Nanomateriais manufaturados : avaliação de segurança através da caracterização dos seus efeitos genéticos

RESUMO - Os nanomateriais manufaturados (NMs), isto é, fabricados deliberadamente para fins específicos, apresentam propriedades físico-químicas únicas como a dimensão, área superficial ou funcionalização, que lhes conferem caraterísticas mecânicas, óticas, elétricas e magnéticas muito vantajosas para aplicações industriais e biomédicas. Efetivamente, a tecnologia baseada nos NMs, ou nanotecnologia, foi identificada como uma key enabling technology, impulsionadora do crescimento económico dos países industrializados, devido ao seu potencial para melhorar a qualidade e desempenho de muitos tipos de produtos e de processos. Contudo, a expansão da utilização de NMs contrasta com a insuficiente avaliação de risco para a saúde humana e para o ambiente, sendo considerados como um risco emergente para a saúde pública. As incertezas sobre a segurança dos NMs para a saúde pública advêm sobretudo de estudos epidemiológicos em humanos expostos a nanomateriais produzidos como consequência dos processos e atividades humanas e da poluição. Uma das principais preocupações relativamente aos efeitos adversos dos NMs na saúde humana é o seu potencial efeito carcinogénico, que é sugerido por alguns estudos experimentais, como no caso dos nanomateriais de dióxido de titânio ou dos nanotubos de carbono. Para avaliar em curto termo as propriedades carcinogénicas de um composto, utilizam-se frequentemente ensaios de genotoxicidade em linhas celulares de mamífero ou ensaios em modelos animais, em que se analisa uma variedade de lesões genéticas potencialmente relacionados com o processo de carcinogénese. No entanto, a investigação sobre as propriedades genotóxicas dos NMs não foi, até hoje, conclusiva. O presente estudo tem por objectivo principal caracterizar os efeitos genotóxicos associados à exposição a nanomateriais manufaturados, de forma a contribuir para a avaliação da sua segurança. Constituíram objectivos específicos deste estudo: i) avaliar a genotoxicidade dos NMs em três tipos de células humanas expostas in vitro: linfócitos humanos primários, linha celular de epitélio brônquico humano (BEAS-2B) e linha celular de adenocarcinoma epitelial de pulmão humano (A549); ii) avaliar a sua genotoxicidade num modelo de ratinho transgénico; iii) investigar alguns mecanismos de acção que poderão contribuir para a genotoxicidade dos nanomateriais, como a contribuição de lesões oxidativas para a genotoxicidade induzida pelos NMs in vitro, e a investigação da sua bioacumulação e localização celular in vivo. Foram analisados os efeitos genotóxicos associados à exposição a duas classes de NMs, dióxido de titânio e nanotubos de carbono de parede múltipla, bem como a um NM de óxido de zinco, candidato a ser utlilizado como controlo positivo de dimensão nanométrica. Os xx NMs utilizados foram previamente caracterizados com detalhe relativamente às suas características físico-químicas e também relativamente à sua dispersão em meio aquoso e no meio de cultura. A metodologia incluiu ensaios de citotoxicidade e de genotoxicidade in vitro, designadamente, ensaios de quebras no DNA (ensaio do cometa) e nos cromossomas (ensaio do micronúcleo) em células humanas expostas a várias concentrações de NMs, por comparação com células não expostas. Também foram realizados ensaios in vivo de quebras no DNA, quebras cromossómicas e ainda um ensaio de mutações em vários órgãos de grupos de ratinhos transgénicos LacZ, expostos por via intravenosa a duas doses de dióxido de titânio. Foi investigada a existência de uma relação dose-resposta após exposição das células humanas ou dos animais a NMs. A contribuição de lesões oxidativas para a genotoxicidade após exposição das células aos NMs in vitro foi explorada através do ensaio do cometa modificado com enzima. Realizaram-se estudos histológicos e citológicos para deteção e localização celular dos NMs nos órgãos-alvo dos ratinhos expostos in vivo. Os resultados demonstraram efeitos genotóxicos em alguns dos NMs analisados em células humanas. No entanto, os efeitos genotóxicos, quando positivos, foram em níveis reduzidos, ainda que superiores aos valores dos controlos, e a sua reprodutibilidade era dependente do sistema experimental utilizado. Para outros NMs, a evidência de genotoxicidade revelou-se equívoca, conduzindo à necessidade de esclarecimento através de ensaios in vivo. Para esse fim, recorreu-se a uma análise integrada de múltiplos parâmetros num modelo animal, o ratinho transgénico baseado em plasmídeo contendo o gene LacZ exposto a um NM de dióxido de titânio, NM-102. Embora tenha sido demonstrada a exposição e a acumulação do NM no fígado, não se observaram efeitos genotóxicos nem no fígado, nem no baço nem no sangue dos ratinhos expostos a esse NM. Neste estudo concluiu-se que algumas formas de dióxido de titânio e nanotubos de carbono de parede múltipla produzem efeitos genotóxicos em células humanas, contribuindo para o conjunto de evidências sobre o efeito genotóxico desses NMs. As diferenças observadas relativamente à genotoxicidade entre NMs do mesmo tipo, mas distintos em algumas das suas características físico-quimicas, aparentemente não são negligenciáveis, pelo que os resultados obtidos para um NM não devem ser generalizados ao grupo correspondente. Para além disso, a genotoxicidade equívoca verificada para o NM-102 em células humanas expostas in vitro, não foi confirmada no modelo in vivo, pelo que o valor preditivo da utilização dos ensaios in vitro para a identificação de NMs com efeitos genotóxicos (e portanto potencialmente carcinogénicos) ainda tem de ser esclarecido antes de ser possível extrapolar as conclusões para a saúde humana. Por sua vez, como a informação aqui produzida pelas metodologias in vitro e in vivo não reflete os efeitos de exposição continua ou prolongada, que poderá conduzir a efeitos genotóxicos distintos, esta xxi deverá ser complementada com outras linhas de evidência relativamente à segurança dos NMs. Perante a incerteza dos níveis de exposição real do organismo humano e do ambiente, a segurança da utilização dos NMs não pode ser garantida a longo prazo e, tendo em conta a elevada produção e utilização destes NMs, são prementes futuros estudos de monitorização ambiental e humana.

