MYC, FBXW7 and TP53 copy number variation and expression in gastric cancer

BACKGROUND: MYC deregulation is a common event in gastric carcinogenesis, usually as a consequence of gene amplification, chromosomal translocations, or posttranslational mechanisms. FBXW7 is a p53-controlled tumor-suppressor that plays a role in the regulation of cell cycle exit and reentry via MYC degradation. METHODS: We evaluated MYC, FBXW7, and TP53 copy number, mRNA levels, and protein expression in gastric cancer and paired non-neoplastic specimens from 33 patients and also in gastric adenocarcinoma cell lines. We also determined the invasion potential of the gastric cancer cell lines. RESULTS: MYC amplification was observed in 51.5% of gastric tumor samples. Deletion of one copy of FBXW7 and TP53 was observed in 45.5% and 21.2% of gastric tumors, respectively. MYC mRNA expression was significantly higher in tumors than in non-neoplastic samples. FBXW7 and TP53 mRNA expression was markedly lower in tumors than in paired non-neoplastic specimens. Moreover, deregulated MYC and FBXW7 mRNA expression was associated with the presence of lymph node metastasis and tumor stage III-IV. Additionally, MYC immunostaining was more frequently observed in intestinal-type than diffuse-type gastric cancers and was associated with MYC mRNA expression. In vitro studies showed that increased MYC and reduced FBXW7 expression is associated with a more invasive phenotype in gastric cancer cell lines. This result encouraged us to investigate the activity of the gelatinases MMP-2 and MMP-9 in both cell lines. Both gelatinases are synthesized predominantly by stromal cells rather than cancer cells, and it has been proposed that both contribute to cancer progression. We observed a significant increase in MMP-9 activity in ACP02 compared with ACP03 cells. These results confirmed that ACP02 cells have greater invasion capability than ACP03 cells. CONCLUSION: In conclusion, FBXW7 and MYC mRNA may play a role in aggressive biologic behavior of gastric cancer cells and may be a useful indicator of poor prognosis. Furthermore, MYC is a candidate target for new therapies against gastric cancer.

TLR2- and 4-independent immunomodulatory effect of high molecular weight components from Ascaris suum

Components of high molecular-weight (PI) obtained from Ascaris suum extract down-regulate the Th1/Th2-related immune responses induced by ovalbumin (OVA)-immunization in mice. Furthermore, the PI down-modulates the ability of dendritic cells (DCs) to activate T lymphocytes by an IL-10-mediated mechanism. Here, we evaluated the role of toll like receptors 2 and 4 (TLR2 and 4) in the modulatory effect of PI on OVA-specific immune response and the PI interference on DC full activation. An inhibition of OVA-specific cellular and humoral responses were observed in wild type (WT) or in deficient in TLR2 (TLR2(-/-)) or 4 (TLR4(-/-)) mice immunized with OVA plus PI when compared with OVA-immunized mice. Low expression of class II MHC, CD40, CD80 and CD86 molecules was observed in lymph node (LN) cells from WT, TLR2(-/-) or TLR4(-/-) mice immunized with OVA plus PI compared with OVA-primed cells. We also verified that PI was able to modulate the activation of DCs derived from bone marrow of WT, TLR2(-/-) or TLR4(-/-) mice induced in vitro by agonists of TLRs, as observed by a decreased expression of class II MHC and costimulatory molecules and by low secretion of pro-inflammatory cytokines. Its effect was accompanied by IL-10 synthesis. In this sense, the modulatory effect of PI on specific-immune response and DC activation is independent of TLR2 or TLR4.

Stereotactict body radiotherapy (SBRT)

Purpose: evaluation and comparison of volumetric modulated RapidarcTM radiotherapy (RA-IMRT) vs linac based Stereotactic body radiotherapy (SBRT) in the salvage treatment of isolated lymph node recurrences in patients affected by gynaecological cancer. Materials and Methods From January 2010 to September 2011, 15 patients affected by isolated lymph nodes recurrence of gynaecological cancer underwent salvage radiotherapy after conventional imaging staging with CT and 18-FDG-PET/CT. Two different radiotherapy techniques were used in this study: RA-IMRT (RapidarcTM implemented radiotherapy Varian Medical System, Palo Alto, CA, USA) or SBRT (BrainLAB, Feldkirchen, Germany). Five patients underwent CT scan and all patients underwent 18FDG-PET/CT for pre-treatment evaluation and staging. The mean total dose delivered was 54.3 Gy (range 50-60 Gy with conventional fractionation and 27.4 Gy (range 12-40 Gy hypofractionation) for RA-IMRT and SBRT respectively. The mean number of fractions was 27.6 fractions (range 25-31) and 3-4 fractions , the mean overall treatment duration was 40.5 days (range 36-45) and 6.5 days (range 5-8 days) for RA-IMRT and SBRT respectively. Results: At the time of the analysis, October 2011, the overall survival was 92.3 % (80% for RA-IMRT and 100% for SBRT). Six patients are alive with no evidence of disease and also six patients are alive with clinically evident disease in other sites (40% and 50% patients RA-IMRT vs SBRT respectively, one patient died for systemic progression of disease and two patient were not evaluable at this time. Conclusions: Our preliminary results showed that, the use of RA-IMRT and SBRT are an excellent local therapy for isolated lymph nodes recurrences of gynaecological cancer with a good toxicity profile and local control rate, even if any long term survivors would be expected. New treatment modalities like Cyberknife are also being implemented.

