Papel do óxido nítrico no desenvolvimento de lesões cardíacas na fase aguda da infecção experimental pelo Trypanosoma cruzi

A doença de Chagas é causada pelo Trypanosoma cruzi e o coração é o órgão mais acometido. O óxido nítrico apresenta importante ação anti-Trypanosoma, porém, com pouca evidência de seu papel no mecanismo de lesão tecidual. O objetivo deste estudo foi analisar a contribuição do óxido nítrico no desenvolvimento da inflamação e da fibrose cardíaca na fase aguda da infecção experimental por cepas Y e Colombiana do Trypanosoma cruzi. A inflamação foi significativamente maior nos animais infectados pela cepa Colombiana, comparada com os infectados com a cepa Y, tanto nos animais C57BL/6 (3,98x1,87%; p=0,004) quanto nos animais C57BL/6 deficientes na sintase do óxido nítrico induzível (3,99x2,4%; p=0,013). O parasitismo cardíaco dos animais C57BL/6 deficientes na sintase do óxido nítrico induzível infectados pela cepa Colombiana foi significativamente maior que o destes mesmos animais infectados com a cepa Y (2,78x0,17 ninhos/mm²; p=0,004) assim como, os animais C57BL/6 infectados com a cepa Colombiana (2,78x1,33 ninhos/mm²; p=0,006) ou cepa Y (2,78x0,53 ninhos/mm²; p=0,005). Os dados reforçam o papel do óxido nítrico no controle do parasitismo e sugerem seu papel na proteção tecidual, controlando a inflamação e potencialmente diminuindo lesões cardíacas durante a fase aguda na doença de Chagas experimental.

Influência da resposta inflamatória de fase aguda nos níveis séricos de retinol e da proteína de ligação do retinol em pacientes com AIDS

INTRODUÇÃO: a hiporretinolemia constitui fator prognóstico independente em pacientes com AIDS, e a atividade inflamatória causa redução dos níveis séricos deste nutriente na população em geral. Entretanto, faltam estudos que avaliem o impacto da atividade inflamatória sobre o nível sérico do retinol em pacientes com AIDS. MÉTODOS: foram avaliados transversalmente 41 pacientes internados por complicações da AIDS, que tiveram quantificados alguns marcadores de inflamação (proteína C reativa e fator de necrose tumoral alfa) e concentrações séricas de retinol e da proteína de ligação do retinol. RESULTADOS: apesar da baixa (14,6%) prevalência de hiporretinolemia evidenciou-se correlação negativa dos marcadores de inflamação com os níveis séricos de retinol e de sua proteína de ligação nos pacientes com AIDS. CONCLUSÕES: a atividade inflamatória de fase aguda está associada a baixos níveis séricos de retinol em indivíduos com AIDS.

Avaliação longitudinal das concentrações solúveis de CD40L e de marcadores hemorreológicos na doença inflamatória aguda

Actualmente a sepsis continua a ser uma das principais causas de morte durante o internamento em Unidades de Cuidados Intensivos (UCI). Apesar dos recentes avanços a nível terapêutico existem ainda lacunas por preencher nomeadamente ao nível da identificação de biomarcadores que permitam um melhoramento do prognóstico tendo em conta a necessidade de identificação de doentes de maior risco. Este estudo foi realizado com o objectivo de contribuir para uma melhor compreensão da influência de alterações na microcirculação na sepsis. Para tal foram analisados diversos parâmetros hemorreológicos, como a deformabilidade e agregação eritrocitárias, NO e GSNO eritrocitário. Foi também avaliada a relação de tais parâmetros com a inflamação e trombose através da avaliação da concentração sérica de sCD40L. O estudo incidiu sobre doentes com choque séptico (n=22) e indivíduos saudáveis (n=34). Os doentes com sepsis foram monitorizados na admissão na UCI, 24 e 72 horas depois. Verificaram-se variações longitudinais nos valores de agregação eritrocitária, cujos valores aumentam ao longo do tempo de internamento, até atingirem às 72h valores significativamente diferentes do grupo controlo. Uma tendência inversa apresenta os valores de GSNO eritrocitário, os quais estão aumentados nos doentes em choque séptico aquando da admissão à UCI, diminuindo para valores semelhantes ao grupo controlo. Observaram-se também variações nas concentrações de sCD40L, tendo sido registada uma diminuição ao longo do tempo tornando-se evidente às 72 horas após o internamento. Apesar de preliminares, a comparação entre doentes sobreviventes e não-sobreviventes permitiu inferir uma possível relação do aumento de sCD40L e diminuição de NO e GSNO eritrocitários na admissão com um pior prognóstico. Estes resultados vêm fundamentar a ideia de que existe realmente uma relação entre as alterações a nível da microcirculação e a sepsis.

A Fotografia Documental na Imprensa Nacional: o Real e o Verosímil

Nos últimos trinta anos da imprensa nacional, assiste-se a inúmeras mudanças no papel que a fotografia assume nas práticas editoriais dos jornais, influência da crescente generalização da fotografia digital. No final da década de 80 e início de 90 do século XX, investe-se na fotografia e compreende-se porquê. Ela é uma ferramenta poderosa para a criação de uma identidade editorial e para fidelizar leitores. Nunca a autoria do fotógrafo fora tão reconhecida nas redações como neste período, geralmente, sem comprometer o ideal do rigor jornalístico. A partir do século XXI, assiste-se a uma regressão. Esta tese pretende investigar a importância que foi atribuída à fotografia e ao fotojornalismo na imprensa, nas últimas três décadas, procurando determinar qual o grau de consciência que o fotógrafo tem das escolhas assumidas no ato fotográfico; como é que as opções do autor interferem na imagem final e como é que a fotografia jornalística lida com a questão do real e do verosímil? Para responder a estas e outras perguntas realizou-se noventa entrevistas que foram depois submetidas a uma análise qualitativa. Por mais consciência que o fotógrafo tenha da necessidade de ser objetivo e de retratar a verdade do acontecimento, pessoa ou lugar, a fotografia de imprensa é sempre a perspetiva de alguém que escolhe fragmentos da realidade para reportar ou documentar um acontecimento. O observador, com um olhar ingénuo e sem adotar uma atitude crítica perante a mimese do real, recebe a imagem como sendo a prova irrefutável de um momento que o texto, por si só, não consegue autentificar. É como se o Homem precisasse da legitimação visual para encontrar o seu lugar no mundo e nem a facilidade de edição na era do digital parece retirar à fotografia a crença numa verdade que os olhos não puderam testemunhar. Ironicamente e contra a ideia do senso-comum, a História prova que a dupla essência da fotografia de ser espelho e construção do real - mesmo na imprensa - não resiste à adulteração. Seja instrumentalizada pelo poder, seja para criar dramatismo ou atribuir heroicidade em determinadas cenas, em vez do registo da realidade, a fotografia mostra uma realidade verosímil. A História também demonstra que essa subversão acontece, mas não é um procedimento consciente. Isto porque o fotógrafo de imprensa assume diversas escolhas subjetivas de enquadramento, foco e composição sobre uma cena, não com o intuito de manipular, mas para arrumar o seu olhar sobre o mundo e mostrar o acontecimento numa moldura talhada pelo código ético e deontológico da profissão e pela linha editorial do órgão de comunicação onde exerce funções. Acima de tudo, esta investigação ambiciona confirmar se a confiança que o público deposita na imagem jornalística lhe é merecida

