Production of bioactive peptides through sequencial action of Yarrowia lipolytica proteases and chemical glycation

This PhD thesis is aimed at studying the suitability of proteases realised by Yarrowia lipolytica to hydrolyse proteins of different origins available as industrial food by-products. Several strains of Y. lipolytica have been screened for the production of extracellular proteases by zymography. On the basis of the results some strains released only a protease having a MW of 37 kDa, which corresponds to the already reported acidic protease, while other produced prevalently or only a protease with a MW higher than 200 kDa. The proteases have been screened for their "cold attitude" on gelatin, gluten and skim milk. This property can be relevant from a biotechnological point of view in order to save energy consumption during industrial processes. Most of the strains used were endowed with proteolytic activity at 6 °C on all the three proteins. The proteolytic breakdown profiles of the proteins, detected at 27 °C, were different related to the specific strains of Y. lipolytica. The time course of the hydrolysis, tested on gelatin, affected the final bioactivities of the peptide mixtures produced. In particular, an increase in both the antioxidant and antimicrobial activities was detected when the protease of the strain Y. lipolytica 1IIYL4A was used. The final part of this work was focused on the improvement of the peptides bioactivities through a novel process based on the production of glycopeptides. Firstly, the main reaction parameters were optimized in a model system, secondly a more complex system, based on gluten hydrolysates, was taken into consideration to produce glycopeptides. The presence of the sugar moiety reduced the hydrophobicity of the glycopeptides, thus affecting the final antimicrobial activity which was significantly improved. The use of this procedure could be highly effective to modify peptides and can be employed to create innovative functional peptides using a mild temperature process.

Electrostatically self-assembled nanoparticles based on biomolecules

In this work, two different systems were investigated to develop fundamental understanding of the self-assembly behavior of polyelectrolytes and small organic counterions with a certain geometry. Complexes formed were characterized by light scattering in solution, as well as UV-Vis spectroscopy, analytical ultracentrifugation, gel electrophoresis, zeta potential and IR spectroscopy. The morphologies of the aggregates were observed by AFM in dried state on surface. The charge ratio, the valence and the structure of the counterion were shown to represent key parameters in the complexation. The influence of polyelectrolyte type and molecular weights was also determined for the structure formed.rnrnOne system was mainly focused on the association of double-strand DNA with non-intercalating divalent and tetravalent organic counterions. The other model system involved linear NaPSS and oligolysines. In addition, various influences on the morphology of the charged self-assembly complexes in AFM studies were discussed. It was shown that electrostatic self-assembly of DNA and non-intercalating counterions as well as of a linear synthetic polyelectrolyte with oligolysine counterions that can build mutual hydrogen bonds can yield supramolecular aggregates of a defined size. Various morphologies (flower-like, rod-like, toroidal and spherical) of the assemblies were obtained for different combinations of polyelectrolyte and counterions. Results presented in this work are of importance for the fundamental understanding of the association behavior of various polyelectrolytes and organic counterions. The selection of biopolymers for the study may give an opportunity to transfer the basic research results into biological applications, such as gene therapy or drug delivery.rn

Derivate des Ionentransporters Valinomycin

In der vorliegenden Arbeit wurden Derivate des Ionentransporters Valinomycin synthetisiert und als Sensorelemente in Modellmembransysteme inkorporiert. Als Modellmembranen wurden festkörpergestützte Lipiddoppelschichten (tBLMs, tethered bilayer lipid membranes) verwendet. rnValinomycin transportiert selektiv Kalium-Ionen durch Membranen, was durch einen Rückgang des Widerstandes über elektrochemische Messmethoden nachgewiesen werden kann. Es ist ein zyklisches Dodecadepsipeptid, das aus zwei verschiedenen Aminosäuren (L- und D-Valin) und  Hydroxysäuren (L Milchsäure und D Hydroxyisovaleriansäure) besteht. In dieser Arbeit wurde ein L Valin durch ein L-Lysin ausgetauscht, um eine freie Aminogruppe zum Anbinden verschiedenster Liganden zu erhalten. rnDie Synthese erfolgte in Lösung über einen linearen Decadepsipeptid-Precursor, hierbei wurde hauptsächlich mit Benzyl- und Boc-Schutzgruppen gearbeitet. An den Precursor wurden dann unterschiedlich modifizierte Lysin-Didepside gebunden und das daraus erhaltene lineare Dodecadepsipeptid zyklisiert.rnInsgesamt wurden sechs verschiedene Derivate synthetisiert, deren Ionentransportfähigkeit mit Hilfe eines angebundenen Liganden blockiert wurde. Diese Blockade kann entweder mechanisch durch Festhalten des Ionencarriers an der Oberfläche der Membran oder chemisch durch Einbringen einer Ladung erfolgen, da geladene Moleküle eine Membran nicht überwinden können. rnAcetyl-Lysin-Valinomycin wurde als Testsystem hergestellt, um zu zeigen, dass die Synthese einen funktionsfähigen Ionencarrier ergeben hatte. Im nächsten Schritt wurde Lysin-Valinomycin mit freier Aminogruppe synthetisiert, um es als pH-Sensor zu nutzen und damit zu überprüfen, ob das chemische Einbringen einer Ladung möglich ist. Es konnte ein pH abhängiger Kalium-Transport nachgewiesen werden, die Blockade der Ionentransportfähigkeit über eine eingebrachte Ladung ist somit möglich. rnAuf dem gleichen Konzept beruht Ferrocen-Valinomycin. Wird der Ferrocen-Ligand oxidiert, liegt eine positive Ladung vor und der Ionencarrier kann die Membran nicht mehr überwinden. Eine Reduktion macht diesen Prozess reversibel. Ferrocen-Valinomycin konnte innerhalb einer tBLM chemisch oxidiert und reduziert werden, dieses System kann somit als chemischer Redox-Sensor eingesetzt werden.rnEine mechanische Blockade liegt dem Biotin- und dem Sulfonamid-Valinomycin zugrunde. Dabei soll die Zugabe von Streptavidin bzw. BCA II (bovine Carboanhydrase) den Ionentransport durch die Membran stoppen. Beide Valinomycin-Derivate zeigten aber keine Ionentransportfähigkeit, eine Inkorporation in tBLMs konnte jedoch über SPR gezeigt werden. rnDie Synthese eines fluoreszenz-markierten (FITC) Valinomycins ergab zwar auch keinen transportfähigen Ionencarrier, aber mit diesem Derivat konnte der Diffusionskoeffizient von Valinomycin in sBLMs mit Hilfe von Fluorescence Recovery after photobleaching (FRAP) bestimmt werden.rn

