Nuove sonde fluorescenti per lo studio e la quantificazione del magnesio totale intracellulare

Sebbene il magnesio sia essenziale per la maggior parte dei processi biologici, si conosce ancora poco sulla sua distribuzione e compartimentalizzazione intracellulare, soprattutto a causa dell’inadeguatezza delle tecniche attualmente disponibili. Per questo motivo, particolare interesse ha recentemente suscitato una famiglia di molecole fluorescenti, diaza-18-crown-6 8-idrossichinoline (DCHQ1 e suoi derivati), che mostrano un’alta specificità e affinità per il magnesio (superiore a quella delle sonde commerciali), che consente di mappare il magnesio totale intracellulare. L’approccio sintetico alle molecole DCHQ è stato ottimizzato mediante riscaldamento alle microonde: con questa nuova metodica è stato possibile sintetizzare una famiglia di derivati con caratteristiche di fluorescenza, uptake, ritenzione e localizzazione intracellulare potenziate rispetto alla capostipite DCHQ1. Il derivato acetometossi estere (DCHQ3), idrolizzato dalle esterasi cellulari, ha mostrato un miglior uptake e ritenzione intracellulare; le lunghe catene laterali alchiliche della sonda DCHQ4, invece, hanno conferito a questo derivato maggiore lipofilicità e, di conseguenza, maggiore affinità per le membrane; con l’inserimento di gruppi laterali aromatici, infine, si sono ottenute due sonde (DCHQ5 e DCHQ6) molto fluorescenti e altamente ritenute all’interno delle cellule anche dopo i lavaggi. Il derivato fenilico DCHQ5 si è dimostrato, inoltre, utilizzabile anche per saggi fluorimetrici quantitativi del magnesio totale in campioni cellulari molto piccoli; in più, grazie all’alta ritenzione cellulare, è stato usato per monitorare e quantificare l’efflusso di magnesio attraverso la membrana plasmatica in risposta a stimolazione con cAMP. I risultati presentati in questa tesi mostrano che i DCHQ-derivati potranno rappresentare in futuro uno strumento versatile per lo studio della distribuzione e dell’omeostasi del magnesio cellulare. In particolare la sonda DCHQ5 ha mostrato l’ulteriore peculiarità di essere eccitabile sia nell’UV che nel visibile, e potrebbe essere quindi utilizzata con successo in un’ampia varietà di misure di fluorescenza, fornendo un contributo importante per la comprensione del ruolo di questo importante elemento.

Although magnesium is essential for a number of biological processes crucial for cell life, its distribution and intracellular compartimentalization have not been thoroughly elucidated yet, mainly because of the inadequacy of the available techniques to map intracellular magnesium distribution. For this reason, particular interest has been recently raised by a family of fluorescent molecules, diaza-18-crown-6 8-hydroxyquinolines (DCHQ1 and its derivatives), that show a remarkable affinity and specificity for magnesium, higher than all the commercially available probes, thus permitting the detection of the total intracellular magnesium. The synthetic approach to DCHQ has been optimized using microwave heating: with this new procedure a variety of substituted DCHQ derivatives with improved fluorescence, uptake and selective localization with respect to the original reference material (DCHQ1) could be easily generated. Enhanced uptake has been achieved with an acetoxymethyl ester derivative (DCHQ3) that is recognized by the intracellular esterases. Moreover, the insertion of two long hydrophobic side chains (DCHQ4) allowed a better staining of the membranes due to its high affinity to the lipophilic environment. Finally, the introduction of aromatic side groups (DCHQ5 and DCHQ6) enhanced the fluorescence response in cells and also improved intracellular uptake and retention of the probes even after washing. The phenyl-derivative DCHQ5, in particular, can also be used for quantitative fluorimetric assays of total magnesium in very small samples; moreover, thanks to the high cellular retention, DCHQ5 has been used in monitoring and quantifying the total Mg efflux across the membrane in response to cAMP stimulation. Finally, its unique feature of being excitable both in the UV and visible range of wavelength, together with the high fluorescence in response to cation binding, led us to hypothesize that this molecule could act as an effective tool for shedding light on total intracellular magnesium distribution and homeostasis.