Jogos Sérios para a Saúde

Alguns jogos têm como objectivo a competição, outros a aprendizagem, uns jogam-se em grupo, outros individualmente. No entanto, todos têm um factor comum, ou seja, a experiência que se retira do momento é única. Seja esta experiência positiva ou negativa vai servir de aprendizagem nem que seja apenas das regras e mecânicas do dispositivo. Os Serious Games simulam situações ou processos do mundo real que são elaborados com o propósito de resolver um problema. Muitas vezes estes sacrificam o divertimento e o entretenimento com o objectivo de alcançar um tipo de progresso desejado para o jogador. Tal como no passado, e tendo em conta o desenvolvimento exponencial da tecnologia, os Serious Games podem agora ter um papel fundamental no desenvolvimento de novas terapias e ferramentas de saúde. É precisamente a olhar para o presente, e com os olhos no futuro dos Serious Games aplicados à saúde, que foi desenvolvida esta investigação. Como complemento, é também apresentado o projecto Typlife. Destinado a jovens com diabetes, é um projecto académico que tem como objectivo o desenvolvimento de uma aplicação para smartphone para o controlo da diabetes, enquanto envolve o utilizador numa experiência interactiva de recompensas pelas boas práticas no dia-a-dia.

Rostos da Lusitânia: uma introdução ao retrato escultórico na Antiguidade Clássica e Antiguidade Tardia no actual território português

O retrato é um meio de alcançar a imortalidade. Tal como o nome, o rosto permanece na memória, para além da morte. O retrato é o triunfo da vida. Esta associação de ideias está muito presente na Antiguidade Clássica e Tardia, bem como nas civilizações pré-clássicas, nomeadamente na Egípcia. Uma reflexão introdutória sobre o conceito de retrato, observando-o com os olhos da Antiguidade grega, romana e da Antiguidade Tardia, é um dos objectivos deste pequeno trabalho. As palavras de José-Augusto França, “o retrato assume, por excelência, o equívoco de toda a arte figurativa ou representativa, na medida em que se refere a um modelo preciso, que tende a ser identificado”1, constituem um desafio que nos norteia nas considerações a que nos propomos com os Rostos da Lusitânia.

Medieval idade

Nota: A história da composição deste texto remonta a Julho de 1979, altura em que havia concluído o 2º ano da licenciatura em Línguas e Literaturas Modernas (Estudos Portugueses e Ingleses). Sem desprimor para os restantes docentes, a disciplina que mais me motivara fora a Literatura Inglesa I, leccionada pela Profª Leonor, cuja erudição e entusiástica energia nos desvendavam, entre outros conteúdos totalmente novos, a chamada “poesia da noite e dos túmulos” e a narrativa gótica. A influência e o potencial cenográficos dos respectivos topoi, aliados aos laivos simbolistas colhidos da Literatura Portuguesa I e ateados pelas faúlhas pseudo-poéticas dos 20 anos, ditaram este resultado, cujas limitações saltarão aos olhos do leitor mais casual e do crítico mais indulgente. Na recuperação irretocada deste texto, tantos anos volvidos, veja-se pois e apenas uma tentativa de imprimir acrescida pessoalidade à sentida homenagem que desejaria saber prestar à Profª Maria Leonor Machado de Sousa.

A intervenção dos orgãos de polícia criminal em sede de julgamento

Currently, Portugal assumes itself as a democratic rule of substantive law State, sustained by a legal system seeking the right balance between the guarantee of fundamental rights and freedoms constitutional foreseen in Portugal’s Fundamental Law and criminal persecution. The architecture of the penal code lies with, roughly speaking, a accusatory basic structure, “deliberately attached to one of the most remarkable achievements of the civilizational democratic progress, and by obedience to the constitutional commandment”, in balance with the official investigation principle, valid both for the purpose of prosecution and trial. Regarding the principle of non self-incrimination - nemo tenetur se ipsum accusare, briefly defined as the defendant’s right of not being obliged to contribute to the self-incrimination, it should be stressed that there isn’t an explicit consecration in the Portuguese Constitution, being commonly accepted in an implicit constitutional prediction and deriving from other constitutional rights and principles, first and foremost, the meaning and scope of the concept of democratic rule of Law State, embedded in the Fundamental Law, and in the guidelines of the constitutional principles of human person dignity, freedom of action and the presumption of innocence. In any case, about the (in) applicability of the principle of the prohibition of self-incrimination to the Criminal Police Bodies in the trial hearing in Court, and sharing an idea of Guedes Valente, the truth is that the exercise of criminal action must tread a transparent path and non-compliant with methods to obtain evidence that violate the law, the public order or in violation of democratic principles and loyalty (Guedes Valente, 2013, p. 484). Within the framework of the penal process relating to the trial, which is assumed as the true phase of the process, the witness represents a relevant figure for the administration of criminal justice, for the testimonial proof is, in the idea of Othmar Jauernig, the worst proof of evidence, but also being the most frequent (Jauernig, 1998, p. 289). As coadjutant of the Public Prosecutor and, in specific cases, the investigating judge, the Criminal Police Bodies are invested with high responsibility, being "the arms and eyes of Judicial Authorities in pursuing the criminal investigation..." which has as ultimate goal the fulfillment of the Law pursuing the defense of society" (Guedes Valente, 2013, p. 485). It is in this context and as a witness that, throughout operational career, the Criminal Police Bodies are required to be at the trial hearing and clarify the Court with its view about the facts relating to occurrences of criminal context, thus contributing very significantly and, in some cases, decisively for the proper administration of the portuguese criminal justice. With regards to the intervention of Criminal Police Bodies in the trial hearing in Court, it’s important that they pay attention to a set of standards concerning the preparation of the testimony, the very provision of the testimony and, also, to its conclusion. Be emphasized that these guidelines may become crucial for the quality of the police testimony at the trial hearing, thus leading to an improvement of the enforcement of justice system. In this vein, while preparing the testimony, the Criminal Police Bodies must present itself in court with proper clothing, to read before and carefully the case files, to debate the facts being judged with other Criminal Police Bodies and prepare potential questions. Later, while giving his testimony during the trial, the Criminal Police Bodies must, summing up, to take the oath in a convincing manner, to feel comfortable, to start well by convincingly answering the first question, keep an attitude of serenity, to adopt an attitude of collaboration, to avoid the reading of documents, to demonstrate deference and seriousness before the judicial operators, to use simple and objective language, to adopt a fluent speech, to use nonverbal language correctly, to avoid spontaneity responding only to what is asked, to report only the truth, to avoid hesitations and contradictions, to be impartial and to maintain eye contact with the judge. Finally, at the conclusion of the testimony, the Criminal Police Bodies should rise in a smooth manner, avoiding to show relief, resentment or satisfaction, leaving a credible and professional image and, without much formality, requesting the judge permission to leave the courtroom. As final note, it’s important to stress that "The intervention of the Police Criminal Bodies in the trial hearing in Court” encloses itself on a theme of crucial importance not only for members of the Police and Security Forces, who must welcome this subject with the utmost seriousness and professionalism, but also for the proper administration of the criminal justice system in Portugal.