Biomimetic bilayer membranes made from polymers and lipids

Amphiphile Blockcopolymere sind in der Lage in Wasser Morphologien auszubilden, die analog sind zur hydrophil-hydrophob-hydrophil-Struktur von natürlichen Lipiddoppelschichten. In dieser Arbeit wird zum ersten Mal die Präparation und Charakterisierung von oberflächengestützten Polymerdoppelschichten aus Polybutadien-b-Polyethylenoxid (PB-PEO) beschrieben. Für die Herstellung dieser Strukturen wurden zwei unterschiedliche Präparationsstrategien verfolgt. Der erste Weg besteht aus einer zweistufigen Methode, bei der im ersten Schritt organisierte Monoschichten mittels Langmuir-Blodgett-Transfer auf Gold übertragen und kovalent angebunden werden. Im zweiten Schritt werden hydrophobe Wechselwirkungen ausgenutzt, um über Langmuir-Schaefer-Transfer eine weitere Schicht aufzubringen. Somit wurden homogene Architekturen erzeugt, die oberflächengestützten Lipiddoppelschichten gleichen. Als alternativer, einstufiger Ansatz zur Herstellung von Polymerdoppelschichten wurde das Spreiten von Polymervesikeln auf Gold verfolgt. Auch hierdurch ließen sich Doppelschichtstrukturen mit einer vollständigen Oberflächenbedeckung erzeugen. Die hergestellten Polymerdoppelschichten besitzen eine Dicke von 11-14 nm, die von der Präparationsmethode abhängt. Die Polymerstrukturen weisen bei Trocknung für 1.5 h eine Stabilität gegenüber Luft auf. Bei längeren Trocknungszeiten von ca. 12 h kommt es zu einer Reorganisation der Oberfläche. Dies deutet darauf hin, dass Wasser dazu notwendig ist die Strukturen auf lange Sicht zu stabilisieren. Um die Biokompatibilität der Polymerschichten nachzuweisen, wurden die Wechselwirkungen mit dem membranaktiven Peptid Polymyxin B und dem Transmembranprotein α-Haemolysin gezeigt. Mobilität ist ein wichtiger Faktor für die korrekte Funktion vieler Transmembranproteine. Um die laterale Diffusionsdynamik innerhalb der künstlichen Strukturen zu untersuchen, wurde die Mobilität eines integralen Modellpeptids und von fluoreszierenden Membransonden gemessen. Es konnte mit einzelmolekülempfindlichen Techniken gezeigt werden, dass das α-helikale Peptid und die kleinen Fluoreszenzfarbstoffe frei im hydrophoben Kern der Polymerdoppelschicht diffundieren können. Die Diffusion von beiden Spezies scheint stark von der Fluidität der Polymermatrix beeinflusst zu sein. Ein weiterer Teil dieser Arbeit widmet sich der Entwicklung eines angemessenen, lipidbasierten Referenzsystems für zukünftige Proteinuntersuchungen. Hierzu wurde eine neue Methode zu Herstellung von peptidgestützten Lipiddoppelschichtmembranen entwickelt. Dies wurde durch kovalente Befestigung eines Thiopeptids an einen Goldfilm und darauffolgende Anbindung eines Lipids erreicht. Zur Ausbildung der Lipiddoppelschicht auf dem Lipopeptidunterbau wurder der Rapid Solvent Exchange verwendet. Die Ausbildung der Lipiddoppelschicht wurde sowohl auf microskopischer als auch auf makroskopischer Ebene nachgewiesen. Im letzten Schritt wurde die Anwendbarkeit des Modelsystems für elektrochemische Messungen durch den funktionalen Einbau des Ionentransporters Valinomycin unter Beweis gestellt.

