Proliferação celular em gestações naturais e de conceptos bovinos transgênicos e clonados, que expressam a proteína fluorescente verde (GFP)

Pós-graduação em Ciência e Tecnologia Animal - FEIS

Studi funzionali e strutturali sul wildtype e sul mutante γM23-K della ATP sintasi di Rhodobacter capsulatus: ruolo dell'ADP e della forza protonmotiva nell'attivazione dell’enzima e nell'accoppiamento dell'idrolisi di ATP alla traslocazione protonica

Nel presente lavoro di tesi sono state messe a confronto le ATP sintasi wild-type e γM23-K in cromatofori del batterio fotosintetico Rhodobacter capsulatus sotto gli aspetti funzionale e regolatorio. Si pensava inizialmente che la mutazione, in base a studi riportati in letteratura condotti sull’omologa mutazione in E. coli, avrebbe indotto disaccoppiamento intrinseco nell’enzima. Il presente lavoro ha chiarito che il principale effetto della mutazione è un significativo aumento dell’affinità dell’enzima per l’ADP inibitorio, che ne determina il ridotto livello di ATP idrolisi e la rapidissima reinattivazione in seguito ad attivazione da forza protonmotiva. Il residuo 23 della subunità γ si trova posizionato in prossimità della regione conservata DEELSED carica negativamente della subunità β, e l’introduzione nel mutante di una ulteriore carica positiva potrebbe determinare una maggiore richiesta di energia per indurre l’apertura del sito catalitico. Un’analisi quantitativa dei dati di proton pumping condotta mediante inibizione parziale dell’idrolisi del wildtype ha inoltre mostrato come il grado di accoppiamento del mutante in condizioni standard non differisca sostanzialmente da quello del wild-type. D’altro canto, è stato recentemente osservato come un disaccoppiamento intrinseco possa venire osservato in condizioni opportune anche nel wild-type, e cioè a basse concentrazioni di ADP e Pi. Nel presente lavoro di tesi si è dimostrato come nel mutante l’osservazione del fenomeno del disaccoppiamento intrinseco sia facilitata rispetto al wild-type. È stato proprio nell’ambito delle misure condotte sul mutante che è stato possibile dimostrare per la prima volta il ruolo fondamentale della componente elettrica della forza protonmotiva nel mantenere lo stato enzimatico ad elevato accoppiamento. Tale ruolo è stato successivamente messo in luce anche nel wild-type, in parte anche grazie all’uso di inibitori specifici di F1 e di FO. Il disaccoppiamento intrinseco nel wild-type è stato ulteriormente esaminato anche nella sua dipendenza dalla rimozione di ADP e Pi; in particolare, oltre all’amina fluorescente ACMA, è stata utilizzata come sonda di ΔpH anche la 9-aminoacridina e come sonda di Δψ l’Oxonolo VI. In entrambi i casi il ruolo accoppiante di questi due ligandi è stato confermato, inoltre utilizzando la 9-aminoacridina è stato possibile calibrare il segnale di fluorescenza con salti acido-base, dando quindi una base quantitativa ai dati ottenuti. Noi riteniamo che il più probabile candidato strutturale coinvolto in questi cambiamenti di stato enzimatici sia la subunità ε, di cui è noto il coinvolgimento in processi di regolazione e in cambiamenti strutturali indotti da nucleotidi e dalla forza protonmotiva. In collaborazione con il Dipartimento di Chimica Fisica dell’Università di Friburgo è in atto un progetto per studiare i cambiamenti strutturali presumibilmente associati al disaccoppiamento intrinseco tramite FRET in singola molecola di complessi ATP-sintasici marcati con fluorofori sia sulla subunità ε che sulla subunità γ. Nell’ambito di questa tesi sono stati creati a questo fine alcuni doppi mutanti cisteinici ed è stato messo a punto un protocollo per la loro marcatura con sonde fluorescenti.

Design e sintesi di nuove sonde luminescenti per il "targeting" dell'avidina

Recent studies on the use of bio-conjugating organometallic probes report on the possibility to use biotinylated-derivatives to selectively coordinate to a specific protein, avidin. In the present thesis, the synthesis of four new bifunctional ligands is described. The ligands contain both a pyridine triazolic unit able to coordinate a transition metal, and a biotin fragment able to bond avidin: the two functionalities are linked together by an appropriate aromatic linker (amide or ester). The obtained ligands were then employed to form luminescent Ir(III) complexes, that have been fully characterized also by a photophysical point of view both in organic and in aqueous solvent. Therefore, titrations of solutions of avidin with aqueous solutions of Ir(III)-complexes have been performed in order to estimate the luminescence variations of the complexes in the presence or in the absence of bio-conjugation.