Ricerca di marcatori molecolari nella prevenzione dei tumori di testa e collo

Oral cavity cancers (OSCC) are among the most malignances worldwide. OSCC tipically affects men in their IV or V dedade of life, and the most relevant risk factors are tobacco and alcohol consumption. OSCCs generally exhibit poor prognosis, and late stage identification correlates with higher mortality rates. Basic prognostic factors, are tumor size and presence of lymph node and/or distance metastases (T classification, N, M). However, tumors with the same TNM grade and similar morphology may have completely different evolution, because of their intrinsic biological characteristics. For these reasons, the identification of new molecular markers with a predictive value, could represent useful tools in OSCC prevention, prognosis and treatment. In the first part of my PhD project I evaluated the loss of heterozygosity as a possible cause of deregulation of well-known tumor suppressors genes. Obtained data put on light the importance of this rearrangement and genes PDCD4, CTNB1, CASP4 and HSP23, in the onset and progression of OSCC. Subsequently, the analysis of the expression profile of miRNAs, led to the identification of some miRNAs that seems to be involved in cancer development and metastatic progression. In both cases, we need further investigations to understand whether these molecules may be used ideal markers in OSCC diagnosis and treatment.

Induktion und Analyse spezifischer Immunantworten nach intranodaler Immunisierung mit RNA im murinen Modell

Die Wirksamkeit einer Vakzine ist von vielen Parametern abhängig. Dazu gehören unter anderen: das ausgewählte Antigen, die Formulation in der das Antigen benutzt wird sowie die Applikationsroute. Antigen-kodierende Ribonukleinsäuren (RNA) gilt heutzutage als eine sichere und effiziente Alternative zu traditionellen Impfstoff-Formulierungen, wie Peptiden, rekombinanten Proteinen, viralen Systemen oder DNA basierten Impfstoffen. Bezüglich des Applikationsortes repräsentiert der Lymphknoten ein optimales Milieu für die Interaktion zwischen antigenpräsentierenden Zellen und T-Zellen. Vor diesem Hintergrund war die Zielsetzung dieser Arbeit, ein auf direktem in vivo Transfer von Antigen-kodierender in vitro transkribierter RNA (IVT-RNA) basierendes Impfverfahren zu entwickeln, zu charakterisieren und auf seine anti-tumorale Wirksamkeit zu testen. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass dendritische Zellen (DCs) in vitro hocheffizient mit IVT-RNA transfiziert werden können und eine hohe stimulatorische Kapazität besitzen. Durch Sequenzmodifikation der IVT-RNA konnten wir die Transkriptstabilität und Translationseffizienz erhöhen was zu einer Steigerung der stimulatorischen Kapazität in vivo führte. Darüber hinaus untersuchten wir die Auswirkung der Insertion eines Signalpeptides 5’ sowie einer C-terminalen transmembran- und zytosolischen-Domäne eines MHC-Klasse-I-Moleküls am 3’ der Antigen-kodierenden Sequenz auf die Effizienz der MHC-Klasse-I und -II Präsentation. Wir konnten in vitro und in vivo nachweisen, dass diese Modifikation zu einer gesteigerten, simultanen Stimulation von antigenspezifischen CD4+ und CD8+ T-Zellen führt. Auf der Basis der optimierten Vektorkassetten etablierten wir die intranodale (i.n.) Transfektion von antigenpräsentierenden Zellen in der Maus. Dazu nutzten wir verschiedene Reportersysteme (eGFP-RNA, fluoreszensmarkierte RNA) und konnten zeigen, dass die intranodale Applikation von IVT-RNA zu selektiven Transfektion und Maturation lymphknotenresidenter DCs führt. Zur Untersuchung der immunologischen Effekte wurden in erster Linie auf Influenza-Hemagglutinin-A und Ovalbumin basierende Modellantigensysteme verwendet. Beide Antigene wurden als Antigen-MHC-Fusionskonstrukte genutzt. Als Responderzellen wurden TCR-transgene Lymphozyten verwendet, die MHC-Klasse-I oder -Klasse-II restringierte Epitope des Influenza-Hemagglutinin-A bzw. des Ovalbumin-Proteins erkennen. Wir konnten in vivo zeigen, dass die intranodale Immunisierung mit IVT-RNA zu einer effizienten Stimulation und Expansion von antigenspezifischen CD4+ und CD8+ T-Zellen in einer dosisabhängigen Weise führt. Funktionell konnte gezeigt werden, dass diese T-Zellen Zytokine sezernieren und zur Zytolyse befähigt sind. Wir waren in der Lage durch repetitive i.n. RNA Immunisierung ein ‚Priming’ CD8+ T-Zellen in naiven Mäusen sowohl gegen virale als auch gegen Tumor assoziierte Antigene zu erreichen. Die geprimten T-Zellen waren befähigt eine zytolytische Aktivität gegen mit spezifischem Peptid beladene Targetzellen zu generieren. Darüber hinaus waren wir in der Lage Gedächtnisszellen expandieren zu können. Abschließend konnten wir in Tumormodellen sowohl in prophylaktischen als auch in therapeutischen Experimenten zeigen dass die i.n. RNA Vakzination die Potenz zur Induktion einer anti-tumoralen Immunität besitzt.