DNA-Polymer-Hybride als molekulare Bausteine

Die DNA hat sich durch die herausstechende Eigenschaft zur Selbstorganisation in den Naturwissenschaften zu einem beliebten Werkzeug entwickelt. In dieser Arbeit wurde die Oligonukleotidselbsterkennung zum Aufbau komplexer Multiblockcopolymere genutzt. Dabei dienten komplementäre einzelsträngige Oligonukleotidsequenzen (ssDNA) als adressierbare Verbindungsstücke zwischen synthetischen Blöcken. Als Bausteine wurden asymmetrische Dreiblockcopolymere der Form DNA1-Polymer-DNA2 aus einer flexiblen Polymereinheit (PEO bzw. PPO) die an beiden Enden mit unterschiedlichen Oligonukleotidsequenzen „funktionalisiert“ ist, verwendet. Diese Bausteine konnten durch die Kombination von Festphasensynthese der Oligonukleotide und Blockkopplung dargestellt werden. Die Oligonukleotidsequenzen wurden so gewählt, dass deren Hybridisierung zu einer bei Raumtemperatur stabilen Verbindung führt. Durch die Verwendung dieser Bausteine erhält man ein modulares System, dass sich durch seine hohe Flexibilität auszeichnet. Aus den dargestellten Dreiblockcopolymeren konnten verschiedene alternierende Multiblockcopolymere aufgebaut werden, wobei die Anzahl der Blöcke (von 11 bis 15) und das PEO / PPO- Verhältnis variiert wurden. Derartige Strukturen sind auf der Grundlage chemischer Synthesen unerreichbar. Die Flexibilität dieses modularen Systems konnte gezeigt werden, indem einzelne Blockbausteine zur Strukturaufklärung einfach ausgetauscht oder weggelassen werden konnten. Durch geeignete Wahl der DNA-Sequenzen konnte zusätzlich das Polymerisationsverhalten dieser Bauelemente untersucht werden. Die Integration längerer kettensteifer DNA-Abschnitte in die Multiblockstrukturen erfolgte durch die Verwendung teilkomplementärer Oligonukleotide. Diese bieten den Vorteil, dass bis zu einer Größe von etwa 150 bp sowohl die Länge als auch die Sequenz der Doppelstrangabschnitte und sticky-ends frei variiert werden können. Die biosynthetischen Dreiblockcopolymere dienten hier als Linkermoleküle zwischen den einzelnen dsDNA-Blöcken. Nach diesem Konzept wurde ein Nonamer als Modellsystem eines mehrfach gebrochenen Stäbchens synthetisiert. Außerdem wurden mit Hilfe der Polymerase Kettenreaktion (PCR) semiflexible DNA Abschnitte erzeugt. Durch die Wahl des Synthesewegs konnte sowohl die Länge der semiflexiblen Einheit als auch die Länge und die Sequenz des sticky-ends variiert werden. Anhand dieser Modellverbindungen wurde dann das Hybridisierungsverhalten in Abhängigkeit der Linker- und Segmentlängen untersucht.

Das wasserlösliche Chlorophyll-Protein (WSCP): biochemische Charakterisierung und Untersuchungen zur biologischen Funktion

Das WSCP (water-soluble chlorophyll protein) der Brassicaceen ist das einzig bekannte Chlorophyll-bindende Protein, welches keine Carotinoide bindet. Es ist ein wasserlösliches, ca. 80 kDa großes Homotetramer mit 1-4 gebundenen Chlorophyllen. Das Protein ist äußerst stabil und vermag die gebundenen Chlorophylle vor Photooxidation zu schützen. Seine Funktion in der Pflanze ist bis heute ein Rätsel und sollte in dieser Arbeit zusammen mit seinen biochemischen Eigenschaften weiter aufgeklärt werden. Es wurden Versuche durchgeführt mit nativem und rekombinantem WSCP aus Blumenkohl (BoWSCP bzw. BoWSCPhis) und aus Arabidopsis thaliana (AtWSCP bzw. AtWSCPhis). Die Expressionsausbeute von BoWSCPhis konnte verbessert werden und zusätzlich wurde die Rekonstitutionsmethode für das rekombinante WSCP optimiert, sodass das pigmentierte Protein mit hoher Ausbeute und großer Reinheit gewonnen werden konnte. Zudem wurde ein neuer WSCP-Klon hergestellt, mBoWSCPhis, der in seiner Sequenz dem maturen nativen BoWSCP entspricht und weitaus weniger Aggregationsprobleme zeigte als BoWSCPhis. Weiterführende Versuche zur Stabilität und dem Oligomerisierungsgrad von WSCP haben die neue Erkenntnis erbracht, dass die Phytolschwänze der von WSCP gebundenen Chlorophylle zwar essentiell sind für die Stabilität von WSCP-Oligomeren, nicht aber für die Oligomerisierung selbst, wie es in der Literatur bislang postuliert wurde. Zusätzlich zu ihrer außerordentlichen Hitzestabilität erwiesen sich die Chl-WSCP-Komplexe als stabil in einem breiten pH-Spektrum. AtWSCPhis besaß eine vergleichbare Stabilität, und auch das Oligomerisierungsverhalten zeigte Ähnlichkeiten zu BoWSCPhis. Im Rahmen einer Forschungskooperation mit dem Institut für Optik und Atomare Physik der TU Berlin wurden zeitaufgelöste Absorptionsspektren sowie Tieftemperatur-Fluoreszenzspektren an Chl-WSCP-Komplexen gemessen. Die Ergebnisse zeigten deutlich, dass die WSCP-gebundenen Chlorophylle excitonisch gekoppelt sind und wiesen zudem auf unterschiedliche Chl-Bindungsmodi hin. Aufgrund seines einfachen Aufbaus und seines geringen Chlorophyllgehalts hat sich WSCP bei diesen Versuchen als sehr geeignetes Modellsystem erwiesen, um Messungen zur Chlorophyllbindung mit Vorhersagen aus theoretischen Modellen zu vergleichen. Bei den Experimenten zur biologischen Funktion wurden einerseits Arabidopsis thaliana WSCP-„knock-out“-Pflanzen unter verschiedenen Bedingungen charakterisiert, andererseits wurden Experimente mit rekombinantem WSCP durchgeführt, um eine mögliche Interaktion mit anderen Proteinen zu detektieren. Die vegetativen Stadien der Mutante zeigten keinen Phänotyp; das native Arabidopsis-WSCP konnte später bei der Wildtyp-Pflanze ausschließlich in jungen Schoten lokalisiert werden, was eine Erklärung hierfür lieferte. Rekombinantes WSCP konnte Chlorophylle aus nativem LHCII entfernen, eine Interaktion mit Chlorophyllase konnte jedoch nicht nachgewiesen werden; daher konnte auch die Hypothese, WSCP sei ein Chl-Carrier beim Chl-Abbau, nicht untermauert werden. Bei den durchgeführten Enzym-Assays wurde eine geringfügige Inhibition der Cysteinprotease Papain beobachtet, aber keine Inhibition der Serinprotease Trypsin, obwohl Blumenkohl-WSCP N-proximal das Motiv der Künitz-Proteaseinhibitoren besitzt. Die Frage nach der biologischen Funktion von WSCP bleibt also weiterhin offen.