Nuove sonde fluorescenti per lo studio e la quantificazione del magnesio totale intracellulare

Sebbene il magnesio sia essenziale per la maggior parte dei processi biologici, si conosce ancora poco sulla sua distribuzione e compartimentalizzazione intracellulare, soprattutto a causa dell’inadeguatezza delle tecniche attualmente disponibili. Per questo motivo, particolare interesse ha recentemente suscitato una famiglia di molecole fluorescenti, diaza-18-crown-6 8-idrossichinoline (DCHQ1 e suoi derivati), che mostrano un’alta specificità e affinità per il magnesio (superiore a quella delle sonde commerciali), che consente di mappare il magnesio totale intracellulare. L’approccio sintetico alle molecole DCHQ è stato ottimizzato mediante riscaldamento alle microonde: con questa nuova metodica è stato possibile sintetizzare una famiglia di derivati con caratteristiche di fluorescenza, uptake, ritenzione e localizzazione intracellulare potenziate rispetto alla capostipite DCHQ1. Il derivato acetometossi estere (DCHQ3), idrolizzato dalle esterasi cellulari, ha mostrato un miglior uptake e ritenzione intracellulare; le lunghe catene laterali alchiliche della sonda DCHQ4, invece, hanno conferito a questo derivato maggiore lipofilicità e, di conseguenza, maggiore affinità per le membrane; con l’inserimento di gruppi laterali aromatici, infine, si sono ottenute due sonde (DCHQ5 e DCHQ6) molto fluorescenti e altamente ritenute all’interno delle cellule anche dopo i lavaggi. Il derivato fenilico DCHQ5 si è dimostrato, inoltre, utilizzabile anche per saggi fluorimetrici quantitativi del magnesio totale in campioni cellulari molto piccoli; in più, grazie all’alta ritenzione cellulare, è stato usato per monitorare e quantificare l’efflusso di magnesio attraverso la membrana plasmatica in risposta a stimolazione con cAMP. I risultati presentati in questa tesi mostrano che i DCHQ-derivati potranno rappresentare in futuro uno strumento versatile per lo studio della distribuzione e dell’omeostasi del magnesio cellulare. In particolare la sonda DCHQ5 ha mostrato l’ulteriore peculiarità di essere eccitabile sia nell’UV che nel visibile, e potrebbe essere quindi utilizzata con successo in un’ampia varietà di misure di fluorescenza, fornendo un contributo importante per la comprensione del ruolo di questo importante elemento.

Messa a punto di un sistema di calibrazione per sonde di Pitot a cinque fori

La messa a punto di un sistema di calibrazione per sonde di Pitot a cinque fori è indagata e realizzata per mezzo di un flusso di calibrazione assialsimmetrico, per differenti velocità asintotiche dello stesso. Mappe di calibrazione sono presentate, unitamente a procedure di calcolo specifiche per il vettore velocità di un flusso fluido in regime stazionario. Uno studio dettagliato di precisione di ripetibilità e accuratezza per il sistema, accompagna la trattazione.

Studio della stabilita spazio-temporale di G: modello di laboratorio di un apparato per sonde interplanetarie

L'isolamento gravitazionale delle sonde dello spazio profondo durante le loro fasi di crociera ed i loro esigui livelli di vibrazioni, le rendono la migliore collocazione possibile per mini-laboratori automatici di fisica fondamentale da installare su di esse come strumenti scientifici. Date le note difficoltà di misurazione della costante di gravitazione universale, probabilmente dovute alla collocazione terrestre dei laboratori, si propone di dedicare un mini-laboratorio alla misurazione del valore locale ed istantaneo della costante G ed alla sua stabilità spazio-temporale durante il moto della sonda. La misurazione di G nel mini-laboratorio può essere effettuata rilasciando con attuatori elettrostatici, senza velocità relativa, due masse campione, preferibilmente due sfere d’oro da 1Kg, a distanza di 1 mm, e monitorando il loro libero moto, dominato dall’attrazione gravitazionale reciproca, con un sensore di spostamento laser interferometrico multicanale. Dopo il congiungimento le masse dovrebbero essere riposizionate e rilasciate nuovamente per una misurazione quasi continua della costante. Un meccanismo dorrebbe invece bloccare le masse durante le fasi dinamiche della sonda. Un sensore di spostamento interferometrico a fibre ottiche, FPS3010 della Attocube, appariva adatto ed un esperimento è stato realizzato per provarlo in un apparato simulante il mini-laboratorio. In una campana del vuoto isolata dalle vibrazioni, due cilindri in tungsteno da 1Kg sono stati sospesi orizzontante tramite micro-Dyneema a piastre in allumino movimentate da nanoposizionatori piezoelettrici dotati di encoder ottico nanometrico. Il sensore ha monitorato il moto radiale dei cilindri, le cui basi combacianti sono state posizionate a distanze di separazione variabili da 10 micron a 5000 micron. Malgrado il rumore meccanico ed una sorgente ignota di errore sistematico, un moto attrattivo è stato riscontrato differenzialmente o direttamente in molte misurazioni e nessuna ha mostrato un moto repulsivo. In alcune misurazioni è direttamente visibile la rotazione dell’asse di oscillazione dei cilindri sospesi. Il sensore si è comportato egregiamente.

