktur, Kristallnukleation und Kristallwachstum

Die vorliegende Forschungsarbeit behandelt konfokalmikroskopische Untersuchungen zur Strukturbildung in kolloidalen Suspensionen, die als experimentelles Modellsystem für harte Kugeln verwendet werden. Die lokale und globale Struktur wurde im stabilen und metastabilen Fluid bestimmt. Bereits unterhalb des Gefriervolumenbruchs wurden nah-geordnete Cluster vorgefunden, die mit zunehmendem Volumenbruch häufiger und größer werden. Das Kristallwachstum aus der metastabilen kolloidalen Schmelze konnte quantitativ analysiert werden und es zeigt sich eine Übereinstimmung mehrerer Kenngrößen mit Literaturdaten nahe dem Schmelzvolumenbruch. Die Untersuchung demonstrierte die Realisierbarkeit der quantitativen Analyse der Kristallisationskinetik mittels konfokaler Mikroskopie. Es zeigte sich ein mehrstufiges Nukleationsszenario bei dem zuerst nah-geordnete Cluster gebildet werden, die im weiteren Verlauf zu kristall-artigen Clustern transformieren. Die Beobachtungen belegen den Mechanismus der Precursornukleation in Hartkugelsystemen. Die heterogene Nukleation wurde an glatten und an hexagonal strukturierten Substraten untersucht. Anhand der Kristallisationskinetik und der direkten Messung der Benetzungswinkel konnte ein Übergang des Benetzungsverhaltens unter Variation des Substratgitterabstands nachgewiesen werden: An glatten und an kommensurabel strukturierten Substraten zeigten sich eine vollständige Bedeckung des Substrats mit der kristallinen Phase und ein sofortiges unidirektionales Wachstum. Bei inkommensurabel strukturierten Substraten wurde eine unvollständige Bedeckung des strukturierten Substrats mit der kristallinen Phase sowie ein verzögertes isotropes Wachstum bei fortwährender Kristallnukleation beobachtet.

Optische Experimente zur Untersuchung der Nichtgleichgewichtsdynamik kolloidaler Suspensionen

In der vorliegenden Forschungsarbeit wird die Konkurrenz von Kristallisation und Verglasung in metastabilen kolloidalen Hart-Kugel(HK)-Modellsystemen mit dynamischer und zeitaufgelöster statischer Lichtstreuung untersucht. Durch gleichzeitige Messungen mit beiden Methoden an derselben Probe gelang es, mit hoher Genauigkeit und aussagekräftiger Statistik nachzuweisen, dass in beiden Systemklassen eine starke Korrelation der strukturellen und dynamischen Eigenschaften vorliegt und diese Korrelation zu quantifizieren. Ein zentraler Teil der Arbeit bestand in dem Aufbau einer geeigneten Lichtstreuanlage mit der erstmalig Messungen der Dynamik und der Struktur simultan an derselben nicht-ergodischen Probe durchgeführt werden konnten. Für die dynamische Lichtstreuung wurde ein Flächendetektor (CCD-Kamera) verwendet. In Kombination mit einer speziellen Detektionsoptik ermöglicht dies, die gleichzeitige Detektion von Streulicht aus unterschiedlichen Probenbereichen (Subensembles). Damit kann gleichzeitig die Dynamik in unterschiedlichen Subensembles mit einer Auflösung von 15,8x15,8µm2 untersucht werden. Die Lichtstreuanlage wurde ausführlich charakterisiert und ihre korrekte Funktionsweise mithilfe von Vergleichsmessungen an etablierten Lichtstreuanlagen bestätigt. Die zeitliche Entwicklung der Dynamik und der Struktur von metastabilen Proben wurde unterhalb, am und oberhalb des Glasübergangs quantifiziert. Dabei zeigte das untersuchte kolloidale HK-Modellsystem alle typischen Eigenschaften eines HK-Systems. Die kristallisierenden Proben zeigten das etablierte zweistufige Kristallisationsszenario mit entsprechender Kristallisationskinetik und die Glasproben zeigten das erwartete Alterungsverhalten. Bei dem zweistufigen Kristallisationsszenario kommt es zuerst zur Nukleation einer metastabilen Zwischenphase von sogenannten Precursorn. In einer zweiten Stufe bilden sich Kristallite innerhalb dieser Precursor. Durch Vergleich zwischen kristallisierenden und verglasenden Proben konnte auch während der Verglasung die Bildung von Precursorn beobachtet werden. Die Korrelation zwischen der Anzahl an Precursorn und der Partikeldynamik legt die Vermutung nahe, dass das immer noch unverstandene Phänomen der Alterung von Gläsern mit der Bildung von Precursorn zusammenhängt. Verhinderte Kristallisation führt zu einer starken Verlangsamung der Partikeldynamik. Die Partikeldynamik einer Probe am Glasübergang zeigt, dass die Probe vor Einsetzen der Kristallisation eine glasartige Dynamik aufwies. Dies legt die Vermutung nahe, dass einkomponentige kolloidale HK-Gläser den Gleichgewichtszustand (Kristall) auf langen Zeitskalen erreichen können. Durch die Untersuchung der Partikeldynamik von metastabilen Proben in einzelnen Subensembles konnte eine heterogene Verteilung der Partikeldynamik nachgewiesen werden. Es existieren Bereiche, in denen die Partikeldynamik schneller oder langsamer ist als in anderen Bereichen. Gleichzeitig zeigen die Messungen der strukturellen Eigenschaften, dass metastabile Proben auch heterogen bezüglich ihrer Struktur sind. Mithilfe dieser Messungen konnte die zeitliche Entwicklung des Anteils an langsamen Partikeln und des Anteils an Partikeln innerhalb von Objekten höherer Ordnung (Precursor/Kristallite) bestimmt werden. Es zeigte sich eine direkte Korrelation zwischen dem Anteil an langsamen Partikeln und dem Anteil an Partikeln in Objekten höherer Ordnung. Die Untersuchung der Dynamik und der Struktur in einzelnen Subensembles lieferte einen weiteren Hinweis darauf, dass Subensembles, in denen eine stärker ausgeprägte strukturelle Ordnung vorliegt, auch bevorzugt eine langsamere Partikeldynamik aufweisen.