The Natural Cell-Penetrating Peptide Crotamine Targets Tumor Tissue in Vivo and Triggers a Lethal Calcium-Dependent Pathway in Cultured Cells

Our goal was to demonstrate the in vivo tumor specific accumulation of crotamine, a natural peptide from the venom of the South American rattlesnake Crotalus durissus terrificus, which has been characterized by our group as a cell penetrating peptide with a high specificity for actively proliferating cells and with a concentration-dependent cytotoxic effect. Crotamine cytotoxicity has been shown to be dependent on the disruption of lysosomes and subsequent activation of intracellular proteases. In this work, we show that the cytotoxic effect of crotamine also involves rapid intracellular calcium release and loss of mitochondrial membrane potential as observed in real time by confocal microscopy. The intracellular calcium overload induced by crotamine was almost completely blocked by thapsigargin. Microfluorimetry assays confirmed the importance of internal organelles, such as lysosomes and the endoplasmic reticulum, as contributors for the intracellular calcium increase, as well as the extracellular medium. Finally, we demonstrate here that crotamine injected intraperitoneally can efficiently target remote subcutaneous tumors engrafted in nude mice, as demonstrated by a noninvasive optical imaging procedure that permits in vivo real-time monitoring of crotamine uptake into tumor tissue. Taken together, our data indicate that the cytotoxic peptide crotamine can be used potentially for a dual purpose: to target and detect growing tumor tissues and to selectively trigger tumor cell death.

BJcuL, a lectin purified from Bothrops jararacussu venom, induces apoptosis in human gastric carcinoma cells accompanied by inhibition of cell adhesion and actin cytoskeleton disassembly

We show that BJcuL, a lectin purified from Bothrops jararacussu venom, exerts cytotoxic effects to gastric carcinoma cells MKN45 and AGS. This effect was due to the direct interaction with specific glycans on the cells surface and was observed by cell viability decrease, disorganization of actin filaments and apoptosis. In addition, BJcuL was able to reduce tumor cell adhesion to matrigel, what was inhibited by specific carbohydrate or partially inhibited when cells were pre-incubated with matrigel. Our results suggest that BJcuL was able to promote apoptosis in both tumor cells lines and therefore has a prospect for potential use in cancer therapy. (C) 2011 Elsevier Ltd. All rights reserved.

Die Synthese von Glycopeptiden und Glycopeptid-Protein-Konjugaten mit einer Partialstruktur des tumorassoziierten Mucins MUC1 zur Entwicklung von Tumorvakzinen