Anemometria a filo caldo: studio di un sistema di calibrazione per sonde a due fili con applicazione al "long pipe" in CICLoPE

L’anemometro a filo caldo (in inglese hot wire) é lo strumento maggiormente usato per studiare sperimentalmente la turbolenza. A seconda di quante componenti della velocitá interessa studiare, esistono anemometri a uno, due o tre fili. Questo elaborato di tesi si concentra su sonde a due fili. Per prima cosa, ogni volta che si utilizza questo strumento bisogna effettuare una calibrazione, fase molto importante perché permette di relazionare le tensioni che ogni filo acquisisce con la velocitá reale del flusso. Sono presentati tre differenti metodi utilizzati per sonde a due fili e, dopo averli analizzati, sono stati applicati a dati acquisiti prima al CAT (Coaxial Aerodinamic Tunnel), struttura presente a Forlí, nell’hangar dell’Universitá di Bologna e poi al CICLoPE (Center for International Cooperation in Long Pipe Experiments), Long-Pipe costruito a Predappio, utilizzato per lo studio della turbolenza. La calibrazione per sonde a due fili si puó dividere in due parti, quella di velocitá e quella per gli angoli. Mentre al CAT é possibile effettuarle entrambi, al CICLoPE non é attualmente possibile eseguire la calibrazione angolare perché non esiste alcuno strumento utilizzabile per regolare la sonda all’angolo desiderato. Lo scopo di questo elaborato di tesi è trovare un metodo di calibrazione per sonde a due fili applicabile al CICLoPE eseguendo sul posto solamente una calibrazione di velocitá e adattando quella angolare effettuata precedentemente al CAT. Questo puó provocare dei problemi perché la calibrazione risulta fortemente dipendente da condizioni interne dei fili, come la resistenza, ma anche da condizioni al contorno, come la temperatura e la pressione dell’ambiente esterno. Dopo aver eseguito due campagne sperimentali di test, una al CAT e una al CICLoPE, i dati acquisiti sono stati elaborati per valutare l’efficacia dei vari metodi.

Confronto di dati volumetrici di neuroimaging RM, acquisiti con differenti sonde a radiofrequenza

Il lavoro di questa tesi si propone di esaminare i dati di immagini cerebrali ricevuti da due differentii bobine RF per l'imaging in risonanza magnetica. La strumentazione utilizzata é: un apparecchio di RMN che utilizza uno scanner a 1.5T (GE Medical System signa HDx 15) e due differenti bobine a radiofrequenza: 1) 8-channel brain phased array coil GE (1.5T HD 8 Channel High Resolution Head Array per il GE HDx MR System); 2) GE Quad HEAD Birdcage Coil. I software utilizzati invece sono stati quattro, due per la segmentazione e la parcellizzazione dei dati dalle acquisizioni di MRI (FSL e Freesurfer), e due per l'analisi dei dati (SPSS e Microsoft Excel). I tool utilizzati di FSL sono stati SIENA, per un'indagine sulla variazione percentile della totalitá del volume cerebrale; SIENAX invece permette una segmentazione di volumi di 6 sotto regioni: sostanza grigia (GREY), sostanza bianca (WHITE), totalitá del cervello (BRAIN), liquor cerebrospinale dei ventricoli (vcsf), scaling volumetrico (vscaling), sostanza grigia periferica (pgrey). Freesurfer invece parcellizza la corteccia cerebrale e segmenta le zone della sostanza grigia profonda cerebrale. Lo scopo ultimo era quello di analizzare come la differenza di segnale acquisito dalle due bobine variasse i risultati delle analisi volumetriche delle immagini e vedere se il t-test evidenziasse variazioni sistematiche. Questa analisi aveva come scopo quello di determinare la possibilità di confrontare i soggetti i cui dati sono stati ottenuti con due bobine differenti. I dati analizzati non hanno evidenziato particolari differenze tra le due bobine, se non per i valori del liquor dei ventricoli che sono risultati variare, verosimilmente, per i processi fisiologici di atrofia della sostanza grigia cerebrale che avvengono nel tempo intercorso tra un'acquisizione e l'altra.