Protonterapia nel trattamento del tumore prostatico

Obiettivo: Il nostro obiettivo è stato quello di confrontare la tomoterapia (HT) e la protonterapia ad intensità modulata (IMPT) nel trattamento del tumore prostatico, seguendo un protocollo di boost simultaneo (SIB) e moderatamente ipofrazionato. Materiali e metodi: Abbiamo selezionato 8 pazienti, trattati con HT e abbiamo rielaborato i piani con 2 campi IMPT. La dose prescritta è stata di 74 Gy sul PTV1 (prostata e vescicole seminali prossimali), 65.8 Gy sul PTV2 (vescicole seminali distali) e 54 Gy sul PTV3 (linfonodi pelvici). Risultati: Sia con IMPT che con HT abbiamo ottenuto una copertura e una omogeneità di dose del target sovrapponibile. Oltre i 65 Gy, HT e IMPT erano equivalenti per il retto, mentre con l’IMPT c’era maggior risparmio della vescica e del bulbo penieno da 0 a 70 Gy. Da 0 fino a 60 Gy, i valori dosimetrici dell’IMPT erano molto più bassi per tutti gli organi a rischio (OARs), eccetto che per le teste femorali, dove la HT aveva un vantaggio dosimetrico rispetto all’IMPT nel range di dose 25-35 Gy. La dose media agli OARs era ridotta del 30-50% con l’IMPT. Conclusioni: Con le due tecniche di trattamento (HT e IMPT) si ottiene una simile distribuzione di dose nel target. Un chiaro vantaggio dosimetrico dell’IMPT sul HT è ottenuto dalle medie e basse dosi. Le attuali conoscenze sulle relazioni dose-effetto e sul risparmio delle madie e basse dosi con l’IMPT non sono ancora state quantificate dal punto di vista clinico.

Identificazione di un profilo molecolare di rischio nei pazienti pediatrici affetti da Linfoma di Hodgkin

Obiettivi: nonostante i miglioramenti nel trattamento, circa il 30% dei pazienti pediatrici affetti da Linfoma di Hodgkin (LH) in stadio avanzato recidiva o muore per progressione di malattia e i correnti metodi predittivi biologico-clinici non consentono di individuare tali pazienti. L’obiettivo dello studio è stato quello di definire un profilo molecolare di rischio che correli con l’outcome in questi pazienti. Materiali e metodi: studio retrospettico condotto su pazienti pediatrici affetti da LH omogeneamente trattati dal 2004 in poi. Su tali pazienti è stato intrapreso uno studio di validazione di marcatori molecolari già identificati in studi esplorativi precedenti. 27 geni sono stati analizzati in RT PCR su campioni di tessuto istologico prelevato alla diagnosi fissato in formalina e processato in paraffina relativi a una coorte di 37 pazienti, 12 ad outcome sfavorevole e 25 ad outcome favorevole. Risultati: dall’analisi univariata è emerso che solo l’espressione di CASP3 e CYCS, appartenenti al pathway apoptotico, è in grado di influenzare l’EFS in modo significativo nella nostra coorte di pazienti. Lo studio delle possibili combinazioni di questi geni ha mostrato l’esistenza di 3 gruppi di rischio che correlano con l’EFS: alto rischio (down regolazione di entrambi i geni), rischio intermedio (down regolazione di uno solo dei 2 geni), basso rischio (up regolazione di entrambi i geni). Dall’analisi multivariata è emerso che CASP3 è l’unica variabile che mantiene la sua indipendenza nell’influenzare la prognosi con un rischio di eventi di oltre il doppio di chi ha un’espressione bassa di questo gene. Conclusioni: i risultati ottenuti sulla nostra coorte di pazienti pediatrici affetti da LH confermano l’impatto sulla prognosi di due marcatori molecolari CASP3 e CYCS coinvolti nel patwhay apoptotico. La valutazione del profilo di espressione di tali geni, potrebbe pertanto essere utilizzata in corso di stadiazione, come criterio di predittività.

