植物血红蛋白基因及植物凝集素基因转化水稻的研究

植物血红蛋白在共生固氮根瘤中主要是对固氮酶进行嫌氧保护，确保固氮酶活性，在植物根中协助氧的运输或作为感觉氧压的信号分子．豆科植物凝集素功能之一是对相应专一的根瘤菌有识别作用，并有利于根瘤菌的聚集和侵染。本论文将非豆科结瘤植物Parasponia andersonii血红蛋白基因及豌豆凝集索基因转入水稻，目的是此二基因表达后，豌豆凝集素可聚集、识别豌豆根瘤菌，并有助于它们的侵染，血红蛋白则可对根瘤菌固氮酶进行嫌氧保护，保障其发挥固氮作用，从而为实现水稻结瘤和固氮打下初步基础。 本论文将带有Parasponia血红蛋白基因的pL305质粒，带有潮霉素磷酸转移酶基因及Parasponia血红蛋白基因的农杆菌双元载体质粒pLX412-Hb用花粉管通道法转化水稻l用pLX412-Hb和带有Bar基因、豌豆凝集素基因、Parasponia血红蛋白基因的质粒pLHB用基因枪法转化水稻幼胚及愈伤组织，带有pLX412-Hb的Agrobactmum tumefaciens LBA4404转化烟草，得到如下结果： 1．用pL305质粒花粉管通道法转化水稻，运作1512朵花，得到707粒种子．将230粒种子萌发，发芽220粒;白化苗4株，成苗206株;计发芽率96%，白化苗率1.7%，成苗率90%。取120株提取DNA以Parasponia血红蛋白基因为探针进行点杂交，有6株为阳性结果，阳性率5%．再取4株DNA点杂交阳性植株DNA，以Parasponia血红蛋白基因为探针进行Southem杂交，有3株有阳性结果，阳性率为75%，照此推算转化植株约占总植株的4%．目前，这些转基因植株已开花结实。 2．用pLX412-Hb质粒花粉管通道法转化水稻，运作743朵花，得到340粒种子。将120粒种子萌发，发芽117粒，白化苗3株，成苗111株;计发芽率97. 5%，白化苗率2. 5%，成苗率92. 5%．取30株提取DNA以Parasponia血红蛋白基因为探针进行点杂交，有4株为阳性结果，阳性率13%。再取4株DNA点杂交呈阳性的植株DNA，以Parasponia血红蛋白基因为探针进行Southern杂交，有2株有阳性结果，阳性率为50%，照此推算转化植株约占总植株的7%。目前部分转基因植株巳开花结实． 3.用pLX412 - Hb质粒基因枪法转化水稻幼胚及愈伤组织，抗性筛选得到15株再生植株，以Parasponia血红蛋白基因为探针进行点杂交，有14株为阳性结果，阳性率93%．取7株DNA点杂交呈阳性的植株DNA，以Parasponia血红蛋白基因为探针进行Southern杂交，都为阳性结果，阳性率为100%，照此推算转化植株约占总植株的93%．目前，部分转基因植株已开花结实． 4．用pLX412 -Hb质粒通过Agrobacterrum tumeFaciens LBA4404转化烟草，抗性筛选得到的再生植株以Parasponia血红蛋白基因为探针进行Southern杂交，结果为阳性． 5．用pLHB基因枪法转化的愈伤组织，抗性筛选得到已分化出绿芽点的愈伤组织，以Parasponia血红蛋白基因为探针或以豌豆凝集素基因为探针进行Southern杂交，杂交结果均为阳性． 6．最近国外巳发现大麦有血红蛋白基因．本论文以大麦血红蛋白cDNA为探针对未转基因的水稻进行Southern杂交，结果有阳性带。说明水稻有与大麦血红蛋白基因高度同源序列。以Parasponia血红蛋白基因为探针时杂交结果为阴性，说明水稻血红蛋白基因与Parasponiaa血红蛋白基因核苷酸序列相差较大． 7．提取Southern杂交证明有Parasponia血红蛋白基因整合的水稻根及叶总RNA，以Parasponia血红蛋白基因cDNA为探针进行RNA点杂交，结果根总RNA为阳性，叶总RNA为阴性。初步证明Parasponia血红蛋白基因在水稻根中表达。 8．提取未转基因的水稻根及叶RNA，以大麦血红蛋白基因cDNA为探针进行RNA点杂交，结果：根总RNA为阳性结果，叶总RNA为阴性结果．初步证明水稻血红蛋白基因在水稻根中表达。 总之，本论文证明已将Parasponia血红蛋白基因整合进水稻植株染色体，将豌豆凝集素基因、Parasponia血红蛋白基因整合进水稻愈伤组织染色体，初步证明水稻有血红蛋白基因，内外源血红蛋白基因都有组织特异性表达，从而为本研究的战略设想奠定初步基础。