Engineering of fatty acid production and secretion in Saccharomyces cerevisiae

Tese de Doutoramento em Ciências - Especialidade em Biologia

Hydrophobic/hydrophilic P(VDF-TrFE)/PHEA polymer blend membranes

Polymer blend membranes have been obtained consisting of a hydrophilic and a hydrophobic polymers distributed in co-continuous phases. In order to obtain stable membranes in aqueous environments, the hydrophilic phase is formed by a poly(hydrohyethyl acrylate), PHEA, network while the hydrophobic phase is formed by poly(vinylidene fluoride-co-trifluoroethylene) P(VDF-TrFE). To obtain the composites, in a first stage, P(VDF-TrFE) is blended with poly(ethylene oxyde) (PEO), the latter used as sacrificial porogen. P(VDF-TrFE)/PEO blend membranes were prepared by solvent casting at 70° followed by cooling to room temperature. Then PEO is removed from the membrane by immersion in water obtaining a P(VDF-TrFE) porous membrane. After removing of the PEO polymer, a P(VDF-TrFE) membrane results in which pores are collapsed. Nevertheless the pores reopen when a mixture of hydroxethyl acrylate (HEA) monomer, ethyleneglycol dimethacrylate (as crosslinker) and ethanol (as diluent) is absorbed in the membrane and subsequent polymerization yields hybrid hydrophilic/hydrophobic membranes with controlled porosity. The membranes are thus suitable for lithium-ion battery separator membranes and/or biostable supports for cell culture in biomedical applications.