Unravelling the role of alpha 2,6 sialic acid on mouse dentritic cells functions

RESUMO: As células dendríticas (CDs) são fundamentais na imunomodulação e iniciação de respostas imunes adaptativas, enquanto os ácidos siálicos (Sias) são potenciais imunomoduladores. Estas células expressam níveis elevados da sialiltransferase ST6Gal-1, que transfere Sias para a posição terminal de oligossacáridos. De facto, a maturação de CDs está associada a uma diminuição da sialilação na sua superfície celular. Apesar de ter função biológica desconhecida, a forma solúvel, extracelular de ST6Gal-1 aumenta em cancros e inflamação. Ainda assim, esta foi recentemente identificada como moduladora da hematopoiese. Considerando o importante papel das CDs na iniciação de respostas anticancerígenas, uma ligação entre a sialilação extrínseca induzida por ST6Gal-1 extracelular e o seu papel na modulação de CDs deve ser identificada. Neste trabalho hipotetizou-se que a sialilação α2,6 extrínseca de CDs diminui o seu perfil de maturação mediante ativação por lipopolissacarídeo (LPS). O objetivo principal foi sialilar extrinsecamente em α2,6 CDs da medula óssea de murganhos, avaliando os seus perfis de maturação e de libertação de citocinas, após estimulação com LPS (por Citometria de Fluxo e ELISA, respetivamente). Ao contrário da hipótese, o perfil celular não foi modulado, usando várias abordagens. Por outro lado, a consequência da falta de α2,6 Sias na maturação de CDs foi avaliada analisando: 1) CDs da medula óssea de murganhos tratadas com sialidase, 2) CDs da medula óssea e 3) CDs das vias aéreas, ambas de murganhos deficientes em ST6Gal-1, comparando com a estirpe selvagem. Estes resultados sugerem que a perta total de α2,6 Sias se relaciona com o aumento da expressão do complexo de histocompatibilidade principal de classe II. Apesar de controverso, é provável existirem mecanismos inerentes à ativação por LPS, reduzindo a eficácia de ST6Gal-1 extracelular. Por outro lado, a modificação no perfil de CDs de murganhos deficientes em ST6Gal-1 poderá relacionar-se com uma predisposição para um estado inflamatório severo. Com isto, o trabalho desenvolvido abriu futuras linhas de investigação, nomeadamente explorar outros fatores envolvidos na (de)sialilação α2,6 de CDs, podendo ter impacto em imunoterapia com uso de CDs.--------------------------ABSTRACT: Dendritic cells (DCs) are vital for immunomodulation and the initiation of adaptive immune responses, whereas sialic acids (Sias) are potential immunomodulators. These cells express high levels of sialyltransferase ST6Gal-1, responsible for transferring Sias to the terminal position of oligosaccharide chains. Indeed, DCs’ maturation is associated with decreased cell surface sialylation. Although its biological significance is unknown, the soluble, extracellular form of ST6Gal-1 increases in cancers and inflammation. However, extracellular ST6Gal-1 was recently identified as modulator of hematopoiesis. Considering that DCs play a crucial role in the initiation of a productive anti-cancer immune response, a link between extrinsic sialylation by the extracellular ST6Gal-1 on DC function needs to be investigated. We hypothesize that extrinsic α2,6 sialylation of DCs diminishes their maturation features upon lipopolysaccharide (LPS) stimulation. The main goal was to extrinsically α2,6 sialylate mice bone marrow derived DCs (BMDCs) and to evaluate their maturation and cytokine profiles upon LPS stimulation (by Flow Cytometry and ELISA, respectively). Unlike the hypothesis, we observed that BMDCs’ profile is not modulated, even using several approaches. In contrast, the consequence of lacking cell surface α2,6 Sias in DC maturation was assessed by analysing: 1) sialidase treated BMDCs, 2) BMDCs from mice lacking ST6Gal-1 and 3) DCs from mice airways, comparing wild type with ST6Gal-1 knockout mice. These results suggest that overall lack in α2,6 Sias is related with increased expression of major histocompatibility class II (MHC-II). Although appearing to be controversial findings, other intracellular mechanisms might be occurring upon LPS-induced BMDC activation, probably reducing extracellular ST6Gal-1 effect. In opposite, the modification observed in DC profile of ST6Gal-1 knockout mice might be related to its predisposition to a more severe inflammatory status. With this, the developed work opened future lines of investigation, namely exploring other factors involved in α2,6 (de)sialylation of DC, which might have influence in immunotherapy using DCs.

Non-cell autonomous neuroprotective effect of carbon monoxide : microglia-to-neuron communication