棉花抗虫基因工程研究

本文通过根农杆菌（Agrobacterium tumfaciens）介导法分别将Signal和KDEL修饰的豇豆胰蛋白酶抑制剂（Cowpea trypsin inhibitor, CpTI）基因、豌豆外源凝集素（Pea lectin, P-Lec）和大豆Kunitz型胰蛋白酶抑制剂（Soybean Kunitz typsin inhibitor, SKTI）双价抗虫基因、雪花莲外源凝集素（Galanthus nivals agglutinin, GNA）基因以及高效复合启动子OM控制的苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis, B.t.）杀虫毒蛋白基因导入了陆地棉（Gossypium hirsutum L.）栽培品种新陆早1号、新陆中2号、晋棉7号、冀合321、辽9和晋棉12号，并获得了大批转基因再生植株。 实验中对影响棉花转化和再生的一些条件进行了研究，从根农杆菌培养、棉花无菌苗的制备、转化操作和共培养等方面对转化条件进行了探讨;从激素配化、植物表达载体、外植体类型、基因型等方面对抗性愈伤组织的诱导进行了摸索;从激素、从碳源、培养容器、pH值、抗褐化剂及固化剂的选择等方面对影响植株再生的条件进行了优化。 本文开创性地采用嫁接代替移栽，从而极大地提高了转化植株定植成活率，缩短了缓苗时间并增加了转化植株当代的繁殖系数。 在建立了一套较为高效的陆地棉转化及再生系统基础上，本文还进行了其它转化方式和转化体系的初步探讨。利用棉花幼嫩种子无菌苗下胚轴作为外植体，通过改变愈伤组织诱导培养基配方面提高胚性愈伤组织的诱导频率，进而得到更多的体细胞胚状和再生植株，缩短再生周期;尝试用胚性愈伤组织作为外植体的根农杆菌介导法转化，确定了一些与转化有关的条件;建立了一套棉花茎尖培养程序，为运用基因枪法轰击棉花茎尖分生组织或用根农杆菌直接转化茎尖分生组织，以克服根农杆菌转化棉花时体胚发生的基因型局限开辟了一条新途径。 本文还建立了一种快速鉴定转化植株后代的方法。这一简便方法还有助于进行转基因棉纯合系的筛选以及外源基因的遗传稳定性研究。 转基因植株经Npt-II ELISA、PCR、PCR Southern 检测证明外源抗虫基因CpTI、SKTI、P-lec、GNA以及B.t.基因已存在于转化植株基因组内。修饰的CpTI转基因植株抗棉铃虫（Heliothis armigera Hubner）试验结果表明，其杀虫效果显著优于前期未修饰的CpTI转化植株。P－lec和SKTI双价转基因植株抗棉铃虫试验结果表明，转基因植株对棉铃虫幼虫具有较强的杀虫活力。 目前，已获得转以上抗虫基因棉花T1代植株。为今后进一步将植物基因工程技术应用于棉花遗传改良打下了基础。