„Synthese von Glycopeptiden und Glycopeptid-Protein-Konjugaten mit einer Partialstruktur des tumorassoziierten Mucins MUC1 zur Entwicklung von Tumorvakzinen“ Das Glycoprotein MUC1 ist in Tumorepithelzellen sonderlich stark überexprimiert und wegen der vorzeitig einsetzenden Sialylierung sind die Saccharid-Epitope der O-Glycanketten stark verkürzt (sog. tumorassoziierte Antigene). Dadurch werden auch bisher verborgene Peptidepitope des Glycoprotein-Rückgrates auf der Zelloberfläche der Epithelzellen zugänglich, die als fremd von den Zellen des Immunsystems erkannt werden können. Dies macht das MUC1-Zelloberfächenmolekül zu einem Zielmolekül in der Entwicklung von Tumorvakzinen. Diese beiden strukturellen Besonderheiten wurden in der Synthese von Glycohexadecapeptiden verbunden, indem die veränderten tumorassoziierten Saccharidstrukturen TN-, STN- und T-Antigen als Glycosylaminosäure-Festphasenbausteine synthetisiert wurden und in das Peptidepitop der Wiederholungseinheit des MUC1 durch Glycopeptid-Festphasensynthese eingebaut wurden. Wegen der inhärenten schwachen Immunogenität der kurzen Glycopeptide müssen die synthetisierten Glycopeptidstrukturen an ein Trägerprotein, welches das Immunsystem stimuliert, gebunden werden. Zur Anbindung der Glycopeptide ist ein selektives Kupplungsverfahren nötig, um definierte und strukturell einheitliche Glycopeptid-Protein-Konjugate zu erhalten. Es konnte eine neue Methode entwickelt werden, bei der die Konjugation durch eine radikalische Additionsreaktion von als Allylamide funktionalisierten Glycopeptiden an ein Thiol-modifiziertes Trägerprotein erfolgte. Dazu wurde anhand von synthetisierten, als Allylamide modifizierten Modellaminosäuren untersucht, ob diese Reaktion generell für eine Biokonjugation geeignet ist und etwaige Nebenreaktionen auftreten können. Mit dieser Methode konnten verschiedene MUC1-Glycopeptid-Trägerprotein-Konjugate hergestellt werden, deren immunologische Untersuchung noch bevorsteht. Das tumorassoziierte MUC1 nimmt in der immundominanten Region seiner Wiederholungseinheit eine knaufartige Struktur ein. Für die Entwicklung von selektiven Tumorvakzinen ist es von großer Bedeutung möglichst genau die Struktur der veränderten Zelloberflächenmoleküle nachzubilden. Durch die Synthese von cyclischen (Glyco)Peptiden wurde dieses Strukturelement fixiert. Dazu wurden olefinische Aminosäure Festphasenbausteine hergestellt, die zusammen mit den oben genannten Glycosylaminosäuren mittels einer Glycopeptid-Festphasensynthese in acyclische Glycopeptide eingebaut wurden. Diese wurden dann durch Ringschlussmetathese zyklisiert und im Anschluss reduziert und vollständig deblockiert. In einem dritten Projekt wurde der Syntheseweg zur Herstellung einer C-Glycosylaminosäure mit einer N-Acetylgalactosamin-Einheit entwickelt. Wichtige Schritte bei der von Glucosamin ausgehenden Synthese sind die Keck-Allylierung, eine Epimerisierung, die Herstellung eines Brom-Dehydroalanin-Derivates und eine B-Alkyl-Suzuki-Miyaura-Kreuzkupplung sowie Schutzgruppenoperationen. Der racemische Baustein konnte dann in der Peptid-Festphasensynthese eines komplexen MUC1-Tetanustoxin-Konjugates eingesetzt werden.

Untersuchungen zur selektiven Deletion alloreaktiver Spender-T- Lymphozyten durch CD178-modifizierte dendritische Zellen im Rahmen der allogenen Blutstammzelltransplantation