RESUMO: A isquémia cerebral é uma das doenças mais predominantes a nivel mundial, sendo uma das principais causas de mortalidade e invalidez. Parte da propagação de dano no cérebro é causado por inflamação descontrolada, causada principalmente por disfunção da microglia. Desta forma, existe a necessidade de tentar desenvolver estratégias para melhor compreender e modular as acções destas células. O monóxido de carbono (CO), é uma molécula endógena com provas dadas como anti-neuroinflamatório em vários modelos. Assim, o principal objectivo do trabalho foi o estudo do CO como um modulador da acção da microglia, com principal foco dado à comunicação entre estas células e neurónios, tentando entender se existe um efeito neuroprotector por inibição da inflamação. Um protocolo de meio condicionado foi estabelecido usando as linhas celulares BV2 e SH-SY5Y, de microglia e neurónio. A molécula CORM-A1, que liberta expontaniamente CO, foi usada como método de entrega da molécula às celulas. Demonstrámos que o pre-tratamento de células BV2 com CORM-A1 gera neuroprotecção já que reduz a morte celular de neurónios SH-SY5Y quando são incubados com meio condicionado de microglia activada em conjunto com o pró-oxidante t-BHP (tert-butil hidroperóxido). Assim, considerámos que o CO promove neuroprotecção ao inibir as acções inflamatórias da microglia. O papel anti-inflamatório da molécula CORM-A1 foi confirmado quando se verificou que pré-tratamento desta molécula em microglia BV2 limita a secreção de TNF-α mas estimula a secreção de IL-10. Por último, a CORM-A1 induziu a expressão do receptor da microglia CD200R1, molécula que participa na comunicação neurónio-microglia e fundamental para a modulação das acções inflamatórias destas últimas. Em suma, o nosso trabalho reforçou as propriedades anti-neuroinflamatórias do CO e uma capacidade de modular viabilidade neuronal através do seu efeito a nível de comunicação célula-célula. ---------------------------- ABSTRACT: Brain ischemia is a widespread disease worldwide, being one of the main causes of mortality and permanent disability. A portion of the damage that ensues following the ischemic event is caused by unrestrained inflammation, which is mainly orchestrated by exacerbated microglial activity. Hence, developing strategies for modulating microglial inflammation is a major concern nowadays. The endogenous molecule carbon monoxide (CO) has been shown to possess anti-neuroinflammatory properties using in vitro and in vivo approaches. Thus, our objective was to study CO as modulator of microglial activity, in particular in what concerns their communication with neurons, by promoting neuronal viability and limiting inflammatory output of activated microglia. A conditioned media strategy was established with BV2 microglia and SH-SY5Y neurons as cell models. CO-releasing molecule A1 (CORM-A1), a compound that releases CO spontaneously, was used as method of CO delivery to cells. We found that CORM-A1 pre-treatment in BV2 cells yields neuroprotective results, as it limits cell death when SH-SY5Y neurons are challenged with conditioned media from LPS-activated microglia and the pro-oxidant t-BHP (tert-butyl-hydroperoxide). Thus, we assumed carbon monoxide promotes neuroprotection via inhibition of microglial inflammation, displaying a non-cell autonomous role. CORM-A1 pre-treatment limited inflammation by inhibiting BV2 secretion of TNF-α and stimulating IL-10 production. These results reinforce that CO’s anti-inflammatory role confers neuroprotection, as the alterations in these cytokines occur concurrently with the increase in SH-SY5Y viability. Finally, we showed for the first time that carbon monoxide promotes the expression of CD200R1, a microglial receptor involved in neuron-glia communication and modulation of microglia inflammation. Further studies are necessary to clarify this role. Altogether, other than just highlighting CO as an anti-inflammatory and neuroprotective molecule, this work set the foundation for disclosing its involvement in cell-to-cell communication.

Avaliação do potencial anti-inflamatório, antioxidante e antimicrobiano de extratos de segurelha, salsa e coentros

Recentemente tem-se observado um crescente interesse pelo uso de plantas aromáticas, devido às inúmeras propriedades benéficas que lhes têm sido associadas, e a sua aplicação em diversas indústrias, como a indústria alimentar e farmacêutica. Este estudo incidiu sob três ervas aromáticas utilizadas comummente em Portugal: coentros, salsa e segurelha. O objetivo do mesmo foi contribuir para um melhor conhecimento das propriedades bioativas das plantas estudadas, através da determinação do seu teor em compostos fenólicos totais e em flavonoides, e avaliação das suas atividades antioxidante, antimicrobiana e anti-inflamatória. A atividade antioxidante foi determinada através de diferentes tipos de ensaios, nomeadamente avaliação da capacidade redutora, com os ensaios FRAP e CUPRAC, avaliação da capacidade de sequestro do radical DPPH• e avaliação da capacidade de sequestro do radical anião superóxido. A atividade antimicrobiana foi determinada utilizando três estirpes microbianas, Staphylococcus aureus, Escherichia coli e Candida albicans. Por sua vez, a ação anti-inflamatória foi determinada através de ensaios in-vivo apenas para a segurelha, utilizando dois modelos, um para a inflamação aguda (modelo de edema da pata induzido pela carragenina) e outro para a inflamação crónica (modelo da colite ulcerativa). Os resultados demonstraram que todos os extratos de plantas aromáticas possuem atividade antioxidante, sendo que o extrato de segurelha foi aquele que apresentou um maior teor de compostos fenólicos e flavonoides, bem como o que demonstrou possuir uma maior atividade antioxidante relativamente aos restantes extratos estudados, o que sugere o envolvimento destes compostos neste tipo de atividade antioxidante. Entre o extrato de coentros e salsa, o extracto de coentros apresentou um teor em compostos fenólicos e uma actividade antioxidante significativamente superior relativamente ao extracto de salsa. O extrato de segurelha foi o único que apresentou ação antimicrobiana, o que poderá indicar que os compostos fenólicos se encontram também interligados com esta propriedade. A atividade anti-inflamatória foi determinada apenas para o extrato de segurelha, sendo que se observou que este possui efeitos benéficos para a inflamação aguda e crónica, o que poderá estar novamente relacionado com o seu teor em fenóis e flavonoides. O efeito anti-inflamatório observado com o extrato de segurelha no modelo de colite pode ser muito útil do ponto de vista de profilaxia pois o extrato foi administrado aos animais logo a seguir à indução da colite e os resultados demonstram haver uma diminuição significativa da extensão e violência dos sinais da inflamação crónica observados no grupo controlo positivo.

Osteoclastogenesis, inflammatory cytokines and biomarkers of bone metabolism in psoriatic arthritis

RESUMO:A artrite psoriática (AP) é uma doença inflamatória crónica caracterizada por várias manifestações nas articulações, nas enteses e na pele. A formação de novo osso após inflamação nas enteses é um dos aspetos mais intrigantes desta doença. Os mecanismos celulares e moleculares deste processo ainda não são completamente conhecidos. Este estudo tem como objetivo compreender melhor os mecanismos subjacentes à formação e reabsorção óssea, bem como o efeito de anti-inflamatórios não esteroides (AINEs) nestes processos. Para atingir este objetivo foram quantificados biomarcadores do metabolismo ósseo e citocinas inflamatórias em doentes AP, antes e após terapêutica com AINEs. Os biomarcadores selecionados foram marcadores de remodelação óssea como CTX-I e P1NP, fatores de diferenciação e ativação de osteoclastos como o RANKL e a OPG, inibidores da via de sinalização Wnt, nomeadamente o DKK-1 e a SOST e ainda citocinas pro-inflamatórias como a IL-22 e a IL-23 e a prostaglandina PGE2. Neste contexto foram também estabelecidas culturas celulares de monócitos, isoladas de doentes AP e de controlos saudáveis. Os monócitos foram cultivados in vitro em condições não estimuladas e estimuladas e realizados dois ensaios funcionais: coloração com TRAP e ensaio de reabsorção. Foi observada uma diminuição nos níveis séricos de CTX-I e OPG em doentes AP em relação aos controlos. De igual forma os níveis séricos de SOST encontram-se significativamente mais baixos, em comparação com os controlos saudáveis. Estes valores de SOST são semelhantes aos dos doentes com espondilite anquilosante (EA), documentados anteriormente. Os ensaios com osteoclastos confirmaram a necessidade da presença de RANKL para estimulação da osteoclastogénese e que o celecoxib parece ter um papel inibitório neste processo. Os resultados obtidos sugerem que a população de doentes com AP analisados têm baixos níveis de reabsorção óssea e alguma atividade na formação óssea. --------------------------- ABSTRACT: Psoriatic arthritis (PsA) is a chronic inflammatory disease characterized by several manifestations involving the joints, enthesis and the skin. New bone formation after inflammation at enthesis site has been one of the most intriguing aspects of the disease. Cellular and molecular mechanisms in this process are still not completely understood. This study aims to understand better the mechanisms underlying bone formation and resorption and the effect of non-steroid anti-inflammatory drugs (NSAIDs) in these processes. To access that, biomarkers of bone metabolism and inflammatory cytokines were measured in PsA patients’ serum before and after NSAID therapy. These selected biomarkers were bone turnover markers such as CTX-I and P1NP, osteoclast differentiation and activation factors RANKL and OPG, Wnt pathway inhibitors DKK-1 and SOST and pro-inflammatory cytokines IL-22, IL-23 and prostaglandin PGE2. In this context monocyte cell culture was also established after PBMC isolation from PsA patients and healthy controls. Monocytes were cultured in vitro under unstimulated and stimulated conditions and two functional assays were performed: TRAP staining and resorption pit assay. It was demonstrated that CTX-I and OPG serum levels in PsA patients were lower than controls. SOST levels were extremely decreased in comparison with controls, resembling the ankylosing spondylitis patients results already documented. Osteoclast assays confirmed the need of RANKL in stimulating osteoclastogenesis and that celecoxib seems to have an inhibitor role in this process. The results obtained suggest that PsA patient population analyzed in this study have low bone resorption levels and some bone formation activity.