Nanoscopic studies of conjugated polymer blends by (electric) scanning probe microscopy

Conjugated polymers and conjugated polymer blends have attracted great interest due to their potential applications in biosensors and organic electronics. The sub-100 nm morphology of these materials is known to heavily influence their electromechanical properties and the performance of devices they are part of. Electromechanical properties include charge injection, transport, recombination, and trapping, the phase behavior and the mechanical robustness of polymers and blends. Electrical scanning probe microscopy techniques are ideal tools to measure simultaneously electric (conductivity and surface potential) and dielectric (dielectric constant) properties, surface morphology, and mechanical properties of thin films of conjugated polymers and their blends.rnIn this thesis, I first present a combined topography, Kelvin probe force microscopy (KPFM), and scanning conductive torsion mode microscopy (SCTMM) study on a gold/polystyrene model system. This system is a mimic for conjugated polymer blends where conductive domains (gold nanoparticles) are embedded in a non-conductive matrix (polystyrene film), like for polypyrrole:polystyrene sulfonate (PPy:PSS), and poly(3,4-ethylenedioxythiophene):poly(styrenesulfonate) (PEDOT:PSS). I controlled the nanoscale morphology of the model by varying the distribution of gold nanoparticles in the polystyrene films. I studied the influence of different morphologies on the surface potential measured by KPFM and on the conductivity measured by SCTMM. By the knowledge I gained from analyzing the data of the model system I was able to predict the nanostructure of a homemade PPy:PSS blend.rnThe morphologic, electric, and dielectric properties of water based conjugated polymer blends, e.g. PPy:PSS or PEDOT:PSS, are known to be influenced by their water content. These properties also influence the macroscopic performance when the polymer blends are employed in a device. In the second part I therefore present an in situ humidity-dependence study on PPy:PSS films spin-coated and drop-coated on hydrophobic highly ordered pyrolytic graphite substrates by KPFM. I additionally used a particular KPFM mode that detects the second harmonic electrostatic force. With this, I obtained images of dielectric constants of samples. Upon increasing relative humidity, the surface morphology and composition of the films changed. I also observed that relative humidity affected thermally unannealed and annealed PPy:PSS films differently. rnThe conductivity of a conjugated polymer may change once it is embedded in a non-conductive matrix, like for PPy embedded in PSS. To measure the conductivity of single conjugated polymer particles, in the third part, I present a direct method based on microscopic four-point probes. I started with metal core-shell and metal bulk particles as models, and measured their conductivities. The study could be extended to measure conductivity of single PPy particles (core-shell and bulk) with a diameter of a few micrometers.

Electrical scanning probe microscopy on organic optoelectronic structures

In the field of organic optoelectronics, the nanoscale structure of the materials has huge im-pact on the device performance. Here, scanning force microscopy (SFM) techniques become increasingly important. In addition to topographic information, various surface properties can be recorded on a nanometer length scale, such as electrical conductivity (conductive scanning force microscopy, C-SFM) and surface potential (Kelvin probe force microscopy, KPFM).rnrnIn the context of this work, the electrical SFM modes were applied to study the interplay be-tween morphology and electrical properties in hybrid optoelectronic structures, developed in the group of Prof. J. Gutmann (MPI-P Mainz). In particular, I investigated the working prin-ciple of a novel integrated electron blocking layer system. A structure of electrically conduct-ing pathways along crystalline TiO2 particles in an insulating matrix of a polymer derived ceramic was found and insulating defect structures could be identified. In order to get insights into the internal structure of a device I investigated a working hybrid solar cell by preparing a cross cut with focused ion beam polishing. With C-SFM, the functional layers could be identified and the charge transport properties of the novel active layer composite material could be studied. rnrnIn C-SFM, soft surfaces can be permanently damaged by (i) tip induced forces, (ii) high elec-tric fields and (iii) high current densities close to the SFM-tip. Thus, an alternative operation based on torsion mode topography imaging in combination with current mapping was intro-duced. In torsion mode, the SFM-tip vibrates laterally and in close proximity to the sample surface. Thus, an electrical contact between tip and sample can be established. In a series of reference experiments on standard surfaces, the working mechanism of scanning conductive torsion mode microscopy (SCTMM) was investigated. Moreover, I studied samples covered with free standing semiconducting polymer nano-pillars that were developed in the group of Dr. P. Theato (University Mainz). The application of SCTMM allowed non-destructive imag-ing of the flexible surface at high resolution while measuring the conductance on individual pillarsrnrnIn order to study light induced electrical effects on the level of single nanostructures, a new SFM setup was built. It is equipped with a laser sample illumination and placed in inert at-mosphere. With this photoelectric SFM, I investigated the light induced response in function-alized nanorods that were developed in the group of Prof. R. Zentel (University Mainz). A block-copolymer containing an anchor block and dye moiety and a semiconducting conju-gated polymer moiety was synthesized and covalently bound to ZnO nanorods. This system forms an electron donor/acceptor interface and can thus be seen as a model system of a solar cell on the nanoscale. With a KPFM study on the illuminated samples, the light induced charge separation between the nanorod and the polymeric corona could not only be visualized, but also quantified.rnrnThe results demonstrate that electrical scanning force microscopy can study fundamental processes in nanostructures and give invaluable feedback to the synthetic chemists for the optimization of functional nanomaterials.rn