Eine der häufigsten Komplikationen bei der allogenen Blutstammzelltransplantation stellt die Transplantat-gegen-Wirt-Erkrankung (Graft versus Host Disease, GvHD) dar. Sie wird durch allogene Spender-T-Lymphozyten verursacht, die Gewebe des Transplantatempfängers erkennen und inflammatorische Entzündungsprozesse auslösen. Neben dieser Alloreaktivität induzieren Spender-T-Lymphozyten jedoch auch immuntherapeutisch erwünschte Transplantat-gegen-Leukämie-Reaktionen (Graft versus Leukemia, GvL-Reaktion), bei denen residuelle Tumor- bzw. Leukämiezellen im Patienten durch Spender-T-Zellen spezifisch erkannt und eliminiert werden. Im Rahmen einer verbesserten Immmuntherapie wird daher versucht, GvHD-reaktive und GvL-reaktive Spender-T-Lymphozyten effizient voneinander zu separieren und so eine wirkungsvolle GvHD-Prophylaxe bzw. optimierte GvL-Induktion zu erreichen. In diesem Kontext war es Ziel dieser Arbeit, murine dendritische Zellen (DZ) so zu modifizieren, daß sie für die spezifische Deletion alloreaktiver T-Zellen in murinen GvHD/GvL-Tiermodellen eingesetzt werden können. Die Modifikation der DZ sollte dazu führen, daß über das CD95/CD178-System Aktivierungs-induzierter Zelltod (activation induced cell death, AICD) in alloreaktiven T-Zellen ausgelöst wird. Hierzu wurden für die Modifikation der DZ zwei verschiedene Mechanismen angewandt: a) die Transfektion der DZ mit CD178-mRNA sowie b) die zielgerichtete Immobilisierung von hCD178-X-Fusionsproteinen auf Oberflächenmolekülen von DZ bzw. T-Zellen. Als Positivkontrolle für die Induktion CD95-vermittelter Apoptose diente der agonistische anti-CD95-Antikörper Jo2. Bei der Transfektion muriner DZ mit mRNA zeigte sich anhand des Reportergens EGFP, daß aus dem Knochenmark generierte DZ mit hoher Effizienz mit EGFP-mRNA transfizierbar waren. Im Falle von hCD178-mRNA führte die Transfektion jedoch zu einer insuffizienten CD178-Expression, die mit den regulatorischen Eigenschaften der zytoplasmatischen CD178-Region in Verbindung gebracht werden konnte. So führte die Verwendung einer zytoplasmatisch trunkierten Form der CD178-mRNA (CD178Dzyt) zu einer durchflußzytometrisch nachweisbaren CD178-Expression in DZ. Mit diesen CD178Dzyt-exprimierenden DZ konnte in einem Proliferationstest die Proliferation alloreaktiver T-Zellen inhibiert werden. Die Beladung von DZ bzw. von T-Zellen mit hCD178-X-Fusionsproteinen führte in vitro ebenfalls zu einer deutlichen Reduktion von Alloreaktivität. Dabei konnte eine spezifische Deletion/Inhibition alloreaktiver T-Zellen nachgewiesen werden. Die Elimination alloreaktiver T-Zellen erfolgte in beiden Verfahren über AICD. Darüber hinaus wurde eine Bifunktionalität der Fusionsproteine festgestellt, da sie neben der Induktion CD95-vermittelter Apoptose auch in der Lage waren, die Kostimulation allogener T-Zellen effizient zu inhibieren. Mit Hilfe adoptiver T-Zell-Transferexperimente konnten abschließend die in vitro gewonnenen Ergebnisse in vivo in zwei verschiedenen GvHD-Mausmodellen bestätigt werden.

Wirkmechanismen der trifunktionalen Antikörper catumaxomab und ertumaxomab in humanen Tumorsphäroid-Kokulturen