Biochemical and physical surface functionalization of polycaprolactone as a key mediator of osteogenic differentiation and vascularized tissue morphogenesis

Tese de Doutoramento em Engenharia de Tecidos, Medicina Regenerativa e Células Estaminais.

Biomaterials for cartilage tissue engineering under mechanical stimulus

Tese de Doutoramento em Ciências (Especialidade de Física)

Synthesis of new peptide derivatives that self-assemble into nanostructured hydrogels for biomedical applications

Tese de Doutoramento em Ciências (área de especialização em Química)

Poly(ester-urethane) scaffolds: effect of structure on properties and osteogenic activity of stem cells

The present study aimed to investigate the effect of structure (design and porosity) on the matrix stiffness and osteogenic activity of stem cells cultured on poly(ester-urethane) (PEU) scaffolds. Different three-dimensional (3D) forms of scaffold were prepared from lysine-based PEU using traditional salt-leaching and advanced bioplotting techniques. The resulting scaffolds were characterized by differential scanning calorimetry (DSC), thermogravimetric analysis (TGA), scanning electron microscopy (SEM), mercury porosimetry and mechanical testing. The scaffolds had various pore sizes with different designs, and all were thermally stable up to 300â °C. In vitrotests, carried out using rat bone marrow stem cells (BMSCs) for bone tissue engineering, demonstrated better viability and higher cell proliferation on bioplotted scaffolds compared to salt-leached ones, most probably due to their larger and interconnected pores and stiffer nature, as shown by higher compressive moduli, which were measured by compression testing. Similarly, SEM, von Kossa staining and EDX analyses indicated higher amounts of calcium deposition on bioplotted scaffolds during cell culture. It was concluded that the design with larger interconnected porosity and stiffness has an effect on the osteogenic activity of the stem cells.

Biological aspects of the DM28C clone of Trypanosoma cruzi after metacylogenesis in chemically defined media

The biological characterization of the Trypanosoma cruzi clone Dm 28c in terms of its growth in LIT medium, cell-cycle, infectivity to mice and interaction with professional and non-professional phagocytic cells shows that it behaves as a bona fide T. cruzi representant. The biological properties of this myotropic clone do not change according to the origin of the trypomastigote forms (i. e., from triatomines, infected mice, cell-culture or from the chemically defined TAUP and TAU3AAG media). In addition Dm 28c metacyclic trypomastigotes from TAU3AAG medium display a high infectivity level to fibroblasts and muscle cells. Experiments on binding of cationized ferritin to trypomastigotes surface show the existence of cap-like structures of ferritin in regions near the kinetoplast. However the nature and role of these anionic sites remain to be determined. The results indicate that metacyclic trypomastigotes from Dm 28c clone obtained under chemically defined conditions reproduce the biological behaviour of T. cruzi, rendering this system very suitable for the study of cell-parasite interactions and for the isolation of trypanosome relevant macromolecules.