Topologisch kontrollierte Interpolyelektrolytkomplexe aus kettensteifen Polyelektrolyten

Interpolyelektrolytkomplexe bilden sich spontan bei Mischung von Lösungen entgegengesetzt geladener Polyelektrolyte. Dabei sind die Haupttriebkräfte der Entropiegewinn durch die Freisetzung von niedermolekularen Gegenionen sowie die elektrostatischen Wechselwirkungen. In der letzten Zeit sind sie aufgrund ihrer zahlreichen biologischen und technischen Anwendungen in den Fokus des wissenschaftlichen Interesses gerückt. Vor allem die Anwendung von Komplexen aus DNA und kationischen Polyelektrolyten in der nonviralen Gentherapie wird vielfältig diskutiert. rnIn dieser Arbeit wird eine Polystyrolsulfonat-Bürste mit einer Pfropfdichte von 100 % mit einem kationischen Tensid komplexiert und der Komplex in verschiedenen organischen Lösungsmitteln charakterisiert. Dabei zeigt sich eine signifikante Abhängigkeit des Lösungsverhaltens von der Art und der Konzentration zugesetzter Salze. Dieser Polyelektrolyt-Tensid-Komplex wird anschließend als vereinfachtes Modellsystem für die Komplexierung von DNA verwendet. Als kationische Komponente dient zunächst ein kommerzielles PAMAM-Dendrimer der 5. Generation. Dabei steht die Erhaltung der zylindrischen Topologie der anionischen Polyelektrolytbürste in den gebildeten Komplexen im Vordergrund. Durch Variation des Lösungsmittels und des Protonierungsgleichgewichts werden die experimentellen Bedingungen eingegrenzt, bei denen eine solche topologische Kontrolle möglich ist. Es zeigt sich, dass durch die Verwendung von aprotischen organischen Lösungsmitteln gute Erfolge erzielt werden können. Des Weiteren wird das Komplexierungsverhalten stark durch den Zusatz einer Säure oder einer Base beeinflusst, sodass eine topologische Kontrolle mit einem großen Überschuss einer organischen Base auch in protischen Lösungsmitteln wie Wasser und Methanol möglich wird. Anschließend wird das gleiche Polyanion noch mit einer geschützten Polylysin-Bürste in DMF komplexiert, was zur Bildung von kinetisch kontrollierten Aggregaten führt. Die Bildung dieser Aggregate kann durch den Zusatz eines großen Überschusses an Base verhindert werden und es werden zylindrische Komplexe erhalten, die nur aus einer Polylysin-Bürste bestehen. rn

Phasenverhalten, Kristallisation und Morphologie ladungsstabilisierter kolloidaler Mischungen

Die vorliegende Arbeit möchte die Anwendbarkeit ladungsstabilisierter kolloidaler Systeme als Modellsysteme für fundamentale Fragen der Festkörperphysik und Thermodynamik auf binäre Mischungen erweitern. In diesem Kontext untersucht sie das Phasenverhalten und mit ihm im Zusammenhang stehende Eigenschaften von binären Mischungen ladungsstabilisierter, sphärischer kolloidaler Partikel in wässriger Suspension. Da das Verhalten hartkugelähnlicher Systeme durch hohe Fremdionenkonzentrationen bereits gut bekannt ist, konzentriert sich diese Arbeit auf sehr langreichweitig repulsive Systeme unter deionisierten Bedingungen. Neben etablierten Methoden der Mikroskopie und statischer Lichtstreuung zur Phasendiagrammsbestimmung wird auch die Beobachtung der zeitabhängigen Entwicklung des Schermoduls verwendet, um eine langsame Erstarrungskinetik zu studieren. Es werden insbesondere Mischungen aus Komponenten unterschiedlicher Größe und Ladung der Größenverhältnisse 0,9, 0,82, 0,57, 0,39 und 0,37 untersucht. Diese zeigen in dieser Reihenfolge Phasendiagramme mit spindelförmigem fluid/kristallinen Koexistenzbereich wie auch azeotrope und eutektische Phasendiagramme. Die Strukturuntersuchungen aus der statischen Lichtstreuung stehen in praktisch allen Fällen im Einklang mit ungeordneten bcc- Substitutionskristallen, was über Modelle zu Schermodulmessungen bestätigt wird. Für das spindelförmige System wird ein überraschend weiter Koexistenzbereich beobachtet, wie er nicht von der Theorie erwartet wird. Die Lage, aber nicht die Form des Solidus stimmt quantitativ mit Simulationsvorhersagen zu einkomponentigen Systemen überein. Für das eutektische System bei einem Radienverhältnis von 0,57 wird der Einfluss der Schwerkraft auf das Phasenverhalten und die Erstarrungskinetik untersucht. Die der Kristallisation der kleineren Majoritätskomponente vorgelagerte gravitativ unterstützte Entmischung begünstigt hier die Verfestigung. Beobachtet werden Morphologien, die aus anderen Systemen bekannt sind (Facetten, Dendriten), wie auch erstmals eine kollumnare eutektische Morphologie. Aus den Ergebnissen wird der erste umfassende Überblick über das Phasenverhalten deionisierter Mischungen ladungsstabilisierter, sphärischer Partikel erstellt, die eine Diskussion der Daten anderer Autoren und unserer Gruppe über fluid-fluider Phasenseparation und einem System mit oberem azeotropen Punkt mit einschließt. Die meisten metallspezifischen Phasendiagrammtypen können mit ladungsstabilisierten kolloidalen Partikeln reproduziert werden. Die langreichweitig wechselwirkenden Partikel zeigt eine wesentlich verbesserte substitutionelle Mischbarkeit im Vergleich mit Hartkugel- und Metallsystemen. Das Größenverhältnis der sphärischen Partikel nimmt dabei die bestimmende Rolle für den Phasendiagrammtyp ein.