Ein neuer Ansatz der immunologischen Krebstherapie ist die Verwendung der bispezifischen, trifunktionalen Antikörper catumaxomab (anti-EpCAM x anti-CD3) und ertumaxomab (anti-Her2/neu x anti-CD3). Die Bispezifität besteht in der Bindung eines Tumor-assoziierten Antigens (EpCAM bzw. Her2/neu) und des CD3 Moleküls auf der Oberfläche von T-Zellen. Darüber hinaus stellt die Interaktion des Fc-Teils mit FcγRI/IIa/III positiven akzessorischen Immunzellen die dritte Funktion der Antikörper dar. Diese einzigartige Kombination ermöglicht theoretisch die Ausbildung eines Tri-Zell-Komplexes. In klinischen Studien konnte bereits die Wirksamkeit beider Antikörper nachgewiesen werden. Die eigentlichen Wirkmechanismen der trifunktionalen Antikörper jedoch sind noch nicht ausreichend bekannt. Um die Wechselwirkung zwischen den stark EpCAM- und schwach Her2/neu-positive FaDu- sowie den stabil mit humanem Her2/neu transfizierten FaDu E593-Tumorzellen, peripheren Blutmonozyten (PBMC) und trifunktionalen Antikörpern systematisch zu untersuchen wurde ein 3D-Tumormodell, die so genannten multizellulären Tumorsphäroide (MCTS), angewandt. Als Endpunkte zur Beurteilung der Therapieeffizienz dienten das Volumenwachstum der Sphäroide, sowie die Klonogenität und die Zellvitalität. Zur Beurteilung der PBMC-Penetration in die Sphäroide erfolgten immunhistochemische Färbungen und molekularbiologische Nachweise der Abwehrzellantigene. Entsprechend wurden in den Sphäroiden die Proliferationsrate über eine Ki67-Färbung sowie die Apoptoserate über eine FragEL-Markierung identifiziert. Die Aktivität der PBMC wurde durch die Bestimmung ausgewählter Zytokine (ELISA) und der Zellzahl aus den Medienüberständen charakterisiert. Die an den FaDu- und E593-Sphäroiden erzielten Ergebnisse zeigten, dass catumaxomab und ertumaxomab eine konzentrations- und zeitabhängige Abnahme des Sphäroidvolumens bewirkten. Die Schrumpfung der Tumorsphäroide ging mit einer Reduktion des proliferativen und mit einer Steigerung des apoptotischen Tumorzellanteils einher. Die histologischen Befunde weisen darauf hin, dass die Volumenreduktion durch eine gesteigerte Anzahl infiltrierender Leukozyten bedingt ist. Auf verschiedenen Methoden basierende Analysen der Immunzellsubtypen zeigten eine dominierende Infiltration von zytotoxischen T-Zellen in die Tumorsphäroide. Der Aktivitätsnachweis der T-Zellen wurde über die Detektion der IL-2 mRNA und des sekretierten Zytokins erbracht. Einen zusätzlichen Hinweis auf eine zelluläre Immunantwort liefert das Zytokinmuster mit hohen Konzentrationen an IFN-γ. Der direkte Vergleich beider Antikörper zeigte, dass der anti-tumorale Effekt abhängig von der Antigenexpression auf den Tumorzellen war. Die Analyse von Medienüberständen wies auf eine mehrheitlich höhere Zytokinausschüttung in Gegenwart des Tumorantigens hin. Sphäroid-Kokulturen, die mit dem parentalen anti-EpCAM Antikörper behandelt wurden, zeigten keine Volumenreduktion. Im Gegensatz dazu führte der parentale CD3-Antikörper, das CD3- und Tumorzell-bindende catumaxomab F(ab')2 Fragment oder eine Kombination beider parentaler Antikörper zu einer anti-tumoralen Wirkung, die jedoch nicht so stark war wie die des trifunktionalen Antikörpers catumaxomab. Demnach ist für catumaxomab gezeigt, dass für die Effektivität des Antikörpers die Trifunktionalität unabdingbar ist. Daraus leitet sich ab, dass die Aktivierung der Abwehrzellen durch kostimulatorische Signale notwendig ist und über die Tumorantigenbindung Mechanismen wie ADCC (antibody-dependent cellular cytotoxicity) zum Tragen kommen. Die Experimente mit gleichzeitiger Gabe von trifunktionalen Antikörpern und Immunsuppressiva haben gezeigt, dass eine Kombination beider Agenzien möglich ist. Die Konzentrationen sind jedoch sorgfältig derart zu wählen, dass die Zytokinausschüttung und die damit verbundenen Nebenwirkungen reduziert sind, ohne dass die anti-tumorale Wirkung der Antikörper maßgeblich beeinflusst wird. T-Zellen bedienen sich nach Aktivierung für die rasche Proliferation einer gesteigerten aeroben Glykolyse. Unter Behandlung der Kokulturen mit catumaxomab konnte im Vergleich zu anderen immunstimulatorischen Agenzien die größte Steigerung der Laktatproduktion bzw. der Azidifizierungs- und Sauerstoffverbrauchsrate detektiert werden. Diese Effekte weisen auf eine metabolische Aktivierung der PBMC durch catumaxomab hin. Das von den Tumorzellen abgegebene Laktat kann die Immunzellen jedoch inhibieren. Daher wäre die Kombination mit Glykolyseinhibitoren ein möglicher Ansatz, um die Therapieeffizienz weiter zu steigern. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass eine Komedikation der trifunktionalen Antikörper mit Chemotherapeutika zu einer gesteigerter Wirkung führte. Insgesamt liegt die Zukunft der Immuntherapien wohl in der Kombination mit anderen Wirkstoffklassen, die anti-tumorale Effekte verstärken oder immunsupprimierende Mechanismen inhibieren.

