Technology for Single Cell Protein Analysis in Immunology and Cancer Prognostics

The first chapter of this thesis deals with automating data gathering for single cell microfluidic tests. The programs developed saved significant amounts of time with no loss in accuracy. The technology from this chapter was applied to experiments in both Chapters 4 and 5.

The second chapter describes the use of statistical learning to prognose if an anti-angiogenic drug (Bevacizumab) would successfully treat a glioblastoma multiforme tumor. This was conducted by first measuring protein levels from 92 blood samples using the DNA-encoded antibody library platform. This allowed the measure of 35 different proteins per sample, with comparable sensitivity to ELISA. Two statistical learning models were developed in order to predict whether the treatment would succeed. The first, logistic regression, predicted with 85% accuracy and an AUC of 0.901 using a five protein panel. These five proteins were statistically significant predictors and gave insight into the mechanism behind anti-angiogenic success/failure. The second model, an ensemble model of logistic regression, kNN, and random forest, predicted with a slightly higher accuracy of 87%.

The third chapter details the development of a photocleavable conjugate that multiplexed cell surface detection in microfluidic devices. The method successfully detected streptavidin on coated beads with 92% positive predictive rate. Furthermore, chambers with 0, 1, 2, and 3+ beads were statistically distinguishable. The method was then used to detect CD3 on Jurkat T cells, yielding a positive predictive rate of 49% and false positive rate of 0%.

The fourth chapter talks about the use of measuring T cell polyfunctionality in order to predict whether a patient will succeed an adoptive T cells transfer therapy. In 15 patients, we measured 10 proteins from individual T cells (~300 cells per patient). The polyfunctional strength index was calculated, which was then correlated with the patient's progress free survival (PFS) time. 52 other parameters measured in the single cell test were correlated with the PFS. No statistical correlator has been determined, however, and more data is necessary to reach a conclusion.

Finally, the fifth chapter talks about the interactions between T cells and how that affects their protein secretion. It was observed that T cells in direct contact selectively enhance their protein secretion, in some cases by over 5 fold. This occurred for Granzyme B, Perforin, CCL4, TNFa, and IFNg. IL- 10 was shown to decrease slightly upon contact. This phenomenon held true for T cells from all patients tested (n=8). Using single cell data, the theoretical protein secretion frequency was calculated for two cells and then compared to the observed rate of secretion for both two cells not in contact, and two cells in contact. In over 90% of cases, the theoretical protein secretion rate matched that of two cells not in contact.

Desenvolvimento e validação de modelo preditivo e avaliação de testes de diagnóstico por classe latente para o parasitismo por L. chagasi em cães atendidos no Hospital Veterinário Universitário da UFPI, Teresina