Einzelmolekülspektroskopie an einer homologen Reihe von Rylendiimiden und an einem bichromophoren Modellsystem für elektronischen Energietransfer

In dieser Arbeit wurden Untersuchungen zur Fluoreszenzdynamik und zum Mechanismus des Photobleichens einzelner Farbstoffmoleküle einer homologen Reihe von Rylentetracarbonsäurediimiden durchgeführt. Mit der Erweiterung des elektronischen π-Systems verringert sich die HOMO/LUMO-Energiedifferenz, so dass strahlungslose Relaxationsprozesse gemäß des Energielückengesetzes zunehmen. Die konfokale Einzelmolekülspektroskopie in Kombination mit zeitkorrelierter Einzelphotonenzählung ermöglicht es, Fluktuationen der inneren Konversionsrate zu detektieren. Der limitierende Faktor jedes Einzelmolekülexperiments ist die Photostabilität der Moleküle. Für die homologe Reihe konnten mindestens zwei Photobleichmechanismen identifiziert werden. Wenn Singulett-Sauerstoff durch Selbstsensibilisierung erzeugt werden kann, ist unter Luft die Photooxidation der wahrscheinlichste Mechanismus. Unter Ausschluss von Luftsauerstoff spielt die Bildung langlebiger Dunkelzustände eine entscheidende Rolle, die bevorzugt über höher angeregte Triplett- und Singulett-Zustände abläuft. Es wird angenommen, dass es sich hierbei um einen reversiblen Ionisierungsprozess handelt, bei dem das Radikal-Kation der Rylendiimide gebildet wird. Es konnte gezeigt werden, dass durch eine geeignete Wahl der Anregungsbedingungen die Dunkelzustandspopulierung verhindert und zugleich die Photostabilität der Fluorophore deutlich erhöht wird. Durch die Verknüpfung der beiden niedrigsten Homologen erhält man ein Donor-Akzeptor-Modellsystem, bei dem die Anregungsenergie mit hoher Effizienz vom Donor- auf den Akzeptor-Chromophor übertragen wird. In der Fluoreszenz einzelner Bichromophore wurden bei selektiver Anregung des Donors kollektive Auszeiten beobachtet, die durch effiziente Singulett-Triplett-Annihilation verursacht werden.

Synthesis and characterization of temperature- and light-responsive polymers and block copolymers

In summary, thermoresponsive polyacrylamides with various amounts of different photoswitchable side groups, i. e. azobenzene, salicylideneaniline and fulgimide were successfully prepared. As such, in a first step three different chromophores with an amine functionality were synthesized. The synthesis of the stimuli-responsive materials was based on the RAFT polymerization of activated ester acrylates followed by a polymer analogous reaction with different amines. The procedure has been designed to allow the synthesis of well-defined materials with functional groups. All copolymers prepared in this way showed a LCST in aqueous solution. The LCST was in general decreased by increasing the amount of hydrophobic dye incorporated into the thermoresponsive polymer. However, in the case of the fulgimide, the LCST was hardly affected by the chromophore. For azobenzene containing PNIPAM polymers and analogues, higher LCST values were measured after irradiation of the polymer sample solutions with UV-light (Delta LCSTmax = 7.3°C). A reversible light-induced solubility change within a certain temperature range was possible. In contrast to this, irradiated samples of salicylideneaniline containing thermoresponsive copolymers showed an irreversible increase in the LCST (Delta LCSTmax = 13.0°C). Fulgimide chromophores did not influence the LCST of PNIPAM based copolymers after UV-light exposure.rnSimilar to the thermoresponsive polyacrylamides with azobenzene side groups, poly(oligo(ethylene glycol) methyl ether methacrylate) [P(OEGMA)] polymers with azobenzene end groups showed a LCST shift upon UV-irradiation. These polymers were synthesized by RAFT polymerization using a functional chain transfer agent (CTA). For this, PFP-CTA was used as a RAFT-agent for end group functionalization of (thermoresponsive) polymers. In contrast to the statistically arranged copolymers with azobenzene side groups, P(OEGMA) polymers with terminal azobenzene showed a linear increase of the LCST shifts with increasing amount of chromophore (Delta LCSTmax = 4.3°C). Noteworthy, the chemical nature of the end group exhibited a strong influence on the LCST in the case of short thermoresponsive P(OEGMA) polymers.rnThe investigation on temperature- and lightresponsive polymers was transferred onto block copolymers capable to self-assemble into polymeric micelles. Therefore, PEO-b-PNIPAM block copolymers with azobenzene moieties were synthesized successfully. These polymers showed a “smart” behavior in aqueous solution, as the reversible formation and disruption of the micelles could either be controlled by temperature or using light as a stimulus. The usefulness of these materials was demonstrated by encapsulation of a hydrophobic dye in the core of the micelle. Such materials might have a great potential as a model system for several technical or biological applications.rnFinally, double thermoresponsive block copolymers forming micellar structures in a certain temperature range with functional end groups could successfully be synthesized. These “smart materials” based on POEGMA-b-PNIPMAM have been demonstrated to be very promising for a temperature selective immobilization on a protein surface. This might be a suitable concept for further biological applications.rnConcluding, different thermoresponsive copolymers and block copolymers with lightresponsive moieties arranged along the backbone or located at the chain ends were successfully prepared and investigated. By controlling the nature of functional groups and their respective incorporation ratios, the LCST could be dialed in precisely. Further, the LCST of the polymers could be triggered by light. A light-controlled disruption of micellar structures could be shown for functional block copolymers. The importance of end groups of thermoresponsive polymers was demonstrated by a temperature-controlled protein-polymer binding of a terminal biotin-functionalized double thermoresponsive polymer. The synthetic approaches and the material properties presented here should be promising for further research and applications beyond this dissertation.rn