两个固氮相关的植物基因对烟草和水稻的转化及其表达

豆科植物凝集素基因和血红蛋白基因在对根瘤菌的识别作用和类菌体在低氧分压下的共生固氮中起重要作用。本文的目的是试图将这两个基因转移到非豆料植物烟草和水稻，使其能识别根瘤菌，探讨非豆科植物的共生和联合固氮的可能性。 构建了含有豌豆凝集素（P－Lec）基因、Parasponia andersonii血红蛋白基因、gus基因及植物选择标记潮霉素磷酸转移酶基因（hpt）的两个植物表达载体pCBHL和pCBHUL;同时，还构建了含有P－Lec基因、gus基因及植物选择标记PPT乙酰转移酶基因（bar）的植物表达载体pBBUL。在pCBHL中，CaMV35S启动子调控P－Lec基因的表达，而在pCBHUL和pBBUL中，该基因由玉米Ubiquitin 1启动子调控。 用农杆菌法将pCBHL导入烟草，得到53株再生植株，PCR检测表明转化频率为88％。用基因枪法分别将pCBHUL和pBBUL导入水稻幼胚或幼胚诱导的愈伤组织。转pCBHUL的材料共得到40株再生植株，经分子检测有18株分转基因植株，转化频率为0.9%。转pBBUL的幼胚愈伤组织经PPT筛选，只得到能分化出小芽的抗性愈伤组织。 PCR检测、Southern杂交表明P-Lec基因和Paraspoina血红蛋白基因都已经整合到转基因烟草及水稻的基因组中，转基因水稻植株中两个外源目的基因的拷贝数较高。Western杂交分析转基因植物中P-Lec基因的表达情况，结果表明该基因在转基因的烟草和水稻叶片中得到正确地表达。同时，GUS组织化学染色表明转基因烟草的嫩茎和幼根，转基因水稻的嫩叶和幼根中都有gus基因的表达。转基因烟草中外源基因的表达频率高于转基因水稻。T1代转基因烟草幼根的蛋白原位免疫杂交显示P-Lec正确定位于正在生长的幼根根毛的顶端，与对照豌豆中的P-Lec基因表达部位相一致。关于Parasponia血红蛋白基因，以前本实验室对转基因烟草和水稻的研究表明有转录水平的表达，国外实验室证实转基因烟草中有转译表达。 上述结果有可能为进一步研究转基因非豆科植物与根瘤菌的相互作用奠定一定的基础。

根瘤菌感染烟草、水稻及豌豆凝集素基因在烟草中的表达

该文用根据瘤菌合成血红素基因hemA，根瘤菌固氨氮酶调节基因nifA，固氮酶结构基因nifKDH，nifH的启动子与lacZ基因融合的质粒，通过三亲交配法将其思入豌豆根据瘤菌.接种烟草发根、烟草植株和水稻。结果表明β-半乳糖苷酶有不同强度的组织化学染色反应，hemA染色最强，其它次之。显微镜观察表明在烟草发根据的维管束中柱鞘细胞、水稻根皮层细胞内和细胞间隙有根瘤菌存在.从根中分离纯化细菌，LacZ染色，再回接豌豆结瘤和根瘤的LacZ染色，证明是LacZ标记基因的豌豆根据瘤菌。由此说明根瘤菌可以侵染非豆科植物烟草和水稻。除了对烟草、水稻根进行LacZ染色外，还对其茎、叶进行了染色，结果也有正反应现象，说明根瘤菌有可能由根向上部分移动。另一方面，说明根瘤蓖的nifA、nifKDH、 nifH的启动子在植物组织也可能起起动作用表达lacZ基因。用上述不同启动子-LacZ标记的豌豆根瘤菌接种烟草，有促进生长发育和提前开花的现象。 对豌豆凝集素基因转烟草的发根，用蛋白免疫原位杂交检测，表明该基因 的转译产物定位在根毛顶端。对发根接种豌豆根瘤菌、菜豆根瘤菌，结果只有 接种豌豆根瘤菌的发根出现瘤状物的结构。对其切片显微镜观察，可见细胞内 和细胞间隙有细菌颗粒存在。由于豌豆凝集素被认为是豌豆植物对其相应的豌 豆根瘤菌的识别因子，本结果初步表明有可能是转基因发根产生的豌豆凝集素 因子识别豌豆根瘤菌的结果。如果进一步得到证明，这一结果才具有重要的科 学意义，表明今后用基因工程的方法有可能扩大根瘤菌的宿主范围，使非豆科 植物有结瘤和固氮的可能性。