A leishmaniose visceral americana (LVA) é uma doença em expansão no Brasil, para a qual se dispõem de poucas, e aparentemente ineficientes, estratégias de controle. Um dos grandes problemas para a contenção da leishmaniose visceral americana é a falta de um método acurado de identificação dos cães infectados, considerados os principais reservatórios da doença no meio urbano. Neste sentido, a caracterização de marcadores clínico-laboratoriais da infecção neste reservatório e a avaliação mais adequada do desempenho de testes para diagnóstico da infecção podem contribuir para aumentar a efetividade das estratégias de controle da LVA. Com isso, o presente estudo tem dois objetivos principais: (1) desenvolver e validar um modelo de predição para o parasitismo por Leishmania chagasi em cães, baseado em resultados de testes sorológicos e sinais clínicos e (2) avaliar a sensibilidade e especificidade de critérios clínicos, sorológicos e parasitológicos para detecção de infecção canina por L. chagasi mediante análise de classe latente. O primeiro objetivo foi desenvolvido a partir de estudo em que foram obtidos dados de exames clínico, sorológico e parasitológico de todos os cães, suspeitos ou não de LVA, atendidos no Hospital Veterinário Universitário da Universidade Federal do Piauí (HVU-UFPI), em Teresina, nos anos de 2003 e 2004, totalizando 1412 animais. Modelos de regressão logística foram construídos com os animais atendidos em 2003 com a finalidade de desenvolver um modelo preditivo para o parasitismo com base nos sinais clínicos e resultados de sorologia por Imunofluorescência Indireta (IFI). Este modelo foi validado nos cães atendidos no hospital em 2004. Para a avaliação da área abaixo da curva ROC (auROC), sensibilidade, especificidade, valores preditivos positivo (VPP), valores preditivos negativo (VPN) e acurácia global, foram criados três modelos: um somente baseado nas variáveis clínicas, outro considerando somente o resultado sorológico e um último considerando conjuntamente a clínica e a sorologia. Dentre os três, o último modelo apresentou o melhor desempenho (auROC=90,1%, sensibilidade=82,4%, especificidade=81,6%, VPP=73,4%, VPN=88,2% e acurácia global=81,9%). Conclui-se que o uso de modelos preditivos baseados em critérios clínicos e sorológicos para o diagnóstico da leishmaniose visceral canina pode ser de utilidade no processo de avaliação da infecção canina, promovendo maior agilidade na contenção destes animais com a finalidade de reduzir os níveis de transmissão. O segundo objetivo foi desenvolvido por meio de um estudo transversal com 715 cães de idade entre 1 mês e 13 anos, com raça variada avaliados por clínicos veterinários no HVU-UFPI, no período de janeiro a dezembro de 2003. As sensibilidades e especificidades de critérios clínicos, sorológicos e parasitológicos para detecção de infecção canina por Leishmania chagasi foram estimadas por meio de análise de classe latente, considerando quatro modelos de testes e diferentes pontos de corte. As melhores sensibilidades estimadas para os critérios clínico, sorológico e parasitológico foram de 60%, 95% e 66%, respectivamente. Já as melhores especificidades estimadas para os critérios clínico, sorológico e parasitológico foram de 77%, 90% e 100%, respectivamente. Conclui-se que o uso do exame parasitológico como padrão-ouro para validação de testes diagnósticos não é apropriado e que os indicadores de acurácia dos testes avaliados são insuficientes e não justificam que eles sejam usados isoladamente para diagnóstico da infecção com a finalidade de controle da doença.

A influência da habilidade empática sobre o perdão interpessoal

Diversos estudos têm apontado os benefícios da habilidade empática. Ela está associada à saúde e bem-estar psicológicos, a relacionamentos mais satisfatórios, a comportamentos pró-sociais e morais, à resiliência etc., ao passo que sua ausência está associada a diversos prejuízos pessoais e interpessoais. Como habilidade social, entende-se que a empatia é um fenômeno multidimensional, com aspectos cognitivos, afetivos e comportamentais. Respectivamente, envolve a capacidade de compreender o ponto de vista do outro, de se interessar genuinamente pelo seu bem-estar, e de expressar, por meio de comportamentos verbais e/ou não verbais, sua compreensão e interesse ao interlocutor, permitindo a este se sentir entendido e validado em suas experiências. Esta habilidade tem sido associada, mais recentemente, por diversos estudos internacionais, à capacidade de perdoar um ofensor por suas transgressões. Com isso, o propósito do presente trabalho foi investigar a influência da habilidade empática sobre o perdão interpessoal, em uma amostra brasileira. O perdão também vem sendo considerado uma experiência multifatorial, com domínios cognitivos, afetivos e comportamentais, que abrangem os pensamentos, as emoções e os comportamentos em relação a um ofensor. Para a realização desta investigação, 172 participantes responderam o Inventário de Empatia (IE), a Escala de Atitudes (o Enright Forgiveness Inventory EFI) e uma ficha sobre dados socidemográficos. O IE apresenta quatro subescalas: Tomada de Perspectiva, Sensibilidade Afetiva, Flexibilidade Interpessoal e Altruísmo. O EFI apresenta uma Escala Global de perdão e três Subescalas: Afetiva, Cognitiva e Comportamental. Testes correlacionais e de regressão foram processados a fim de investigar as relações entre os fatores do IE e do EFI, bem como a predição da empatia sobre o perdão. Os resultados indicaram diversas relações positivas e significativas estatisticamente: a Tomada de Perspectiva se relacionou à Escala Global do perdão e às Subescalas Afetiva e Comportamental; a Sensibilidade Afetiva e o Altruísmo se relacionaram à Escala Global e à Comportamental do perdão; a Flexibilidade Interpessoal foi o único fator empático que não apresentou correlações significativas com o perdão. Com a regressão, constatou-se que: Altruísmo e Tomada de Perspectiva, combinados, ou Tomada de Perspectiva, sozinha, predisseram o Perdão Global; Sensibilidade Afetiva, Tomada de Perspectiva e Altruísmo, combinados ou individualmente, tiveram valor preditivo sobre a Subescala Comportamental do perdão; e apenas a Tomada de Perspectiva, sozinha, predisse a Subescala Afetiva do perdão. Nenhum fator do IE teve valor preditivo sobre a Subescala Cognitiva do perdão e a Flexibilidade Interpessoal não predisse qualquer dimensão do EFI. Os resultados encontrados apoiam pesquisas anteriores, confirmando a importância da empatia para a ocorrência do perdão interpessoal. Contudo, ressalta-se que a Tomada de Perspectiva se destacou como a dimensão empática mais importante, sugerindo a relevância que a capacidade de adotar o ponto de vista do outro tem para que o perdão seja alcançado.