Antigen-dependent induction of a CD40 signal in peripheral B cells

Monoclonal antibodies have emerged as one of the most promising therapeutics in oncology over the last decades. The generation of fully human tumorantigen-specific antibodies suitable for anti-tumor therapy is laborious and difficult to achieve. Autoreactive B cells expressing those antibodies are detectable in cancer patients and represent a suitable source for human antibodies. However, the isolation and cultivation of this cell type is challenging. A novel method was established to identify antigen-specific B cells. The method is based on the conversion of the antigen independent CD40 signal into an antigen-specific one. For that, the artificial fusion proteins ABCos1 and ABCos2 (Antigen-specific B cell co-stimulator) were generated, which consist of an extracellular association-domain derived from the constant region of the human immunoglobulin (Ig) G1, a transmembrane fragment and an intracellular signal transducer domain derived of the cytoplasmic domain of the human CD40 receptor. By the association with endogenous Ig molecules the heterodimeric complex allows the antigen-specific stimulation of both the BCR and CD40. In this work the ability of the ABCos constructs to associate with endogenous IgG molecules was shown. Moreover, crosslinking of ABCos stimulates the activation of NF-κB in HEK293-lucNifty and induces proliferation in B cells. The stimulation of ABCos in transfected B cells results in an activation pattern different from that induced by the conventional CD40 signal. ABCos activated B cells show a mainly IgG isotype specific activation of memory B cells and are characterized by high proliferation and the differentiation into plasma cells. To validate the approach a model system was conducted: B cells were transfected with IVT-RNA encoding for anti-Plac1 B cell receptor (antigen-specific BCR), ABCos or both. The stimulation with the BCR specific Plac1 peptide induces proliferation only in the cotransfected B cell population. Moreover, we tested the method in human IgG+ memory B cells from CMV infected blood donors, in which the stimulation of ABCos transfected B cells with a CMV peptide induces antigen-specific expansion. These findings show that challenging ABCos transfected B cells with a specific antigen results in the activation and expansion of antigen-specific B cells and not only allows the identification but also cultivation of these B cells. The described method will help to identify antigen-specific B cells and can be used to characterize (tumor) autoantigen-specific B cells and allows the generation of fully human antibodies that can be used as diagnostic tool as well as in cancer therapy.

Etablierung eines In-vivo-Modells zur Untersuchung der Rolle epidermaler Langerhanszellen bei der Entstehung der Transplantat-gegen-Wirt-Erkrankung nach allogener Blutstammzelltransplantation

Dendritische Zellen der Haut, wie z.B. die Langerhanszellen (LC) der Epidermis, sind potente antigenpräsentierende Zellen (APC). Nach allogener Blutstammzelltransplantation (engl.: hematopoietic stemm cell transplantation, HSCT) persistieren Empfänger-APC und können Spender-T-Zellen aktivieren. Somit spielen dendritische Zellen eine kritische Rolle bei der Initiierung von akuter Transplantat-Gegen-Wirt-Reaktion (engl.: graft-versus-host-disease, GvHD).rnIn der vorliegenden Arbeit wurde ein Modellsystem entwickelt, welches humane Haut in einem Xenotransplantationsmodell nutzt, um die Wechselwirkung dieser gewebsständigen APC mit alloreaktiven T-Zellen zu untersuchen. Dafür wurden humane Resthautpräparate von subkutanem Gewebe befreit und intraskaptulär auf immunsupprimierte NOD/LtSz-scid IL2R#-null Mäuse (NSG) transplantiert. Diesen Tieren fehlen funktionale T-, B- und NK-Zellen, und sie tolerieren somit ein xenogenes Transplantat. Im Vergleich zu anderen immundefizienten Stämmen, haben sie eine erhöhte Lebenserwartung und es ist zudem möglich humane Hämatopoese durch Stammzellgabe zu etablieren.rnPublizierte Methoden der Hauttransplantation wurden für diese Arbeit optimiert und weiterentwickelt. So konnte die Erfolgsrate von 44% auf bis zu 95% gesteigert werden. Erste Untersuchungen fokussierten den Einfluss der Wundheilung auf die Verteilung dermaler Zellpopulationen, wie z.B. CD11c positive APC, und die Population der LC in der Epidermis. Während der ersten Wochen der Wundheilung war ein vorübergehendes Verschwinden der LC aus der Epidermis zu beobachten. Im Gegensatz dazu waren CD11c positive dermale Zellen permanent detektierbar. Die zu späteren Zeitpunkten festgestellte Repopulation der Epidermis mit LC unterstützt die Hypothese einer lokalen Vorläuferzelle. Die vorgelegten Daten und die lokale proliferative Aktivität dieser Zellen unterstreichen ihre Unabhängigkeit vom peripheren Blut. Versuche, eine Depletion der LC mittels UVC-Bestrahlung zu erreichen, gelangen nicht. Auch dies spricht für das Vorhandensein eines lokalen Vorläufers.rnZur Induktion von GvHD in der transplantierten Haut wurden in vitro DC des Hautspenders generiert und damit HLA-disparate T-Zellen stimuliert. Auf diese Weise sollte eine maximale Alloreaktivität gegen das Hauttransplantat generiert werden. In allen vorgestellten Systemen ließ sich nach Infusion der T-Lymphozyten in transplantierte Tiere, eine T-Zellinduzierte inflammatorische Reaktion auslösen. Optisch war eine deutliche Rötung des Transplantats feststellbar. Diese war jedoch nur in den Proben besonders deutlich, welche T-Zellen mit vorheriger in vitro Stimulation durch DC des Hautspenders erhalten hatten. Histologisch konnten Anzeichen einer Entzündung nachgewiesen werden. Neben Akanthose und Hyperparakeratose, waren deutliche T-Zellinfiltrate detektierbar. Auch Spaltbildung und Ablösung der Epidermis, sowie vereinzelte Apoptosen der epidermalen Zellen wiesen auf eine GvHD artige Entzündung hin.rnEine weitere Beobachtung nach T-Zellgabe, war die Depletion der LC aus der Epidermis. Auch konnte durch spätere T-Zellgaben keine weitere Hautrötung ausgelöst werden. Dies belegt die Funktion der LC als primäre Zielzelle der alloreaktiven T-Zellen. Unterstrichen wird dies durch Verwendung einer LC defizienten Haut, welche keine Hautrötung oder Anzeichen einer Entzündung entwickelte.rnZusammenfassend wurde für diese Arbeit ein Modellsystem entwickelt, welches es erlaubt Untersuchungen entzündlicher Hautkrankheiten unter Berücksichtigung hautständiger APC durchzuführen. Dabei kann dieses Modell in Zukunft für die Untersuchung von APC modulierenden Agenzien genutzt werden, da präklinische Modelle für spezies-spezifische Therapien bislang fehlten. Das Entstehen einer Entzündung könnte so verhindert oder eine Behandlung ermöglicht werden.