Der Transkriptionsfaktor NFATc2 ist essentiell für die Funktion von Mastzellen in vivo

Neueste Arbeiten zeigen, dass Mastzellen wichtige Funktionen innerhalb des angeborenen und erworbenen Immunsystems ausüben. Von zentraler Bedeutung ist hierbei die Fähigkeit der Mastzelle, auf IgE-unabhängige Signale zu reagieren und ein breites Spektrum an Cytokinen und Chemokinen zu produzieren. Transkriptionsfaktoren der NFAT-Familie sind wichtige Regulatoren der Immunhomöostase und Cytokinproduktion. In Mausmodellen führt die Defizienz des NFATc2 zu überschießenden Immunreaktionen, was ursächlich auf die Hyperreaktivität NFATc2-defizienter T-Zellen zurückgeführt wird. Demgegenüber zeigten unsere eigenen in vitro durchgeführten Arbeiten, dass die Produktion wichtiger entzündungsfördernder Cytokine in Mastzellen abhängig ist von NFATc2. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Bedeutung von NFATc2 in einem Mastzell-abhängigen Modell der transkutanen Immunisierung mit einem TLR7-Liganden als Adjuvans zu untersuchen. Experimente an NFATc2-defizienten Mäusen ergaben zunächst, dass die Schlüsselprozesse Entzündung, Auswanderung antigenpräsen-tierender Zellen, Lymphknotenhypertrophie sowie Expansion und Funktion spezifischer T-Zellen in Abwesenheit des Transkriptionsfaktors NFATc2 extrem beeinträchtigt sind. Dieser experimentell induzierte Phänotyp gleicht somit dem mastzellloser Mäuse in dieser Immunisierungsstudie. Rekonstitutionsexperimente erlaubten es, in vitro generierte Mastzellen aus NFATc2-defizienten und NFATc2-kompetenten Spendern in mastzelllose Mäuse zu transferieren und deren Reaktivität in dem angewandten TLR7-abhängigen Entzündungsmodell in vivo zu vergleichen. Hierbei zeigte sich, dass die in NFATc2-defizienten Mäusen nach transkutaner Immunisierung zu beobachtenden Beeinträchtigungen gänzlich auf die Abwesenheit des NFATc2 in Mastzellen zurückzuführen sind. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen somit, dass der Transkriptionsfaktor NFATc2 für die Funktion der Mastzelle in vivo eine bedeutsame Rolle spielt. Dies betrifft sowohl Reaktionen des angeborenen als auch des erworbenen Immunsystems. Darüber hinaus könnte NFATc2 ein wichtiges Ziel bei therapeutischen Maßnahmen gegen mastzellabhängige Krankheiten darstellen.

Die Rolle der Mastzelle bei der Entstehung einer allergischen Atemwegserkrankung

In der vorliegenden Arbeit wurde die Rolle der Mastzelle und deren Mediatoren für die Entstehung einer allergischen Atemwegsentzündung untersucht. Anhand von zwei mastzelldefizienten Mausstämmen (C57BL/6-KitWsh/Wsh und WBB6FI-KitW/Wv), konnte gezeigt werden, dass Mastzellen an der Entstehung einer allergischen Entzündung und Atemwegsüberempfindlichkeit beteiligt sind. Durch die Rekonstitution von mastzelldefizienten Tieren mit aus Knochenmark gewonnenen Mastzellen (BMMC) von Wildtyp-Spendern konnte die wichtige Funktion der Mastzelle in diesem Model bestätigt werden. Überdies konnte durch die Rekonstitution mit TNF-defizienten BMMC eine wichtige Rolle für diesen mastzellproduzierten Mediator im allergischen Modell demonstriert werden. Weiterhin konnte die Arbeit zeigen, dass Mastzellen wichtig für die Migration von antigenbeladenen Dendritischen Zellen aus der Lunge in die regionalen Lymphknoten sind. Dieses stellt einen wichtigen Schritt für die Ausbildung einer lokalen allergischen Antwort dar. Im Gegensatz dazu war die Entstehung einer allergischen Atemwegserkrankung nach Transfer von in vitro generierten DC und Allergenprovokation nicht mastzellabhängig. Diese Ergebnisse zeigen, dass es auf die Wahl des Sensibilisierungs- und Provokationsmodels ankommt, um mastzellspezifische Effekte zu demonstrieren. Die vorliegende Arbeit zeigt die wichtige Rolle der Mastzelle und von mastzellproduziertem TNF bei der Ausbildung einer allergischen Entzündung der Atemwege. Die Mastzelle und deren Mediatoren stellen somit mögliche Ziele für die therapeutische Behandlung der allergischen Entzündung der Atemwege dar.