Synthese und immunologische Evaluierung von Antitumor-Impfstoffen aus dem epithelialen tumorassoziierten Mucin MUC1

Eine Immuntherapie von Tumorerkrankungen, die mit Hilfe von Antitumorimpfstoffen prophylaktisch und therapeutisch erfolgen könnte, wäre eine attraktive Alternative zu den bisher angewendeten Krebsbehandlungen. Aufgrund charakteristisch veränderter Aktivitäten von Glycosyltransferasen in der Glycoprotein-Biosynthese werden auf malignen Zellen stark verkürzte, frühzeitig sialylierte mucinartige Glycoproteine exprimiert. Diese verkürzten Kohlenhydrate repräsentieren tumorassoziierte Antigene. Sie haben zur Folge, dass Peptidepitope der Mucin-Glycoproteine, die auf gesundem Gewebe durch den hohen Glycosylierungsgrad maskiert sind, für das Immunsystem freiliegen. Diese Strukturunterschiede sollten einen selektiven Angriff auf das Tumorgewebe erlauben, ohne dass gesundes Gewebe beeinträchtigt wird, wenn es gelänge, das Immunsystem auf diese veränderten Strukturelemente zu fokussieren. Dabei ist es wichtig, dass die Immunantwort mit synthetisch definierten Glycopeptidepitopen ausgelöst wird, um Autoimmunreaktionen zu vermeiden. Somit ist die Synthese von exakt definierten tumorassoziierten Glycopeptiden von zentraler Bedeutung für die Entwicklung eines Antitumor-Impfstoffes. rnDa die tumorassoziierten Kohlenhydratstrukturen Antigene darstellen, die vom Immunsystem weitgehend toleriert werden, ist es notwendig, ihre Immunogenität mit Hilfe immunstimulierender Epitope so zu erhöhen, dass eine effiziente Immunreaktion erfolgt. Nach diesem Konzept wurden in der vorliegenden Arbeit Methoden und Strategien entwickelt, synthetische Impfstoff-Konjugate zu synthetisieren und immunologisch in Mausexperimenten zu evaluieren. So konnte gezeigt werden, das mit vollsynthetischen Analoga aus tumorassoziierten Glycopeptid-Oberflächenmolekülen in Kombination mit immunstimulierenden Substanzen, wie Trägerproteinen oder Mitogenen, hochselektive humorale Immunantworten ausgelöst werden können.rn

Synthese von tumorassoziierten Glycopeptiden basierend auf der epithelialen Struktur des MUC1