Cellular localization and mechanism of amyloid precursor protein (APP) homodimer formation in an oxidizing environment

The amyloid precursor protein (APP) is a type I transmembrane glycoprotein, which resembles a cell surface receptor, comprising a large ectodomain, a single spanning transmembrane part and a short C-terminal, cytoplasmic domain. It belongs to a conserved gene family, with over 17 members, including also the two mammalian APP homologues proteins APLP1 and APLP2 („amyloid precursor like proteins“). APP is encoded by 19 exons, of which exons 7, 8, and 15 can be alternatively spliced to produce three major protein isoforms APP770, APP751 and APP695, reflecting the number of amino acids. The neuronal APP695 is the only isoform that lacks a Kunitz Protease Inhibitor (KPI) domain in its extracellular portion whereas the two larger, peripheral APP isoforms, contain the 57-amino-acid KPI insert. rnRecently, research effort has suggested that APP metabolism and function is thought to be influenced by homodimerization and that the oligomerization state of APP could also play a role in the pathology of Alzheimer's disease (AD), by regulating its processing and amyloid beta production. Several independent studies have shown that APP can form homodimers within the cell, driven by motifs present in the extracellular domain, as well as in the juxtamembrane (JM) and transmembrane (TM) regions of the molecule, whereby the exact molecular mechanism and the origin of dimer formation remains elusive. Therefore, we focused in our study on the actual subcellular origin of APP homodimerization within the cell, an underlying mechanism, and a possible impact on dimerization properties of its homologue APLP1. Furthermore, we analyzed homodimerization of various APP isoforms, in particular APP695, APP751 and APP770, which differ in the presence of a Kunitz-type protease inhibitor domain (KPI) in the extracellular region. In order to assess the cellular origin of dimerization under different cellular conditions, we established a mammalian cell culture model-system in CHO-K1 (chinese hamster ovary) cells, stably overexpressing human APP, harboring dilysine based organelle sorting motifs at the very C-terminus [KKAA-Endoplasmic Reticulum (ER); KKFF-Golgi]. In this study we show that APP exists as disulfide-bound, SDS-stable dimers, when it was retained in the ER, unlike when it progressed further to the cis-Golgi, due to the KKFF ER exit determinant. These stable APP complexes were isolated from cells, and analyzed by SDS–polyacrylamide gel electrophoresis under non-reducing conditions, whereas strong denaturing and reducing conditions completely converted those dimers to monomers. Our findings suggested that APP homodimer formation starts early in the secretory pathway and that the unique oxidizing environment of the ER likely promotes intermolecular disulfide bond formation between APP molecules. We particularly visualized APP dimerization employing a variety of biochemical experiments and investigated the origin of its generation by using a Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) approach with split GFP-APP chimeras. Moreover, using N-terminal deletion constructs, we demonstrate that intermolecular disulfide linkage between cysteine residues, exclusively located in the extracellular E1 domain, represents another mechanism of how an APP sub-fraction can dimerize within the cell. Additionally, mutational studies revealed that cysteines at positions 98 and 105, embedded in the conserved loop region within the E1 domain, are critical for interchain disulfide bond formation. Using a pharmacological treatment approach, we show that once generated in the oxidative environment of the ER, APP dimers remain stably associated during transport, reaching the plasma membrane. In addition, we demonstrate that APP isoforms, encompassing the KPI domain, exhibit a strongly reduced ability to form cis-directed dimers in the ER, whereas trans-directed cell aggregation of Drosophila Schneider (S2)-cells was isoform independent, mediating cell-cell contacts. Thus, suggesting that steric properties of KPI-APP might be the cause for weaker cis-interaction in the ER, compared to APP695. Finally, we provide evidence that APP/APLP1 heterointeractions are likewise initiated in the ER, suggesting a similar mechanism for heterodimerization. Therefore, dynamic alterations of APP between monomeric, homodimeric, and possibly heterodimeric status could at least partially explain some of the variety in the physiological functions of APP.rn