Phenotypic characterization of the epithelial and myoepithelial components in canine and feline mammary tumours

In veterinary medicine, the ability to classify mammary tumours based on the molecular profile and also determine whether the immunophenotype of the regional lymph node and/or systemic metastases is equal to that of the primary tumor may be predictive on the estimation of the effectiveness of various cancer treatments that can be scheduled. Therefore, aims, developed as projects, of the past three years have been (1) to define the molecular phenotype of feline mammary carcinomas and their lymph node metastases according to a previous modified algorithm and to demonstrate the concordance or discordance of the molecular profile between the primary tumour and lymph node metastasis, (2) to analyze, in female dogs, the relationship between the primary mammary tumor and its lymph node metastasis based on immunohistochemical molecular characterization in order to develop the most specific prognostic-predictive models and targeted therapeutic options, and (3) to evaluate the molecular trend of cancer from its primary location to systemic metastases in three cats and two dogs with mammary tumors. The studies on mammary tumours, particularly in dogs, have drawn gradually increasing attention not exclusively to the epithelial component, but also to the myoepithelial cells. The lack of complete information on a valid panel of markers for the identification of these cells in the normal and neoplastic mammary gland and lack of investigation of immunohistochemical changes from an epithelial to a mesenchymal phenotype, was the aim of a parallel research. While investigating mammary tumours, it was noticed that only few studies had focused on the expression of CD117. Therefore, it was decided to further deepen the knowledge in order to characterize the immunohistochemical staining of CD117 in normal and neoplastic mammary tissue of the dog, and to correlate CD117 immunohistochemical results with mammary histotype, histological stage (invasiveness), Ki67 index and patient survival time.

Profili di espressione genetica ed epigenetica ad impatto prognostico e predittivo nel carcinoma squamoso e nelle lesioni potenzialmente maligne del cavo orale

Il carcinoma squamoso orale (CSO) è spesso preceduto da lesioni definite potenzialmente maligne tra cui la leucoplachia e il lichen ma una diagnosi precoce avviene ancora oggi in meno della metà dei casi. Inoltre spesso un paziente trattato per CSO svilupperà secondi tumori. Scopo del lavoro di ricerca è stato: 1) Studiare, mediante metodica di next generation sequencing, lo stato di metilazione di un gruppo di geni a partire da prelievi brushing del cavo orale al fine di identificare CSO o lesioni ad alto rischio di trasformazione maligna. 2) Valurare la relazione esistente tra sovraespressione di p16INK4A e presenza di HPV in 35 pazienti affetti da lichen 3) Valutare la presenza di marker istopatologici predittivi di comparsa di seconde manifestazioni tumorali 4) valutare la relazione clonale tra tumore primitivo e metastasi linfonodale in 8 pazienti mediante 2 metodiche di clonalità differenti: l’analisi di mtDNA e delle mutazioni del gene TP53. I risultati hanno mostrato: 1) i geni ZAP70 e GP1BB hanno presentato un alterato stato di metilazione rispettivamente nel 100% e nel 90,9% di CSO e lesioni ad alto rischio, mentre non sono risultati metilati nei controlli sani; ipotizzando un ruolo come potenziali marcatori per la diagnosi precoce nel CSO. 2)Una sovraespressione di p16INK4A è risultata in 26/35 pazienti affetti da lichen ma HPV-DNA è stato identificato in soli 4 campioni. Nessuna relazione sembra essere tra sovraespressione di p16INK4A e virus HPV. 3)L’invasione perineurale è risultato un marker predittivo della comparsa di recidiva locale e metastasi linfonodale, mentre lo stato dei margini chirurgici si è rilevato un fattore predittivo per la comparsa di secondi tumori primitivi 4) Un totale accordo nei risultati c’è stato tra analisi di mtDNA e analisi di TP53 e le due metodiche hanno identificato la presenza di 4 metastasi linfonodali non clonalmente correlate al tumore primitivo.

Studio sull'applicazione della piattaforma ForcetriadTM con sistema LigasureTM nella chirurgia oncologica e dei tessuti molli nel cane