Elucidating the role of glycans in leucocyte function

RESUMO: O processo de glicosilação é a modificação pós-traducional de proteínas mais comum e está envolvido em vários processos fisiológicos e patológicos. Especificamente, certos perfis glicosídeos estão correlacionados a estados específicos de diferenciação celular, e podem modular vários eventos celulares, como sinalização celular, migração celular e interações hospedeiro-patogénio. Assim sendo, a glicosilação desempenha um papel crucial na modulação de vários processos imunológicos. No entanto, permanece por esclarecer como as estruturas glicosídicas influenciam a imunidade. Especificamente, algumas estruturas glicosídicas terminais que estão modificadas pela ligação de ácido siálico desempenham um papel importante em várias funções do sistema imune, nomeadamente migração leucocitária em contexto de inflamação e ativação de células imunes. Como tal, este trabalho teve como objectivo investigar como a expressão de certos glicanos influencia componentes importantes da resposta imune inata e adaptativa. Este trabalho está dividido em três componentes principais: 1) A imunidade está amplamente dependente da habilidade das células circulantes migrarem para os tecidos inflamados, sendo que a ligação de leucócitos à Eselectina endotelial é o primeiro passo. Assim, nós analisámos a estrutura e função dos ligandos de E-selectina que são expressos pelas células humanas mononucleares de sangue periférico (PBMCs), fornecendo novos conhecimentos para a compreensão dos intervenientes moleculares que mediam a ligação dos monócitos, células CD4+ e CD8+T e células B ao endotélio vascular. Surpreendentemente, os monócitos apresentaram maior capacidade de ligação à E-selectina comparativamente aos linfócitos. Esta observação pode ser explicada pelo facto de os monócitos humanos expressarem, uniformemente, um vasto reportório de glicoproteínas que exibem afinidade de ligação à E-selectina, nomeadamente: as glicoformas do CD43 (CD43E) e do CD44 (HCELL), em adição à já previamente reportada glicoforma da PSGL-1 (CLA). Consistentemente, a diferente capacidade que as diversas populações linfocitárias apresentam de se ligar à E-selectina, está integralmente relacionada com a sua expressão de glicoproteínas com afinidade de ligação à E-selectina. Enquanto que as células CD4+T apresentam uma elevada reatividade à E-selectina, as células CD8+T e B demonstram pouca ou nenhuma capacidade de ligação à E-selectina. Esta atividade de ligação à E-selectina das células CD4+T é conferida pela expressão de HCELL, em adição às já previamente reportadas CLA e CD43E. As células CD8+ T não expressam HCELL e apenas expressam pequenas quantidades de CLA e CD43E, enquanto que as células B não expressam ligandos de Eselectina. Mais, a exofucosilação da superfície destas células, levou ao dramático aumento da expressão dos ligandos de E-selectina em todos as populações leucocitárias, verificando-se que a criação de certos ligandos de E-selectina está dependente do tipo de célula, após fucosilação. Colectivamente, estes resultados redefinem o nosso conhecimento acerca dos mecanismos moleculares que governam o tráfico das células mononucleares de sangue periférico em contexto de inflamação. 2) A habilidade das células dendríticas (DCs) para extravasarem em locais de inflamação é crucial para o sucesso da terapia com DCs. Assim, analisámos a estrutura e função das moléculas de adesão que mediam a migração transendotelial (TEM) das DCs. Para isso, foram usadas DCs geradas a partir da diferenciação de monócitos (mo-DCS), obtidos quer pelo métodos de separação imuno-magnética de células CD14+ (CD14-S) ou por isolamento por aderência ao plástico (PA-S). Os resultados obtidos indicam que as glicoformas de ligação à Eselectina de PSGL-1, CD43 e CD44 são expressas pelas CD14-S mo-DCs, enquanto que as PA-S mo-DCs expressam apenas CLA. É importante notar que a ligação do CD44 nas mo-DCs, mas não nas PA-S mo-DCs, desencadeia a ativação e consequente adesão da VLA-4 ao endotélio na ausência de um gradiente de quimiocinas. Procedeu-se também à análise dos ligandos E-selectina expressos em mo-DCs geradas a partir de monócitos do sangue do cordão umbilical (UCB) e, inesperadamente, as UCB mo-DCs não expressam qualquer glicoproteína com reatividade à E-selectina. Além disso, a exofucosilação das mo- DCs humanas utilizando uma α(1,3)-fucosiltransferase aumenta significativamente a expressão de HCELL e, portanto, estas células apresentam uma capacidade aumentada para se ligarem à E-selectina em condições de fluxo hemodinâmico. Estes resultados destacam o papel do HCELL no desencadeamento do TEM das CD14-S mo-DCs e sugerem que estratégias para potenciar a expressão de HCELL poderão impulsionar o recrutamento de mo-DCs para locais de inflamação. 3) Outro obstáculo para alcançar o sucesso promissor de vacinas baseadas em DCs é o estabelecimento de abordagens eficientes que poderão melhorar o estado de maturação e apresentação antigénica das DCs. Por conseguinte, foram investigadas abordagens alternativas que podem superar este obstáculo. Através da remoção de ácido siálico de superfície celular das DCs, conseguiu-se induzir a maturação de DC humanas e de ratinhos. Notavelmente, tanto as DCs humanas como as de ratinho, ao serem desialiladas mostraram uma capacidade aumentada para induzir a proliferação de células T, para secretar citocinas Th1 e para induzir a morte específica de células tumorais. Em adição, as DCs desialiladas apresentam uma maior capacidade de apresentação cruzada de antigénios tumorais às células T citotóxicas. Colectivamente, o presente estudo oferece uma visão chave para optimizar a capacidade das DCs em induzir respostas imunitárias anti-tumorais, e indica que o tratamento com sialidase é uma nova tecnologia para melhorar a eficácia e aplicabilidade das vacinas baseadas em DCs. Coletivamente, os nossos resultados demostram como a glicosilação e a sua manipulação podem modular a imunidade. Concretamente, através de uma reação de exofucosilação conseguimos aumentar