植物高赖氨酸蛋白质的分离和纯化及其N端序列核苷酸探针的合成

禾谷类作物水稻和小麦是人们的主要植物性食物来源．而这些作物种子蛋白质中人类不能合成的必需氨基酸含量不平衡，造成了优质蛋白质的缺乏和人体对蛋白质利用的极大浪费．大约有二分之一的谷类种子蛋白质和四分之一的大豆蛋白质不能被合理地利用。大多数禾本科作物包括水稻和小麦的种子蛋白质中第一限制性氨基酸是赖氨酸，纠正其不平衡现象可大大提商蛋白质的营养价值。本研究在高赖氨酸植物种的筛选、高赖氨酸种子储藏蛋白质的纯化及其基因的分离等方面开展了工作。 选用与禾本科亲缘关系较远的8个植物种为研究材料，它们分别属于榛科，十字花科、胡桃科、豆科、胡麻科和松科。氨基酸组分分析确定豆科和十字花科的三个植物种赖氨酸含量在5.5%以上，其中豆科植物四棱豆(Pso phocarpus tetragonolobus)种子全蛋白赖氨酸含量达7.9%．用5种提取液提取了四棱豆种子的清蛋白、球蛋白和全蛋白。经测定发现0.025M Tris.HCl(pH7.4)提取液提取的清蛋白赖氨酸含量高最．通过自然胶电泳，SDS-PAGB电泳，非变牲IEF和变性IEF／SDS双向电泳，对四棱豆种子清蛋白进行了定性研究。用变性IEF/ SDS双向电泳分析出60多种蛋白质和蛋白质亚基及多肽。研究中改进了等电聚焦电泳纯化蛋白质的方法，经处理的胶板显现出清晰的蛋白质带型，不需染色即可确定带的位置，从切下的胶条中洗脱的蛋白质，其纯度达到双向电泳纯和HPLC纯。用三种电溶方法(SDS-PAGE非变性IEF，变性IEF)纯化出三十一种蛋白质或多肽分子。分别进行了分子量确定和氨基酸组分分析，发现了一个赖氨酸含量高达11.4%的蛋白质，其分子量为18KD，并制备了该蛋白质的抗体，测定了18KD蛋白质N端30个氨基酸残基的顺序，根据这一顺序设计合成了一组17个核苷酸的基因探针．经鉴定单链DNA探针的纯度和总量达到了设计要求。用尿素法与CTAB法结合提取了四棱豆幼苗核基因组DNA，其分子量在50Kb以上，达到了构建GenormicDNA文库的要求．用bamHI EcoRI和HindⅢ三种酶切割提取的DNA，得到了分子量大小不同的片段。 对四棱豆种子蛋白质的定性、高赖氨酸蛋白质的纯化、18KD蛋白N端序列分析及寡核苷酸探针的合成以及GcnomicDNA的提取与酶切，尚未见有资料报道．这些工作为克隆高赖氨酸基因打下了良好的基础，对改良禾本科作物蛋白质品质意义深远．