Questo studio prospettico valuta l’efficacia e i vantaggi del sistema LigasureTM rispetto alle tecniche chirurgiche tradizionali, in quattro differenti procedure eseguite su 77 cani. I soggetti sono stati suddivisi in 4 gruppi, a seconda della chirurgia eseguita: Gruppo 1, 25 pazienti sottoposti a Splenectomia “aperta” semplice; Gruppo 2, 15 pazienti sottoposti a Splenectomia “aperta” complessa; Gruppo 3, 22 pazienti sottoposti ad Ovariectomia “aperta”. Gruppo 4: 18 pazienti sottoposti a Linfoadenectomia. Ciascun gruppo è stato a sua volta suddiviso in due sottogruppi: a (LigasureTM) e b (Tradizionale), a seconda della metodica utilizzata. Sono stati analizzati: il segnalamento, i parametri ematologici, le condizioni cliniche, le informazioni riguardanti l’intervento chirurgico e l’outcome. In tutti i gruppi il ricorso all’utilizzo di garze nonché dei fili da sutura sono risultati statisticamente inferiori nei pazienti operati con il sistema a radiofrequenza (Gruppo 1, P < 0.0001; Gruppo 2, P < 0,0014; Gruppo 3, P = 0,0001; Gruppo 4, P = 0,0148). Anche i tempi per la rimozione dell’organo sono significativamente ridotti in tutti i gruppi in cui è stato utilizzato il sistema LigasureTM (Gruppo 1 P < 0.0001; Gruppo 2 P < 0,0014; Gruppo 3 P = 0,0009; Gruppo 4 P = 0,0008), come i tempi chirurgici nei gruppi 1, 2 e 3 (P = 0,0287; P = 0,0064; e P = 0,0124) ed anestesiologici nei gruppi 1a e 2a (P = 0,0176; P = 0,0043). Tra le variabili analizzate, l’utilizzo del sistema di sintesi vascolare a radiofrequenza, è l’unico ad influenzare i tempi necessari per l’esecuzione della procedura. Questo studio dimostra, quindi, come il sistema LigasureTM sia sicuro ed efficace per le procedure chirurgiche esaminate, riducendo i tempi della chirurgia e limitando, quindi, i rischi per il paziente, indipendentemente dall’operatore, dall’esecuzione di altre procedure contemporanee e dalla natura della patologia splenica o linfonodale.

Antigenspezifische DNA-Immunisierung in Kombination mit IDO-kodierenden Plasmiden zur Therapie der experimentellen Typ I-Allergie

Derzeit stellt die allergenspezifische Immuntherapie die einzige nicht allein antisymptomatische Behandlungsform zur langfristigen Therapie von Typ I-Allergien dar, welche grundlegende Änderungen im immunologischen Geschehen induziert. Sie ist jedoch verbesserungswürdig in Bezug auf Behandlungsdauer, Erfolgschancen und Nebenwirkungen. Daher wurde in dieser Arbeit eine Strategie zur Therapie von Typ I-Allergien entwickelt und evaluiert, welche auf der Inhibition allergenspezifischer T-Zellen durch Dendritische Zellen (DC), die selektiv nach DNA-Immunisierung sowohl das relevante Allergen als auch Indolamin 2,3-dioxygenase (IDO) konstitutiv produzieren, basiert. IDO ist ein Enzym aus dem Tryptophan-Stoffwechsel, dessen Produktion durch DC einen lokalen immunsuppressiven Mechanismus induziert und in verschiedenen Situationen mit der Induktion peripherer Toleranz assoziiert ist. Zunächst wurden Plasmide hergestellt, die entweder IDO alleine oder IDO zusammen mit dem Antigen unter der Kontrolle des ubiquitär aktiven CMV- bzw. des DC-spezifischen Fascin-Promotors kodieren. Die Überprüfung der IDO-Expression durch die monocistronischen Plasmide anhand von Transfektionsexperimenten in vitro ergab, dass die IDO-Expression unter der Kontrolle des CMV-Promotors sehr viel stärker ausfiel als unter der Kontrolle des Fascin-Promotors. Nach Transfektion mit den bicistronischen Vektoren, in denen die Transgene für das Antigen und IDO durch eine IRES-Sequenz verbunden waren, war die IDO-Expression jedoch insgesamt sehr schwach. Im Rahmen der Überprüfung der Funktionalität der IDO-Expressionplasmide in vivo unter Verwendung der Genpistole wurden daher lediglich Plasmide getestet, die alleine IDO unter der Kontrolle des CMV-Promotors bzw. des Fascin-Promotors kodieren. Auch in vivo wurde eine stärkere IDO-Expression nach biolistischer Transfektion mit solchen Vektoren beobachtet, in denen der CMV-Promotor zur Expressionskontrolle verwendet wurde. Die Analyse des Einflusses einer Koexpression von IDO auf die durch biolistische Immunisierung mit einem antigenkodierenden Vektor induzierte systemische Immunantwort offenbarte einen inhibitorischer Effekt für den Fall, dass die Antigenproduktion mittels des Fascin-Promotors auf DC fokussiert war und die Expression des koapplizierten IDO-Transgens unter der Kontrolle des CMV-Promotors stand. In diesem Fall wurde eine Reduktion der antigenspezifischen IgG1- und IgG2a-Produktion, eine verringerte Sekretion von IFN-y durch restimulierte Milz- und Lymphknotenzellen sowie eine Reduktion der Zahl antigenspezifischer CD8+ Effektor-T-Zellen nachgewiesen. Im Mausmodell der IgE-vermittelten Typ I-Allergie wurde weiterhin gezeigt, dass nach prophylaktischer biolistischer Vakzinierung unter Verwendung dieser Vektorkombination eine Inhibition der durch die Vakzinierung bedingten antigenspezifischen Th1-Immunantwort ausgelöst wurde. Die Suppression der Th2-Antwort, welche durch Transfektion mit dem Antigenkodierenden Vektor unter Kontrolle des Fascin-Promotors bewirkt wurde, wurde durch Kotransfektion mit den IDO-kodierenden Vektoren aufrecht erhalten.