fortemente a capacidade de os leucócitos extravasarem para os tecidos afectados, enquanto que a remoção dos níveis de ácido siálico da superfície celular das DCs, induz potentes respostas anti-tumorais mediadas por células T citotóxicas. ------------------------------------ ABSTRACT: Glycosylation is the most widely form of protein post-translational modification and is involved in many physiological and pathological processes. Specifically, certain patterns of glycosylation are associated with determined stages of cell differentiation and can modulate processes like cell-signaling and migration and host-pathogen interactions. As such, glycosylation plays a crucial role in the modulation of several immune events. However, how glycans execute this immune-modulation and, therefore, influence immunity is still poorly unknown. Specifically, some terminal sialic acid-modified determinants are known to be involved in several physiological immune processes, including leukocyte trafficking into sites of inflammation and cell immune activation. Therefore, in this work, we sought to investigate more deeply how the expression of these glycosidic structures affects events form both innate and adaptive immune responses. To this end, we divided our work into three main parts: 1) Immunity critically depends on the ability of sentinel circulating cells to infiltrate injured sites, of which leukocyte binding to endothelial E-selectin is the critical first step. Thus, we first analyzed the structure and function of the E-selectin ligands expressed on native human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), providing novel insights into the molecular effectors governing adhesion of circulating monocytes, and of circulating CD4+T, CD8+T and B cells, to vascular endothelium under hemodynamic shear conditions. Strikingly, monocytes show a higher ability to tether and roll on endothelial cells than lymphocyte subsets. This is due to the fact that human circulating monocytes uniformly display a wide repertoire of E-selectin binding glycoproteins, namely the E-selectin-binding glycoforms of CD43 (CD43E) and CD44 (HCELL), in addition to the previously described E-selectin-binding glycoform of PSGL-1 (CLA). In addition, we also observed a differential ability of the different lymphocyte subsets to bind to Eselectin under hemodynamic shear stress conditions, and these differences were highly correlated with their individual expression of E-selectin binding glycoproteins. While CD4+T cells show a robust E-selectin binding ability, CD8+T and B cells show little to no E-selectin reactivity. CD4+T cell potent Eselectin rolling activity is conferred by HCELL expression, in addition to the previously reported E-selectin-binding glycoproteins CD43E and CLA. CD8+T cells display no HCELL and low amounts of CLA and CD43E, whereas B cells lack E-selectin ligand expression. Moreover, enforced exofucosylation of cell surface of these cells noticeably increases expression of functional E-selectin ligands among all leukocytes subsets, with cell type-dependent specificity in the protein scaffolds that are modified. Taken together, these findings redefine our understanding of the molecular mechanisms governing the trafficking patterns of PBMCs that are relevant in the context of acute or chronic inflammatory conditions. 2) The ability of circulating dendritic cells (DCs) to extravasate at inflammatory sites is critical to the success of DC-based therapies. Therefore, we assessed the structure and function of adhesion molecules mediating the transendothelial migration (TEM) of human monocyte derived-DCs (mo-DCs), obtained either by CD14 positive immune-magnetic selection (CD14-S) or by plastic adherence of blood monocytes (PA-S). We report for the first time that the E-selectin binding glycoforms of PSGL-1, CD43 and CD44 are all expressed on CD14-S mo-DCs, in contrast to PA-S mo-DCs that express only CLA. Importantly, CD44 engagement on CD14-S mo-DCs, but not on PA-S mo-DCs, triggers VLA-4-dependent adhesiveness and programs TEM in absence of chemokine gradient. We also analyzed the E-selectin ligands expressed on mo-DCs generated from umbilical cord blood (UCB) monocytes, and unexpectedly, UCB mo-DCs do not express any glycoprotein with E-selectin reactivity. Furthermore, exoglycosylation of human mo-DCs using an α(1,3)-fucosyltransferase significantly increases expression of HCELL, and therefore exofucosylated mo-DCs exhibit an augmented ability to bind to E-selectin under hemodynamic shear stress conditions. These findings highlight a role for HCELL engagement in priming TEM of CD14-S mo-DCs, and suggest that strategies to enforce HCELL expression could boost mo-DC recruitment to inflammatory sites. 3) Another obstacle to achieve the promising success of DC-based vaccines is the establishment of efficient approaches that could successfully enhance maturation and cross-presentation ability of DCs. Therefore, we investigated an alternative approach that can overcome this problem. Through removal of sialic acid content from DC cell surface we are able to elicit maturation of both human and mouse DCs. Notably, desialylated human and murine DCs showed enhanced ability to induce autologous T cell to proliferate, to secrete Th1 cytokines and to kill tumor cells. Moreover, desialylated DCs display enhanced cross-presentation of tumor antigens to cytotoxic CD8+ T cells. Collectively, this study offers key insight to optimize the ability of DCs to boost anti-tumor immune responses, and indicates that the treatment with an exogenous sialidase is a powerful new technology to improve the efficacy and applicability of DC-based vaccines. Overall, our findings show how glycosylation and its manipulation can modulate immunity. Concretely, through an exofucosylation reaction we are able to greatly augment the ability of leukocytes to extravasate into injured tissues, while removal of sialic acid moieties from cell surface of DCs, significantly potentiate their ability to induce anti-tumor cytotoxic T cell-mediate responses.