Introducció experimental a la biotecnologia amb clavellina: cultiu in vitro

Treball de recerca realitzat per una alumna d'ensenyament secundari i guardonat amb un Premi CIRIT per fomentar l'esperit científic del Jovent l'any 2009. Es tracta d’una recerca experimental en la que s’han assajat vuit tècniques de cultiu in vitro amb clavellina. El material vegetal s’ha esterilitzat per immersió en una solució diluïda de lleixiu i s’ha manipulat de manera estèril. En tots els casos el medi de cultiu utilitzat ha estat el MS amb una concentració de sacarosa i reguladors de creixement variable segons l’experiment. La incubació dels cultius s’han dut a terme en una cambra amb control de fotoperíode durant 4 setmanes. Els diferents reguladors de creixement han mostrat un clar efecte sobre les seccions de tija. Els explants cultivats en medi lliure d’hormones han crescut menys que els exposats a diverses concentracions de NAA i BA. Aquests tractaments hormonals han originat símptomes de creixement anòmals (engruiximents a la base i vitrificació). La presencia de 2,4-D ha afavorit la formació de cal•lus i d’arrels per organogènesi adventícia indirecta. L’obtenció de plàntules per germinació in vitro de llavors ha permès reduir notablement les pèrdues per contaminació, mentre que el subcultiu d’aquestes ha donat unes tases de micropropagació de 7.2 seccions/plàntula. Ha estat possible aclimatar aquestes vitroplantes per tal d’adaptar-les a les condicions de camp. No hem pogut obtenir organogènesis adventícia ni embriogènesi somàtica a partir d anteres ni hem pogut iniciar un cultiu de cèl•lules a partir dels cal•lus. Tot i la complexitat d’aquestes tècniques, és possible dur-les a terme en un laboratori escolar.

Immunoelectron microscopical identification of the uncoupling protein in brown adipose tissue mitochondria.

The distribution of the uncoupling protein (UCP) in brown adipocyte mitochondria of the hibernant Muscardinus avellanarius was obtained by ultrastructural immunocytochemistry. In both cryosections and sections of Lowicryl-embedded material UCP was localized in the mitochondrial cristae of brown adipocytes, but not in liver mitochondria. It should now be possible to easily identify the morphology of cells committed to BAT differentiation in the tissue as well as in cell culture.

Morphological and virological studies in six autopsies of children with adenovirus pneumonia

Pulmonary lesions compatible with adenovirus infection were detected by gross and microscopic examination of autopsy tissues children aged from 5 to 34 months. Hepatic lesions indicative of systemic infection were also found in four of the chisldren. The viral etiology was confirmed in three cases by in-situ hibridization, electro-microscopy and immunofluorescence performed in parafin-embedded tissues, and in one case by cell culture isolation of adenovirus type 2 from nasopharyngeal exudate. Routine testing by methods additional to conventional light microscopy would probably have revealed a larger number of adenovirus infections among the 1.103 autopsy records analyzed in this study.

Oligodendroglia metabolically support axons and contribute to neurodegeneration.

Oligodendroglia support axon survival and function through mechanisms independent of myelination, and their dysfunction leads to axon degeneration in several diseases. The cause of this degeneration has not been determined, but lack of energy metabolites such as glucose or lactate has been proposed. Lactate is transported exclusively by monocarboxylate transporters, and changes to these transporters alter lactate production and use. Here we show that the most abundant lactate transporter in the central nervous system, monocarboxylate transporter 1 (MCT1, also known as SLC16A1), is highly enriched within oligodendroglia and that disruption of this transporter produces axon damage and neuron loss in animal and cell culture models. In addition, this same transporter is reduced in patients with, and in mouse models of, amyotrophic lateral sclerosis, suggesting a role for oligodendroglial MCT1 in pathogenesis. The role of oligodendroglia in axon function and neuron survival has been elusive; this study defines a new fundamental mechanism by which oligodendroglia support neurons and axons.

Primary isolation of spotted fever group rickettsiae from Amblyomma cooperi collected from Hydrochaeris hydrochaeris in Brazil

This paper reports the first isolation of a spotted fever group rickettsia from an Amblyomma cooperi ixodid collected from a capybara (Hydrochaeris hydrochaeris) in an endemic area of spotted fever in the County of Pedreira, State of São Paulo, Brazil. Isolation was performed in Vero cell culture and submitted to immunofluorescence, using antibody from Rickettsia rickettsii-positive human serum.

Rabies virus infection of cultured adult mouse dorsal root ganglion neurons

An in vitro model of adult dorsal root ganglion neurons infection by rabies virus is described. Viral marked neurotropism is observed, and the percentage and the degree of infection of the neurons is higher than in non neuronal cells, even if neurons are the minority of the cells in the culture. The neuritic tree is also heavily infected by the virus.