A manifestação da empatia e sua influência na satisfação conjugal

A satisfação alcançada no casamento influencia fortemente a qualidade de vida. Por outro lado, conflitos conjugais estão relacionados a problemas de saúde, a violência e ao divórcio. Mesmo com as dificuldades inerentes a qualquer relacionamento conjugal, o matrimônio parece ser ainda um desejo a ser realizado por muitos. Porém, para que o relacionamento seja uma fonte de felicidade e resulte em uma relação satisfatória, os cônjuges precisam investir no desenvolvimento constante de habilidades para que assim possam lidar com as adversidades geradas pela vida a dois. Estudos apontam que a capacidade de ouvir e compreender, bem como de demonstrar sensibilidade frente às necessidades dos outros (empatia) constitui um dos fatores importantes para um casamento feliz, na medida em que, ao se sentir ouvido e compreendido, o cônjuge se sente mais seguro e valorizado. No entanto, ainda não está claro, se o cônjuge que manifesta empatia (empatia manifestada) experimenta tanta satisfação conjugal quanto aquele que a recebe (empatia recebida). Esse estudo investigou o valor preditivo da expressão de empatia sobre a satisfação no casamento. Foram utilizadas três medidas de auto-informe: Escala de Satisfação Conjugal (ESC-Dela Coleta, 1989), medição da satisfação conjugal; Inventário de Empatia (IE-Falcone & cols., 2008), que avalia a empatia geral; Questionário de Empatia Conjugal (QEC-Oliveira, Falcone & Ribas Jr, 2009) que avalia a empatia conjugal, sendo este último adaptado para tornar-se um questionário de auto-informe. Todos os questionários foram respondidos por 108 indivíduos casados ( 69 do sexo feminino e 39 do sexo masculino). Através da Análise de Regressão Múltipla, onde a medida de satisfação conjugal foi a variável dependente e os cinco fatores correspondentes às duas medidas de empatia foram as variáveis independentes. Verificou-se que a expressão da empatia conjugal foi preditiva da satisfação conjugal em suas três dimensões: 1) Interação conjugal (IC); 2) Aspectos emocionais (AEm) e 3) Aspectos estruturais (AEs). Dentre os fatores do IE, a Sensibilidade Afetiva (SA) foi preditiva, no sentido inverso (r= -0.23 e p<0.05), dos Aspectos Emocionais (AEm) da ESC. No que diz respeito ao IE e a relação de seus fatores com o QEC, a Tomada de Perspectiva (TP) e a Sensibilidade Afetiva (SA) apresentaram correlações moderadas e significativas (r=.38 e p<.001 e r=.35 e p<.001, respectivamente). Espera-se que esse estudo possa contribuir para a construção de programas visando desenvolver empatia em indivíduos casados, facilitando a comunicação e a satisfação no casamento.