The role of s-nitrosothiols and rho-kinase 1 in glucose and lipid metabolism

RESUMO: Na sociedade contemporânea a diabetes tipo 2 e a obesidade estão a aumentar exponencialmente, representando um grave problema de saúde pública. De acordo com a IDF “A diabetes e a obesidade são o principal problema de saúde pública do século XXI’. Para além destas duas patologias, a prevalência de esteatose hepática não-alcoólica (NAFLD), entre a população obesa e diabética, é de cerca de 90%. O aumento da obesidade, diabetes e NAFLD tem uma forte correlação com o aumento do consumo de gorduras e açúcares, acompanhado de um decréscimo acentuado da actividade física. A obesidade, diabetes e NAFLD tem sido escrupolosamente investigada mas as terapêuticas disponíveis continuam a ser muito limitadas. Tendo em conta o número crescente e alarmante de obesos e diabéticos o conhecimento detalhado da patofisiologia da obesidade, diabetes e NAFLD, tendo em vista a necessidade extrema de desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas, é da mais elevada urgência. O fígado é reconhecido como um orgão primordial no controlo da homeostase. No estado pós-prandial, o fígado converte a glucose em glicogénio e lípidos. Em contraste, no estado de jejum, o fígado promove a produção de glucose. Sistemas neuronais e hormonais, bem como o estado metabólico do fígado, controlam de forma muito precisa a alternância entre os diferentes substratos metabólicos, dependente do estado prandial. A insulina tem um papel central no controlo do metabolismo energético no fígado; se, por um lado, inibe a produção hepática de glucose e corpos cetónicos, por outro, promove a glicólise e a lipogénese. O metabolismo energético no fígado é também regulado por vários factores de transcrição e co-reguladores que, por sua vez, são regulados pela insulina, glucagina e outras hormonas metabólicas. Em conjunto, todos estes factores e reguladores vão controlar de forma muito estreita a gluconeogénese, a β-oxidação e a lipogénese, no fígado. Para além dos já conhecidos reguladores do metabolismo hepático, novas moléculas têm sido estudadas como tendo um papel fundamental na regulação do metabolismo energético no fígado. Qualquer desequilíbrio no metabolismo hepático vai contribuir para a insulino-resistência, NAFLD e diabetes tipo 2. O principal objectivo do trabalho de investigação aqui apresentado é o contributo para o estudo detalhado da patogénese da diabetes e obesidade, num contexto de dietas ricas em açúcares e gorduras, e com a perspectiva de explorar novas estratégias terapêuticas. Os objectivos específicos deste trabalho eram: primeiro, determinar se o tratamento com glutationo (GSH) e óxido nítrico (NO) era suficiente para melhorar a insulino-resistência associada ao elevado consumo de sacarose; segundo, determinar o papel da Rho-kinase 1 (ROCK1) na regulação do metabolismo hepático da glucose e dos lípidos; e terceiro, estudar o efeito do metilsulfonilmetano (MSM) em doenças metabólicas associadas à obesidade. Na primeira parte deste trabalho de investigação foram utilizados ratos Wistar machos sujeitos a uma dieta rica em sacarose (HS). Tal como esperado, estes animais apresentavam insulino-resistência e hiperinsulinémia. A dieta HS levou ao aumento dos níveis hepáticos de NO e ao decréscimo dos níveis de GSH no fígado. Em jejum, a administração intraportal de GSH e NO, a animais saudáveis promoveu um aumento significativo da sensibilidade à insulina. Também nestes animais, a administração intravenosa de S-nitrosotióis, compostos orgânicos que contém um grupo nitroso acoplado a um átomo de enxofre de um tiol, promoveu o aumento significativo da sensibilidade à insulina. Pelo contrário, em animais sujeitos à dieta HS, as doses padrão de GSH + NO e de S-nitrosotióis não conseguiram promover o aumento da sensibilidade à insulina. No entanto, ao aumentar a dose de S-nitrosotióis administrados por via intravenosa, foi possível observar o aumento da sensibilidade à insulina dependente da dose, indicando um possível papel dos S-nitrosotióis como sensibilizadores de insulina. O estudo detalhado do papel dos S-nitrosotióis na via de sinalização da insulina revelou que há um aumento da fosforilação do receptor da insulina (IR) e da proteína cinase B (Akt), sugerindo um efeito dos S-nitrosotióis nesta via de sinalização. Os resultados apresentados nesta primeira parte sugerem que os S-nitrosotióis promovem a correcta acção da insulina, podendo vir a ser importantes alvos terapêuticos. Na segunda parte deste trabalho de investigação utilizámos murganhos, com uma delecção específica da ROCK1 no fígado, e sujeitos a uma dieta rica em lípidos (HFD). Foi possível concluir que a ausência da ROCK1 no fígado previne a obesidade, melhora a sensibilidade à insulina e protege contra a esteatose hepática. A ausência de ROCK1 no fígado levou a um decréscimo significativo da expressão génica de genes associados à lipogénese, com uma diminuição acentuada do fluxo metabólico associado a esta via. Pelo contrário, a sobreexpressão de ROCK1, exclusivamente no fígado, promove a insulino-resistência e a esteatose hepática no contexto de obesidade induzida pela dieta. Para além disto, a delecção da ROCK1 no fígado de animais obesos e diabéticos, os murganhos deficientes em leptina, corroborou os dados obtidos no primeiro modelo animal, com a franca melhoria da hiperglicémia, hiperinsulinémia e esteatose hepática. Os dados que compõem esta parte do trabalho de investigação sugerem que a ROCK1 tem um papel crucial na regulação do metabolismo lipídico. Na terceira e última parte deste trabalho de investigação foi investigado o efeito do composto metilsulfunilmetano (MSM), um composto organosulfúrico naturalmente presente em plantas e utilizado também como suplemento dietético, em murganhos obesos e insulino-resistentes, por exposição a uma dieta rica em lípidos (DIO). O tratamento com MSM melhorou a insulino-resistência e protegeu contra a esteatose hepática. O conteúdo hepático em triglicéridos e colesterol também diminuíu de forma significativa nos animais DIO sujeitos ao tratamento com MSM, bem como a expressão génica associada à lipogénese. Para além disto, o tratamento com MSM levou a uma diminuição da expressão génica associada à inflamação. De realçar que o tratamento com MSM levou a uma melhoria do perfil hematopoiético destes animais, tanto na medula óssea como no sangue. Para comprovar o efeito benéfico do MSM na obesidade e insulino-resistência utilizámos murganhos deficientes no receptor da leptina, e por isso obesos e diabéticos, tendo observado um perfil semelhante ao obtido para murganhos sujeitos a uma dieta rica em lípidos e tratados com MSM. Concluímos, através dos dados recolhidos, que o MSM como suplemento pode ter efeitos benéficos na hiperinsulinémia, insulino-resistência e inflamação que caracterizam a diabetes tipo 2. Em resumo, os dados obtidos neste trabalho de investigação mostram que os S-nitrosotióis podem ter um papel importante como sensibilizadores da insulina, promovendo um aumento da sensibilidade à insulina num contexto de dietas ricas em sacarose. Para além disto, estudos in vitro, sugerem que os S-nitrosotióis regulam, especificamente, a via de sinalização da insulina. Este trabalho teve também como objectivo o estudo da ROCK1 como regulador do metabolismo da glucose e dos lípidos no fígado. Através do estudo de animais com uma delecção ou uma sobreexpressão da ROCK1 no fígado mostrou-se que esta tem um papel crucial na patogénese da obesidade e diabetes tipo 2, especificamente através do controlo da lipogénese de novo. Finalmente, foi também objectivo deste trabalho, explorar o efeito do MSM em animais DIO e deficientes em leptina. O tratamento com MSM protege de forma evidente contra a obesidade e insulino-resistência, com especial enfâse para a capacidade que esta molécula demonstrou ter na protecção contra a inflamação. Em conjunto os vários estudos aqui apresentados mostram que tanto os S-nitrosotióis como a ROCK1 têm um papel na patogénese da obesidade e diabetes tipo 2 e que a utilização de MSM como suplemento às terapêuticas convencionais pode ter um papel no tratamentos de doenças metabólicas.