种子特异启动子调控ipt基因表达对烟草种子发育的影响

细胞分裂素（cytokinin，CTK）是五大类植物激素之一，它参与了植物许多生理过程与代谢的调控，主要有促进细胞的分裂和扩大，诱导芽、根和叶绿体的分化，促进种子与果实的发育，解除顶端优势，延缓叶片衰老及增强植物胁迫抗性，调节叶绿体发育基因、营养代谢基因及其它功能基因的表达，调控营养物质的运输和分配等。其调节的植物生理过程也受到其他不同因素的影响。细胞分裂素也是参与植物信号途径间相互作用的一类重要激素。 早期有关细胞分裂素生理作用的研究是基于外源激素的施用来进行的。由于通过外源施用细胞分裂素，其在植物体内的吸收，转运及代谢过程的复杂性和未知性，使得实验研究的因果关系难以确定。随着分子生物学的发展和植物转基因技术的日趋成熟，采用基因工程的方法来研究和探讨细胞分裂素对植物生长发育的调节作用及作用机理是近年来研究的热点，同时也为应用植物激素进行遗传育种提供了广阔的前景。 近年来，越来越多的真核生物启动子的分离克隆，促进了细胞分裂素基因工程的发展。利用具有组织特异性、发育特异性的启动子调控ipt基因，可使ipt基因在植物的特定组织或某一发育阶段进行表达。从而可根据不同的研究目的调控植物转化体中细胞分裂素合成的部位、时间和表达水平。尽管应用一些组织特异启动子融合ipt基因进行了一些细胞分裂素有关生理作用的研究，但是，有关细胞分裂素在胚和种子发育过程中的细胞学方面的研究还很少。 为研究ipt基因在种子发育过程中的作用，我们用大豆种子特异启动子-lectin融合ipt基因转化烟草，获得再生烟草植株。从生理学和细胞学上分析了ipt基因在lectin启动子的控制下的基因表达对种子生长发育的影响。发现在转基因烟草中，lectin-ipt基因的表达促进了种子胚及胚乳的细胞分裂，促使种子胚的生长加快，种子胚的增大为物质的贮存提供了条件，使营养物质更多的向种子运输，主要是可溶性蛋白质含量增加。由此进一步提高了转基因烟草种子干重的增加，种子的萌发与幼苗生长的加快，幼苗鲜重增加。

小麦Ta-JA1基因功能的初步分析

茉莉酸是植物信号传递以及诱导植物产生防御反应的关键诱导激素之一，广泛存在于高等植物中，并在植物病虫害防御的信号传导通路中起着重要的作用。茉莉酸可以诱导植物抗性基因表达，产生茉莉酸调节蛋白来抵御病虫害。在禾本科的大麦中发现了一个分子量在32kDa茉莉酸调节蛋白家族（JPR-32），但其功能一直没有深入的研究。 木菠萝素是从桂木属木菠萝的种子中分离的一种可以和半乳糖或甘露糖特异结合的凝集素。近来的研究表明，植物的凝集素具有多种功能，主要有：可作为储存蛋白，对储存物质进行包装、运输;作为植物细胞的有丝分裂因子，参与细胞壁的延伸;生长调节及运输碳水化合物;具有酶的功能;参与豆科植物感染结瘤;协同其它防御蛋白参与植物防御反应。植物凝集素的功能复杂各异，对木菠萝素的功能研究更是相对较少。 本文在小麦中克隆出的cDNA（本文命名为Ta-JA1基因），该基因cDNA全长1158bp，编码304个氨基酸，分子量32.7kDa，与JPR-32蛋白质家族的基因序列具有很高的同源性。从蛋白结构分析中显示，Ta-JA1基因有两个典型的功能结构域：N末端的茉莉酸诱导的防御反应结构域和C末端的木菠萝素相关结构域。为我们研究这个新的蛋白家族的功能提供了一个典型的模式蛋白。本文即从Ta-JA1基因出发来研究这一类蛋白的相关功能。在此，我们构建了Ta-JA1基因的pBI121表达载体，并通过农杆菌介导叶圆片法转化烟草，成功获得转基因植株。通过硫酸铵盐析法获得了植物Ta-JA1蛋白粗提品，效率在0.01%左右。使用蛋白粗提物进行凝血效应分析，转基因植株的蛋白粗样品可以凝集新鲜的兔血，说明Ta-JA1蛋白具有植物凝集素的基本性质。选取烟草上典型的三类病原体：烟草花叶病毒，烟草黑胫病菌和烟草野火病菌。分别对转基因烟草进行侵染，并观察统计其抗病性，发现转基因烟草对烟草花叶病毒和烟草黑胫病具有显著的抗性，对烟草野火病也具有一定的抑制作用。通过与野生型烟草在抗盐，抗旱，抗虫和生长发育等方面的统计比较与分析，可以看出，基因烟草在抗逆性上也有了显著的提高，虽然Ta-JA1的过量表达没有影响转基因烟草的整体生长进程，开花期和结实情况与对照烟草相比也无明显变化，但是转基因烟草的种子在萌发时间上有了显著提高，一定数量上还表现出愈合的花冠筒上出现不同程度开裂，花冠筒上有附生舌状花瓣，及带有花瓣状颜色的花萼等异常花表型。