Die Macht der alten Sonde ; ...

W. Bernhard

Mecanismos e a influência de ferro lábil em processos nitrosativos intracelulares utilizando o indicador fluorescente 4,5 diamino fluoresceína

Neste trabalho foram investigados os mecanismos e o perfil cinético de processos nitrosativos do ponto de vista da nitrosação do indicador 4,5-diamino fluoresceina (DAF2) em células do tipo RAW 264.7. Também foi investigado o papel que ferro lábil (LIP) exerce em tais processos. O estudo cinético mostrou que a nitrosação do DAF2 é dependente de superóxido intracelular e se processa por dois mecanismos distintos denominados nitrosilação oxidativa e nitrosação. Observou-se que o perfil cinético da nitrosaçao do DAF2 sofre uma transição passando de dependente para independente com relação à concentração de NO, quando a concentração de NO se aproxima de 100-110nM. Este perfil está relacionado com a dinâmica de recombinação entre NO e O2¯ que dispara todo o processo de nitrosação do DAF2. No trabalho fica claro que processos nitrosativos que ocorrem pelos mesmos mecanismos podem apresentar perfis cinéticos completamente diferentes dependendo da localização onde ocorre a recombinação entre NO e O2¯. O ponto mais interessante foi a constatação de que quelantes permeáveis à membranas biológicas estimulam a nitrosação do DAF2 intracelular. Este efeito é decorrente da remoção de LIP intracelular que, surpreendementemente, apresenta papel antinitrosativo nas condições experimentais estudadas. O papel incomum antinitrosativo apresentado por LIP é analizado do ponto de vista da reação entre LIP e ONOO¯ que tem como produto nitrito, uma espécie não nitrosante. Estes resultados podem alterar a forma como LIP é visto em processos oxidativos e nitrosativos.

Hibridación in situ fluorescente (FISH)

Background: At the end of 80s, cloning technologies with the increase of the antibodies’ sensibility made easier the development of technologies based on Fluorescence in situ Hibridation (FISH). Nowadays, It’s widely used in the field of basic investigation as much as clinic diagnostic. Method: FISH is a technique that combines molecular biology with histochemistry way to detect specific nucleotide sequences so that chromosome’s section or even whole chromosome can be marked on metaphases cells (cell in division) and on attached cellular nucleus. This detection is realized using DNA fluorescence probes (marked with fluorophores), that can be different according to the structures manage to detect: large single-locus probes, small unique-sequence probes, chromosome- or region-specific “paints” or repetitive sequence probes and genomic DNA probes. Some of the applications of this technique is that can be so useful in the detection of numerical and structural chromosomal alterations such as polyploidies or genomic rearrangement, to mapping metaphases cells and even to detect bacteria or another type of microorganism. In addition, FISH allows us to monitoring diseases (antitumor therapies, quantification of genomic altered cells…) and the precise location of chromosomic broken spots on tumor searching for new genes involved in cancer and detect and map interested known genes. Conclusion: FISH has many advantages ahead of conventional cytogenetic techniques (bands G karyotype) overall at the time of establish a clinic diagnostic to detect tumors and chromosomic aberration, presenting a higher sensibility and specificity as well as being a relative quick technique (24 hours).

Implementazione e caratterizzazione di PLL digitali per doppler tracking di sonde deep space

I Phase-Locked Loops sono circuiti ancora oggi utilizzati per la generazione di segnali coerenti in frequenza e in fase con i segnali in ingresso, motivo per cui sono uno degli strumenti della radio scienza per la ricostruzione dei segnali scambiati con le sonde e nascosti dal rumore accumulato nel tragitto che separa le sonde stesse dalle stazioni di tracking a terra. Questa tesi illustra l'implementazione di un PLL digitale linearizzato in Matlab e Simulink in una nuova veste rispetto al modello implementato durante l'attività di tirocinio curricolare, al fine di migliorarne le prestazioni per bassi carrier-to-noise density ratios. Il capitolo 1 si compone di due parti: la prima introduce all'ambito nel quale si inserisce il lavoro proposto, ossia la determinazione d'orbita; la seconda illustra i fondamenti della teoria dei segnali. Il capitolo 2 è incentrato sull'analisi dei Phase-Locked Loops, partendo da un'introduzione teorica e approdando all'implementazione di un modello in Simulink. Il capitolo 3, infine, mostra i risultati dell'applicazione del modello implementato in Simulink nell'analisi dei segnali di una missione realmente svolta.