-------------------------------ABSTRACT: In modern western societies type 2 diabetes and obesity are increasing exponentially, representing a somber public concern. According to the International Diabetes Federation (IDF) ‘Diabetes and Obesity are the biggest public health challenges of the 21st century’. Aside from these the prevalence of nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD), among the diabetic and obese population, is as high as 90%. It is now well established that the increase in obesity, diabetes and NAFLD strongly correlates with an increase in fat and sugar intake in our diet, alongside physical inactivity. The pathogenesis of obesity, diabetes and NAFLD has been thoroughly studied but the treatment options available are still narrow. Considering the alarming number in the obese and diabetic population the complete understanding of the pathogenesis, keeping in mind that new therapeutic strategies need to be attained, is of the highest urgency. The liver has been well established as a fundamental organ in regulating whole-body homeostasis. In the fed state the liver converts the glucose into glycogen and lipids. Conversely, in the fasted state, glucose will be produced in the liver. Neuronal and hormonal systems, as well as the hepatic metabolic states, tightly control the fast to fed switch in metabolic fuels. Insulin has a central role in controlling hepatic energy metabolism, by suppressing glucose production and ketogenesis, while stimulating glycolysis and lipogenesis. Liver energy metabolism is also regulated by various transcription factors and coregulators that are, in turn, regulated by insulin, glucagon and other metabolic hormones. Together, these regulators will act to control gluconeogenesis, β-oxidation and lipogenesis in the liver. Aside from the well-established regulators of liver energy metabolism new molecules are being studied has having a role in regulating hepatic metabolism. Any imbalance in the liver energy metabolism is a major contributor to insulin resistance, NAFLD and type 2 diabetes. The overall goal of this research work was to contribute to the understanding of the pathogenesis of diabetes and obesity, on a setting of high-sucrose and high-fat diets, and to explore potential therapeutic options. The specific aims were: first, to determine if treatment with glutathione (GSH) and nitric oxide (NO) was sufficient to ameliorate insulin resistance induced by high-sucrose feeding; second, to determine the physiological role of rho-kinase 1 (ROCK1) in regulating hepatic and lipid metabolism; and third, to study the effect of methylsulfonylmethane (MSM) on obesity-linked metabolic disorders. In the first part of this research work we used male Wistar rats fed a high-sucrose (HS) diet. As expected, rats fed a HS diet were insulin resistant and hyperinsulinemic. HS feeding increased hepatic levels of NO, while decreasing GSH. In fasted healthy animals administration of both GSH and NO, to the liver, was able to increase insulin sensitivity. Intravenous administration of S-nitrosothiols, organic compounds containing a nitroso group attached to the sulfur atom of a thiol, in fasted control animals also increased insulin sensitivity. Under HS feeding the standard doses of GSH + NO and S-nitrosothiols were unable to promote an increase in insulin sensitivity. However, the intravenous administration of increasing concentrations of S-nitrosothiols was able to restore insulin sensitivity, suggesting that S-nitrosothiols have an insulin sensitizing effect. Investigation of the effect of S-nitrosothiols on the insulin signaling pathway showed increased phosphorylation of the insulin receptor (IR) and protein kinase B (Akt), suggesting that S-nitrosothiols may have an effect on the insulin signaling pathway. Together, these data showed that S-nitrosothiols promote normal insulin action, suggesting that they may act as potential pharmacological tools. In the second part of this research work we used liver-specific ROCK1 knockout mice fed a high-fat (HF) diet. Liver-specific deletion of ROCK1 prevented obesity, improved insulin sensitivity and protected against hepatic steatosis. Deficiency of ROCK1 in the liver caused a significant decrease in the gene expression of lipogenesis associated gene, ultimately leading to decreased lipogenesis. Contrariwise, ROCK1 overexpression in the liver promoted insulin resistance and hepatic steatosis in diet-induced obesity. Furthermore, liver-specific deletion of ROCK1 in obese and diabetic mice, the leptin-deficient mice, improved the typical hyperglycemia, hyperinsulinemia and liver steatosis. Together, these data identify ROCK1 as a crucial regulator of lipid metabolism. In the third and final part of this research work we investigated the effect of MSM, an organosulfur compound naturally found in plants and used as a dietary supplement, on diet-induced obese (DIO) and insulin resistant mice. MSM treatment ameliorated insulin resistance and protected against hepatosteatosis. Hepatic content in triglycerides and cholesterol was significantly decreased by MSM treatment, as well as lipogenesis associated gene expression. Furthermore, MSM treated mice had decreased inflammation associated gene expression in the liver. Importantly, FACS analysis showed that MSM treatment rescued the inflammatory hematopoietic phenotype of DIO mice in the bone marrow and the peripheral blood. Moreover, MSM treatment of the obese and diabetic mice, the leptin-deficient mice, resulted in similar effects as the ones observed for DIO mice. Collectively, these data suggest that MSM supplementation has a beneficial effect on hyperinsulinemia, insulin resistance and inflammation, which are often found in type 2 diabetes. In conclusion, this research work showed that S-nitrosothiols may play a role as insulin sensitizers, restoring insulin sensitivity in a setting of high-sucrose induced insulin resistance. Furthermore, in vitro studies suggest that S-nitrosothiols specifically regulate the insulin signaling pathway. This research work also investigated the role of hepatic ROCK1 in regulation of glucose and lipid metabolism. Using liver-specific ROCK 1 knockout and ROCK1 overexpressing mice it was shown that ROCK1 plays a role in the pathogenesis of obesity and type 2 diabetes, specifically through regulation of the de novo lipogenesis pathway. Finally, this research work aimed to explore the effect of MSM in DIO and leptin receptor-deficient mice. MSM strongly protects against obesity and insulin resistance, moreover showed a robust ability to decrease inflammation. Together, the individual studies that compose this dissertation showed that S-nitrosothiols and ROCK1 play a role in the pathogenesis of obesity and type 2 diabetes and that MSM supplementation may have a role in the treatment of metabolic disorders.

O azulejo barroco – o estudo e a investigação em Portugal

O azulejo é um elemento notavelmente caracterizador da arquitectura portuguesa atravessando uma parte importante da nossa produção arquitectónica e estando naturalmente contaminado pela produção artística de cada época. É o século XVIII o período em que se veicula o azulejo em Portugal e onde nos surgem os principais repositórios de imaginários. Suporte privilegiado de pintura e arte decorativa total, apresentou‑se sempre como uma resposta simultaneamente estética e pratica às necessidades de cada tempo. Uma das questões indiscutíveis é a atmosfera que o azulejo barroco impõe, reinventando e recriando um espaço, por vezes difícil de entrever hoje, aos nossos olhos. São actualmente inúmeras as questões que se colocam ao estudo e respectiva análise de interpretação da azulejaria tanto neste período como em outros. Procurámos traçar neste texto – numa visão panorâmica e alargada – a historiografia mais recente do azulejo barroco, incluindo os estudos, e os novos contributos que têm feito da Azulejaria Portuguesa deste período um lugar de inquietações e objecto de investigação.