In epithelialen Tumorzellen zeigen Membranglycoproteine ein charakteristisch verändertes Glycosylierungsmuster, das durch eine veränderte Aktivität von Glycosyltransferasen hervorgerufen wird. Diese veränderte Aktivität führt zur Expression von stark verkürzten und frühzeitig sialylierten Kohlenhydratseitenketten der mucinartigen Glycoproteine auf Tumorzellen, welche als tumorassoziierte Antigene bezeichnet werden. Die tumorassoziierten Peptidepitope stellen eine wichtige Zielstruktur für eine potentielle selektive Immuntherapie dar. Das Ziel ist es, dass das Immunsystem zwischen den tumorassoziierten und den normal exprimierten Glycoproteinen unterscheiden kann, und damit in der Lage ist, eine selektiv gegen Tumorzellen gerichtete Immunantwort auszulösen. Daher ist eine Synthese von strukturell exakt definierten synthetischen Glycopeptiden und deren Einbau in Vakzine ein entscheidender Schritt für eine angestrebte Immuntherapie gegen Krebs. Ein Ziel dieser Arbeit war in diesem Zusammenhang die Synthese exakt definierter tumorassoziierter Glycopeptide, wobei Peptide aus der Tandem Repeat-Domäne des MUC1 synthetisiert wurden. Die verschiedenen Saccharidantigene wurden als glycosylierte Aminosäurebausteine in die immundominante Domäne der MUC1-Peptidsequenz eingebaut (TN-Antigen sowie das Sialyl-TN-Antigen, das (2,6)-Sialyl-T- und das (2,3)-Sialyl-T-Antigen). Zum einen wurden die MUC1-Glycopeptide anschließend über einen nicht immunogenen Triethylenglycol-Spacer an Carrier-Proteine wie Ovalbumin-OVA323-339-Sequenz und Rinderserumalbumin (BSA) konjugiert, so dass potenzielle Tumorvakzine erhalten wurden. Diese wurden in ersten ELISA-Experimenten untersucht und haben gezeigt, dass mit den synthetischen Glycopeptidantigenen feine Strukturunterschiede immunologisch differenziert werden können, was für die Unterscheidung zwischen Tumorzellen und gesunden Zellen bedeutsam ist. rnFür Immunisierungen ohne Freunds Adjuvanz wurde der TLR2-Agonist Pam3CSKKKK synthetisiert, der in einer Fragmentkondensation mit einem OVA-Spacer-MUC1-Glycopeptid konjugiert wurde. Die immunologischen Evaluierungen stehen noch aus.rnrn

Nanoparticles for efficient uptake by human dendritic cells and T lymphocytes to be used in adoptive immunotherapy

Dendritic cells (DCs) are the most potent cell type for capture, processing, and presentation of antigens. They are able to activate naïve T cells as well as to initiate memory T-cell immune responses. T lymphocytes are key elements in eliciting cellular immunity against bacteria and viruses as well as in the generation of anti-tumor and anti-leukemia immune responses. Because of their central position in the immunological network, specific manipulations of these cell types provide promising possibilities for novel immunotherapies. Nanoparticles (NP) that have just recently been investigated for use as carriers of drugs or imaging agents, are well suited for therapeutic applications in vitro and also in vivo since they can be addressed to cells with a high target specificity upon surface functionalization. As a first prerequisite, an efficient in vitro labeling of cells with NP has to be established. In this work we developed protocols allowing an effective loading of human monocyte-derived DCs and primary antigen-specific T cells with newly designed NP without affecting biological cell functions. Polystyrene NP that have been synthesized by the miniemulsion technique contained perylenmonoimide (PMI) as a fluorochrome, allowing the rapid determination of intracellular uptake by flow cytometry. To confirm intracellular localization, NP-loaded cells were analyzed by confocal laser scanning microscopy (cLSM) and transmission electron microscopy (TEM). Functional analyses of NP-loaded cells were performed by IFN-γ ELISPOT, 51Chromium-release, and 3H-thymidine proliferation assays. In the first part of this study, we observed strong labeling of DCs with amino-functionalized NP. Even after 8 days 95% of DCs had retained nanoparticles with a median fluorescence intensity of 67% compared to day 1. NP loading did not influence expression of cell surface molecules that are specific for mature DCs (mDCs) nor did it influence the immunostimulatory capacity of mDCs. This procedure did also not impair the capability of DCs for uptake, processing and presentation of viral antigens that has not been shown before for NP in DCs. In the second part of this work, the protocol was adapted to the very different conditions with T lymphocytes. We used leukemia-, tumor-, and allo-human leukocyte antigen (HLA) reactive CD8+ or CD4+ T cells as model systems. Our data showed that amino-functionalized NP were taken up very efficiently also by T lymphocytes, which usually had a lower capacity for NP incorporation compared to other cell types. In contrast to DCs, T cells released 70-90% of incorporated NP during the first 24 h, which points to the need to escape from intracellular uptake pathways before export to the outside can occur. Preliminary data with biodegradable nanocapsules (NC) revealed that encapsulated cargo molecules could, in principle, escape from the endolysosomal compartment after loading into T lymphocytes. T cell function was not influenced by NP load at low to intermediate concentrations of 25 to 150 μg/mL. Overall, our data suggest that NP and NC are promising tools for the delivery of drugs, antigens, and other molecules into DCs and T lymphocytes.