点源污染对三峡库区陆生植物群落的影响

三峡库区一些污染严重的工业企业是当地主要的点源污染源，对周围植物群落产生了巨大危害，而植物是生态系统赖以存在的基础，它的生长发育直接影响到生态系统的结构及其正常功能的实现。本研究按照与点源污染源的距离为梯度，通过在三峡库区兴山县白沙河磷化工厂周围布设了32个植物群落固定样地，并以点源污染无法影响到的植物群落为对照，进行样地的野外群落学调查;在每个样地取不同种植物叶片100克左右和样地0~20cm土壤500克，以石灰滤纸法同步进行大气氟化物的取样。样品带回室内应用氟离子选择电极法，测定大气氟化物含量、植物叶片氟的累积量和土壤水溶性氟的含量。同时在野外调查时使用PAM2100叶绿素荧光仪测定植物最大光化学效率即Fv/Fm的值。通过野外调查试验和相关的室内分析，研究了（1）：点源污染对三峡库区陆生植物群落组成和物种多样性的影响;（2）：点源污染中的主要污染物对植物及土壤环境的影响;（3）：不同物种叶片最大光化学效率Fv/Fm对污染胁迫响应的差异。结果如下： 点源污染对植物群落物种丰富度以及Pielou均匀度指数均有不同程度的影响，对于群落结构相对简单的马尾松林和柏木林的不利影响更为显著。相对于污染区来说，对照区中物种重要值的集中程度有所下降。许多物种的重要值在污染区与对照区有明显的变化。马尾松（Pinus massoniana）、檵木（Loropetalum chinense ）、铁仔（Myrsine africana）、卷柏（Selaginella tamariscina ）等对照区重要值较污染区为高，黄檀（Dalbergia hupeana ）、菱叶海桐（Pittosporum truncatum）、君迁子（Diospyros lotus）等污染区的重要值较对照区为高。群落中有些物种比如柏木（Cupressus funebris）的天然更新也受到污染的影响。 污染区土壤pH值大多低于对照区，但是与离污染源距离的相关性不强。污染区有些物种比如马尾松、柏木等叶片中的全氟含量与大气中氟化物的含量和土壤水溶性氟含量明显正相关。但是另外有些物种氟的累积量受点源污染的影响不显著，比如菱叶海桐、翅柃（Eurya alata）等在污染严重的样地内生存状况仍然很好。 在距离点源污染近的样地内，大多数物种的最大光化学效率Fv/Fm的值显著下降。栓皮栎（Quercus variabilis）、马尾松和柏木等的Fv/Fm值与距污染源的距离呈明显的正相关，都是随着离污染源越来越近而逐渐降低。根据污染区相对对照区Fv/Fm值下降幅度的不同，把植物划分为三种类型：对污染敏感型如柏木、铁仔、檵木等，中等敏感型如油桐（Vernicia fordii）、香叶树（Lindera communis）和不敏感型如山胡椒（Lindera glauca）和 蝴蝶花（Iris japonica）等。