Mechanismen der Antigenpräsentation bei der Induktion der CD8-T-Zellantwort gegen das murine Cytomegalovirus

Die Kontrolle der Cytomegalovirus(CMV)-Infektion durch CD8 T-Zellen ist abhängig von der effizienten MHC-Klasse-I-Präsentation viraler Peptide auf der Zelloberfläche. Um die Erkennung infizierter Zellen zu unterdrücken, interferieren während der Early (E)-Phase der murinen CMV (mCMV)-Infektion virale Immunevasine mit dem intrazellulären Transport von Peptid-MHC-I (pMHC-I) Komplexen. Den Immunevasinen gelingt es allerdings nicht, ein Priming mCMV-spezifischer CD8 T-Zellen zu verhindern. Daher wurde angenommen, dass die Initiation der antiviralen CD8 T-Zellantwort primär auf der Cross-Präsentation viraler Peptide auf nicht-infizierten, professionellen Antigen-präsentierenden Zellen (profAPC) beruht und damit unabhängig von viralen Immunevasionsmechanismen ist.rnIm Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde mittels BAC-Mutagenese eine mCMV-Rekombinante generiert, um die direkte Präsentation viraler Peptide durch die zusätzliche Expression des zentralen Immunevasins m152 bereits in der Immediate Early (IE)-Phase verstärkt zu unterdrücken. Wie erwartet reduzierte die verstärkte m152-Expression sowohl in der IE- als auch in der E-Phase die pMHC-I-Präsentation in vitro. Dies führte überraschenderweise nach Infektion immunkompetenter BALB/c-Mäuse (Haplotyp H-2d) zu einer verminderten CD8 T-Zellantwort und damit zur Verschlechterung der Kontrolle der Infektion im drainierenden Lymphknoten. Diese Beobachtungen weisen erstmals auf einen wichtigen Beitrag der direkten Antigenpräsentation bei der Initiation der mCMV-spezifischen CD8 T-Zellantwort im immunkompetenten Wirt hin. Zusätzlich konnte auch nach mCMV-Infektion von Cross-Präsentations-defizienten Mäusen (Haplotyp H-2b) eine antivirale CD8 T-Zellantwort initiiert werden. Diese Beobachtung bestätigt, dass durch direkte Antigenpräsentation auf infizierten profAPC trotz viraler Immunevasionsmechanismen eine CD8 T-Zellantwort induziert werden kann. Allerdings wurde weder die antivirale CD8 T-Zellantwort noch die Kontrolle der Infektion im Haplotyp H-2b durch die verstärkte m152-Expression moduliert.rnIn einem weiteren Teil der Arbeit konnte im klinisch relevanten Modellsystem der mCMV-Infektion von Knochenmarktransplantations (KMT)-Rezipienten (Haplotyp H-2d) gezeigt werden, dass die verstärkte m152-Expression die Rekrutierung IE1-spezifischer CD8 T-Zellen in die infizierte Lunge unterdrückt. Dies konnte sowohl früh nach Infektion, als auch während der viralen Latenz nachgewiesen werden. Zusätzlich war die Rekrutierung IE1-spezifischer CD8 T-Zellen in die Lunge deutlich vermindert in Ld--Rezipienten von Ld+-hämatopoetischen Zellen, die das IE1-präsentierende MHC-I-Molekül Ld nicht auf den nicht-hämatopoetischen Gewebszellen exprimieren. Diese Beobachtungen zeigen, dass die Rekrutierung antiviraler CD8 T-Zellen in ein peripheres Organ von der direkten Antigenpräsentation auf nicht-hämatopoetischen, infizierten Gewebszellen bestimmt wird.rnIn der vorliegenden Arbeit konnte somit erstmals gezeigt werden, dass trotz viraler Immunevasionsmechanismen nach mCMV-Infektion des immunkompetenten Wirtes und des KMT-Rezipienten die antivirale CD8 T-Zellantwort von der direkten Antigenpräsentation bestimmt wird.