Synthese fluorierter Glycopeptidkonjugate zur Entwicklung von tumorselektiven Vakzinen

Das Auftreten von antigenen, für Tumorzellen charakteristische Zelloberflächenstrukturen bildet die Voraussetzung für eine aktive Krebsimmuntherapie, mit deren Hilfe die gezielte Bekämpfung von (Mikro-)Metastasen durch das körpereigene Immunsystem erreicht werden soll. Eine gut untersuchte Zielstruktur für eine derartige Immuntherapie stellt das Mucin MUC1 dar, ein hochgradig O-glycosyliertes Peptid, welches bspw. von Epithelzellen der Leber exprimiert wird. rnDas Glycosylierungsmuster des tumorassoziierten MUC1 ist gegenüber dem von gesunden Zellen stark verändert. In Tumorzellen kommt es aufgrund einer fehlerhaften Glucosylamintransferase-Aktivität und einer Überexpression von Sialyltransferasen zur Bildung von kürzeren, hochgradig sialylierten O-Glycanketten. Allerdings wirkt sich neben der relativ schwachen Immunogenität besonders die geringe metabolische Stabilität des natürlichen Glycopeptidfragments nachteilig auf einen Einsatz in Krebsvakzinen aus.rnEine bislang kaum untersuchte Möglichkeit, die Stabilität und Immunogenität der Kohlenhydratantigene zu erhöhen, könnte durch den „bioisosteren“ Austausch von OH-Gruppen gegen Fluor erreicht werden.rnIm Rahmen dieser Arbeit konnten in 3’- und 4’- Position monofluorierte T-Antigene bzw. in 6’-Position difluorierte T- und in 6-Position difluorierte TN-Antigene synthetisiert werden. In ersten metabilischen Tests erwiesen sich die fluorierten T-Antigene gegenüber einem Abbau durch eine alpha-Galactosidase aus Rinderhoden als stabiler als ihr natürliches, nicht-fluoriertes Analogon. Diese Strukturen wurden nicht zu den entsprechenden Monosacchariden hydrolysiert und stellen somit geeignete Bausteine zur Entwicklung potenter Tumorvakzine dar.rnDie in 3- und 4-Position fluorierten T-Antigene wurden in der weiteren Synthese in eine aus 20 Aminosäuren bestehende MUC1-Peptidsequenz eingebaut und durch einen nicht immunognene Spacer auf Basis von Triethylenglycol an BSA (Rinderserumalbumin) bzw. Tetanus-Toxoid angebunden. Auf diese Weise konnte die Synthese eines tumorselektiven Vakzins fertiggestellt werden.rnIn einer ersten immunologischen Evaluierung der fluorierten T-Antigen-Glycopeptide konnte gezeigt werden, dass bereits erhaltene Antikörper gegen strukturell sehr ähnliche Vakzine in der Lage sind, die neuartigen Glycopeptide zu erkennen und an ihnen zu binden. Dies stellt die Grundlage für weiterführende immunologische Tests dar, indem in einem nächsten Schritt das synthetisierte Tetanut-Toxoid-Konjugat als Vakzin in Experimenten an Mäusen zum Einsatz kommen soll.rn

Development of a highly potent bispecific antibody format targeting the novel tumor-specific antigen CLDN18.2