植物高赖氨酸蛋白质的分离和纯化及其N端序列核苷酸探针的合成

禾谷类作物水稻和小麦是人们的主要植物性食物来源．而这些作物种子蛋白质中人类不能合成的必需氨基酸含量不平衡，造成了优质蛋白质的缺乏和人体对蛋白质利用的极大浪费．大约有二分之一的谷类种子蛋白质和四分之一的大豆蛋白质不能被合理地利用。大多数禾本科作物包括水稻和小麦的种子蛋白质中第一限制性氨基酸是赖氨酸，纠正其不平衡现象可大大提商蛋白质的营养价值。本研究在高赖氨酸植物种的筛选、高赖氨酸种子储藏蛋白质的纯化及其基因的分离等方面开展了工作。 选用与禾本科亲缘关系较远的8个植物种为研究材料，它们分别属于榛科，十字花科、胡桃科、豆科、胡麻科和松科。氨基酸组分分析确定豆科和十字花科的三个植物种赖氨酸含量在5.5%以上，其中豆科植物四棱豆(Pso phocarpus tetragonolobus)种子全蛋白赖氨酸含量达7.9%．用5种提取液提取了四棱豆种子的清蛋白、球蛋白和全蛋白。经测定发现0.025M Tris.HCl(pH7.4)提取液提取的清蛋白赖氨酸含量高最．通过自然胶电泳，SDS-PAGB电泳，非变牲IEF和变性IEF／SDS双向电泳，对四棱豆种子清蛋白进行了定性研究。用变性IEF/ SDS双向电泳分析出60多种蛋白质和蛋白质亚基及多肽。研究中改进了等电聚焦电泳纯化蛋白质的方法，经处理的胶板显现出清晰的蛋白质带型，不需染色即可确定带的位置，从切下的胶条中洗脱的蛋白质，其纯度达到双向电泳纯和HPLC纯。用三种电溶方法(SDS-PAGE非变性IEF，变性IEF)纯化出三十一种蛋白质或多肽分子。分别进行了分子量确定和氨基酸组分分析，发现了一个赖氨酸含量高达11.4%的蛋白质，其分子量为18KD，并制备了该蛋白质的抗体，测定了18KD蛋白质N端30个氨基酸残基的顺序，根据这一顺序设计合成了一组17个核苷酸的基因探针．经鉴定单链DNA探针的纯度和总量达到了设计要求。用尿素法与CTAB法结合提取了四棱豆幼苗核基因组DNA，其分子量在50Kb以上，达到了构建GenormicDNA文库的要求．用bamHI EcoRI和HindⅢ三种酶切割提取的DNA，得到了分子量大小不同的片段。 对四棱豆种子蛋白质的定性、高赖氨酸蛋白质的纯化、18KD蛋白N端序列分析及寡核苷酸探针的合成以及GcnomicDNA的提取与酶切，尚未见有资料报道．这些工作为克隆高赖氨酸基因打下了良好的基础，对改良禾本科作物蛋白质品质意义深远．

Aquacrops of Darbhanga District in north Bihar and their commercial significance

Darbhanga district in North Bihar is characterised by thick alluvial soil, moderately good rainfall, high humidity, ample sunshine and numerous water resources in the form of perennial rivers, tributaries, streams, lakes, ponds, pools and puddles. The aquacrops of this district include several species of commercially important fishes, aquatic cash crops such as makhana (Euryale ferox), singhara (Trapa spp.), lotus, lilly, Khubi etc. and molluscs. This paper highlights the commercial significance of these aquacrops and offers suggestions for their sustained development.