Erkennung der alpha-Kette des GM-CSF-Rezeptors (CSF2RA) durch einen HLA-unabhängigen alpha:beta-T-Zellrezeptor

Aus dem tumorreaktiven T-Zellrepertoire der Melanompatientin Ma-Mel-86/INTH, bei der im Verlauf Lymphknotenmetastasen HLA-Klasse I-negativer Tumorzellen auftraten, wurden durch Stimulation mit autologen Tumorzellen CD8+ T-Zellklone isoliert und expandiert, die auf Melanomzellen der Patientin CSF2RA (engl. GM-CSF receptor alpha chain) in HLA-unabhängiger Weise erkannten. Aus einem der T-Zellklone wurde ein CSF2RA-reaktiver α:β-T-Zellrezeptor (TCR, engl. T-cell receptor) kloniert (Bezeichnung: TCR-1A.3/46). Die α-Kette des TCR enthielt die Domänen TRAV14/DV4*01, TRAJ48*01 und TRAC*01, die β-Kette die Domänen TRBV10-3*01, TRBD2*01, TRBJ2-7*01 und TRBC2*01. Durch Austausch der humanen konstanten gegen die homologen murinen Domänen wurde der TCR optimiert (Bezeichnung: cTCR-1A.3/46) und hinsichtlich seiner Expression und Funktionalität nach retroviralem Transfer in humane PBMC (engl. peripheral blood mononuclear cells) im 51Chromfreisetzungstest, im IFN-γ-ELISpot-Assay und in einem Degranulations-Assay validiert. TCR-transgene T-Zellen lysierten nicht nur spezifisch die HLA-defizienten, CSF2RA+ Melanomlinien des Modells Ma-Mel-86, sondern erkannten auch Zelllinien verschiedener Spezies nach Transfektion von CSF2RA sowie Monozyten, Granulozyten, dendritische Zellen und ein breites Spektrum hämatologischer Malignome myeloiden Ursprungs ungeachtet deren HLA-Phänotypen. Lymphatische Zellen sowie CD34+ Blutstammzellen wurden in In vitro-Untersuchungen nicht erkannt. Der Zusatz von GM-CSF zu Zellen, die CSF2RA und CSF2RB exprimierten, inhibierte die Erkennung durch TCR-transgene PBMC, während die Koexpression der α- und der ß-Kette des GM-CSF-Rezeptors alleine keinen negativen Effekt auf die Erkennung hatte. Daraus war zu schließen, dass CSF2RA präferentiell freistehend und weniger nach Integration in den heteromultimerischen GM-CSF-Rezeptor-Komplex erkannt wurde. In der zweidimensionalen Collier-de-Perles-Visualisierung der IMGT-Datenbank (engl. International immunogenetics information system) wies der CSF2RA-reaktive TCR-1A.3/46 im Vergleich zu TCR von konventionellen, HLA-restringierten T-Zellen keine Besonderheiten auf. Darüber hinaus waren auch die von den HLA-unabhängigen T-Zellen exprimierten CD8-Moleküle identisch zu den CD8-Molekülen HLA-abhängiger CTL (engl. cytotoxic T lymphocytes). Die Präsenz von CD8-Molekülen förderte die HLA-unabhängige Erkennung von CSF2RA, schien aber dafür nicht zwingend erforderlich zu sein, da Antikörper gegen CD8 die Erkennung zu ca. 65 % blockierten und TCR-transgene CD4+ T-Zellen im Vergleich zu TCR-transduzierten CD8+ T-Zellen eine deutlich verringerte, aber noch erhaltene Funktionalität aufwiesen. Es ist derzeit nicht klar, ob HLA-unabhängige T-Zellen gegen CSF2RA im peripheren Blut der Patientin vorkamen, weil sie der im Tiermodell postulierten Thymusselektion MHC-unabhängiger TCR (Tikhonova et al., Immunity 36:79, 2012) entkommen waren, oder weil ein ursprünglich gegen einen HLA-Peptid-Komplex gerichteter TCR eine HLA-unabhängige Kreuzreaktivität aufwies. CSF2RA verbessert die Glucoseutilisation in malignen Zellen, und es wurden ihm embryotrophe Eigenschaften zugeschrieben (Spielholz et al., Blood 85:973, 1995; Sjöblom et al., Biol. Reprod. 67:1817, 2002). Damit kann CSF2RA malignes Wachstum fördern und ist somit ein potentielles Zielmolekül für die Immuntherapie. Seine HLA-unabhängige Erkennung würde sowohl die HLA-Vielfalt als auch den HLA-Verlust als typische Limitationen der T-Zellimmuntherapie umgehen. Zur Überprüfung der In vivo-Spezifität des HLA-unabhängigen TCR gegen CSF2RA und damit zum Ausschluss relevanter off-tumor-/on-target- bzw. off-tumor-/off-target-Effekte ist jedoch eine Testung in einem präklinischen Tiermodell erforderlich.