莲（Nelumbo nucifera Gaertn.）胚芽的光合特性及其暗萌发过程中的光合系统建成

被子植物成熟的种子一般不合有叶绿素，但是莲（Nelumbo nucifera Gaertn.）的胚芽却具有鲜明的绿色，本文较详细地研究了莲胚芽不同于一般被子植物叶组织的色素和光台系统组成，并通过对莲胚芽成熟发育过程中的叶绿素合成和光合系统发育进行分析，探讨了莲胚芽光合特性形成的原因，最后对莲胚芽在黑暗中萌发能发育并建成光合系统的现象进行了研究，主要的结果如下： 1，莲胚芽不仅含有叶绿素和光合系统，而且其色素和光台系统组成均与莲叶以及其它被子植物的叶组织不同。莲胚芽的Chla/b值约为0.8左右，远远低于正常高等植物的Chla/b值(～3)：莲胚芽的色素组成中不含有β-胡萝卜素;莲胚芽的光合系统没有电子传递活性，快速荧光动力学测定结果表明莲胚芽只有较高的固定荧光F。没有可变荧光Fv;原位低温荧光光谱检测表明莲胚芽只在679nm处有一个荧光发射主峰，没有正常的PSII和PSI荧光发射峰(683nm、692nm和730nm);部分变性的叶绿素蛋白复合物凝胶电泳分析结果表明莲胚芽叶绿体类囊体膜上只存在LHCII 一种叶绿素蛋白复合物（其中单体和二聚体形式的LHCII均有发现）;Western Blots检测结果表明莲胚芽的LHCII组成比较单一，同时确证了莲胚芽不含有PSI的核心和天线蛋白组分。莲胚芽LHCII和莲叶LHCII在SDS-PAGE图谱上迁移距离相同，但是光谱分析表明二者不仅在Chla、Chlb的相对含量上不同，而且在叶绿素分子与蛋白的结合状态上也存在差异，这些差异主要是由一部分Chla分子造成的，Chlb分子在二者中的结合状态则比较～致。 2，对莲胚芽成熟过程中的光合系统发育进行研究，结果表明这个过程可以分为建成期（0-20天）、稳定期（20-30天）和降解期（30—40天）三个阶段。在建成期和稳定期内，莲胚芽外面的包被物可能不是完全遮光的，所以莲胚芽能感受到环境光信号，其叶绿素合成已经光合系统建成集中在此阶段内进行：在莲’胚芽成熟后期，莲胚芽外面的包被组织开始木质化，光信号无法再穿透它们，莲胚芽的光合系统发育进入降解期，叶绿素合成停止，己建成的光合系统开始降解，到莲胚芽成熟时，除LHCIl外，光合系统其余的叶绿素蛋白复合物都被降解了，所以莲胚芽具有不同于一般祓子植物叶组织的色素和光合系统组成。对莲胚芽的成熟发育过程进行遮光处理，结果发现遮光发育的莲胚芽发生明显黄化，这表明莲胚芽的叶绿素合成也离不开光照，在莲总基因组中检测不到编码DPOR的三个基因的同源序列，确证了莲胚芽不具有在黑暗中合成叶绿素的能力。 3，在黑暗中萌发生长的莲胚芽能够在相当长的时间内保持其叶绿素稳定，特别是Chla的含量在暗生长10天以内基本没有变化;原位低温荧光光谱检测表明暗萌发过程中莲苗有PSII和PSI的荧光发射峰形成，暗生长10天左右的莲苗具有比较明显的光合系统荧光发射峰，但是与自然光照下的发育过程相比，暗萌发莲苗的光合系统荧光发射峰出现较慢，而且PSI的荧光发射相对较弱;暗萌发莲苗在转绿以及冻融过程中的原位低温荧光光谱变化表明莲苗在黑暗中建成的光合系统不完善并且不稳定;对莲胚芽、暗萌发莲苗以及莲叶的叶绿体吸收光谱进行比较，结果显示暗萌发莲苗的叶绿体发育阶段介于莲胚芽和莲叶之间;叶绿素蛋白复合物凝胶电泳分离，SDS-PAGE，Western Blots免疫检测、以及叶绿素荧光诱导动力学结果均确证暗萌发莲苗有光合系统的发育，特别是PSI的出现;对暗萌发莲苗的光化学活性进行分析，结果表明暗中建成的PSII和PSI均具有电子传递活性：但是放氧复合物的发育不完全，对莲胚芽暗萌发过程光合系统建成的原因进行分析，推测叶绿素可能起了至关重要的作用，光对于莲胚芽萌发过程中的光合系统发育来说可能并不是必需的。

Cloning and characterization of a blood coagulation factor IX-binding protein from the venom of Trimeresurus stejnegeri

A blood coagulation factor IX-binding protein (TSV-FIX-BP) was isolated from the snake venom of Trimeresurus stejnegeri. On SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, TSV-FIX-BP showed a single band with an apparent molecular weight of 23,000 under non-reducing conditions. and two distinct bands with apparent molecular weights of 14,800 and 14,000 under reducing conditions. cDNA clones containing the coding sequences of TSV-FIX-BP were isolated and sequenced to determine the structure of the precusors of TSV-FIX-BP subunits. The deduced amino acid sequences of two subunits of TSV-FIX-BP were confirmed by N-terminal protein sequencing and trypsin-digested peptide mass fingerprinting. TSV-FIX-BP was a nonenzymatic C-type lectin-like anti-coagulant. The anti-coagulant activity of TSV-FIX-BP was mainly caused by its dose dependent interaction with blood coagulation factor IX but not with blood coagulation factor X. (C) 2003 Elsevier Science Ltd. All rights reserved.

贻贝凝集素抗-HIV活性研究

分离提取海洋无脊椎动物贻贝(Crenomytilus grayanus)凝集素,考察其抗HIV活性。采用半乳糖-Sepharose 6B亲和层析和Sephacryl S-200层析分离提取贻贝凝集素(Crenomytilus grayanus lectin,CGL),以光镜检查合胞体抑制试验,以ELSA测定HIVp24抗原表达水平。从海洋无脊椎动物贻贝中分离出的凝集素(CGL),为N-乙酰半乳糖胺/半乳糖(GalNAc/Gal)特异性的凝集素。CGL在27.88mg.L-1浓度时,对HIV诱导细胞病变的抑制达50%;在45.70mg.L-1时,对HIV-1复制的抑制达50%;同时在35.12mg.L-1浓度时,对HIV感染细胞融合的阻断达50%。

银鲫卵母细胞特异表达凝集素的抗体制备及其定位分析

银鲫卵母细胞特异的凝集素(Gibel carp oocyte-specific lectin,GOL)是经差减杂交筛选出来的。本研究采用原核表达方法,利用Pinpoint-T载体表达了该凝集素的部分肽段(从22到214个氨基酸),并经纯化用来免疫家兔制备多克隆抗体。采用免疫荧光共定位方法,证明该凝集素是卵母细胞中皮质颗粒的成分之一。

CHARACTERISTICS OF FATTY ACID METHYL ESTERS (FAMEs) AND ENZYMATIC ACTIVITIES IN SEDIMENTS OF TWO EUTROPHIC LAKES

Enzymatic activities and fatty acid methyl esters (FAMEs) in the sediments of two eutrophic lakes in Wuhan city were investigated. The results showed phosphatase and dehydrogenase activities in the lotus zone and plant floating bed zone were significantly lower than those in other sites, and urease activity was the highest where microorganism agents were put in. Fatty acid group compositions indicated the predominance of aerobic bacteria in the surface sediments in shallow lakes. The ratios of FAMEs specific for bacteria and Gram-positive bacteria exibited significant differences between the two lakes. The results of trans to cis indicated that the microorganisms in Lake Yuehu could adapt themselves to environmental stress better. The enzymatic activities and FAMEs showed differences in different sites, indicating that ecological restoration measures and environmental conditions could affect lake sediment to some extent. But the monitoring, work would be done in series to exactly evaluate the effect of the remediation measures.

Intelectin gene from the grass carp Ctenopharyngodon idella: cDNA cloning, tissue expression, and immunohistochemical localization

The cDNA encoding grass carp intelectin was isolated from a head kidney cDNA library, and termed gcIntL. The deduced amino acid sequence of gcIntL consists of 318 amino acids, and about 55% identical and 74% similar to human intelectin, which is a new type of lectin recognizing galactofuranose, and plays a role in the recognition of bacteria-specific components in animal hosts. The gcIntL gene consists of seven exons and six introns, spacing over approximately 3 kb of genomic sequence. Phylogenetic analysis clearly demonstrated that the gcIntL formed a clade with Danio rerio intelectin and 35 kDa serum lectin. By real-time quantitative RT-PCR analysis, gcIntL transcripts were significantly induced in head kidney, trunk kidney, spleen, and intestine from LPS-stimulated fish. RT-PCR and Western blotting analysis demonstrated that the mRNA and protein of gcIntL gene have the same expression pattern, and both were detected in brain, gill, intestine, head kidney, trunk kidney, spleen, and heart. Furthermore, gcIntL protein could be detected in gill, intestine, trunk kidney, head kidney, spleen, heart, and brain including medulla oblongata and optic lobe, as determined by immunohistochemistry. This is the first report of intelectin expression pattern in fish, and of recombinant gcIntL and polyclonal antibody against gcIntL. (c) 2006 Elsevier Ltd. All rights reserved.