Due to multiple immune evasion mechanisms of cancer cells, novel therapy approaches are required to overcome the limitations of existing immunotherapies. Bispecific antibodies are potent anti-cancer drugs, which redirect effector T cells for specific tumor cell lysis, thus enabling the patient’s immune system to fight cancer cells. The antibody format used in this proof of concept study–bispecific ideal monoclonal antibodies termed BiMAB–is a tailor-made recombinant protein, which consists of two fused scFv antibodies recognizing different antigens. Both are arranged in tandem on a single peptide chain and the individual variable binding domains are separated by special non-immunogenic linkers. The format is comprised of a scFv targeting CLDN18.2–a gastric cancer tumor associated antigen (TAA) –while the second specificity binds the CD3 epsilon (CD3ε) subunit of the T cell receptor (TCR) on T cells. For the first time, we compared in our IMAB362-based BiMAB setting, four different anti-CD3-scFvs, respectively derived from the mAbs TR66, CLB-T3, as well as the humanized and the murine variant of UCHT1. In addition, we investigated the impact of an N- versus a C-terminal location of the IMAB362-derived scFv and the anti-CD3-scFvs. Thus, nine CLDN18.2 specific BiMAB proteins were generated, of which all showed a remarkably high cytotoxicity towards CLDN18.2-positive tumor cells. Because of its promising effectiveness, 1BiMAB emerged as the BiMAB prototype. The selectivity of 1BiMAB for its TAA and CD3ε, with affinities in the nanomolar range, has been confirmed by in vitro assays. Its dual binding depends on the design of an N-terminally positioned IMAB362 scFv and the consecutive C-terminally positioned TR66 scFv. 1BiMAB provoked a concentration and target cell dependent T cell activation, proliferation, and upregulation of the cytolytic protein Granzyme B, as well as the consequent elimination of target cells. Our results demonstrate that 1BiMAB is able to activate T cells independent of elements that are usually involved in the T cell recognition program, like antigen presentation, MHC restriction, and co-stimulatory effector molecules. In the first in vivo studies using a subcutaneous xenogeneic tumor mouse model in immune incompetent NSG mice, we could prove a significant therapeutic effect of 1BiMAB with partial or complete tumor elimination. The initial in vitro RIBOMAB experiments correspondingly showed encouraging results. The electroporation of 1BiMAB IVT-RNA into target or effector cells was feasible, while the functionality of translated 1BiMAB was proven by induced T cell activation and target cell lysis. Accordingly, we could show that the in vitro RIBOMAB approach was applicable for all nine BiMABs, which proves the RIBOMAB concept. Thus, the CLDN18.2-BiMAB strategy offers great potential for the treatment of cancer. In the future, administered either as protein or as IVT-RNA, the BiMAB format will contribute towards finding solutions to raise and sustain tumor-specific cellular responses elicited by engaged and activated endogenous T cells. This will potentially enable us to overcome immune evasion mechanisms of tumor cells, consequently supporting current solid gastric cancer therapies.

Improving adoptive T cell therapies of cancer by ectopic expression of miR181a to repress inhibitory phosphatases

Adoptive T cell therapy using antigen-specific T lymphocytes is a powerful immunotherapeutic approach against cancer. Nevertheless, many T cells against tumor-antigens exhibit only weak anti-tumoral response. To overcome this barrier it is necessary to improve the potency and anti-tumoral efficacy of these T cells. Activation and activity of T cells are tightly controlled to inhibit unwanted T cell responses and to reduce the risk of autoimmunity. Both are regulated by extrinsic signals and intrinsic mechanisms which suppress T cell activation. The intrinsic mechanisms include the expression of phosphatases that counteract the activation-inducing kinases. Modifying the expression of these phosphatases allows the targeted modulation of T cell reactivity. MicroRNAs (miRNAs) are regulatory small noncoding RNA molecules that control gene expression by targeting messenger RNAs in a sequence specific manner. Gene-specific silencing plays a key role in diverse biological processes, such as development, differentiation, and functionality. miR181a has been shown to be highly expressed in immature T cells that recognize low-affinity antigens.rnThe present study successfully shows that ectopic expression of miR181a is able to enhance the sensitivity of both murine and human T cells. In CD4+ T helper cells as well as in CD8+ cytotoxic T cells the overexpression of miR181a leads to downregulation of multiple phosphatases involved in the T cell receptor signaling pathway. Overexpression of miR181a in human T cells achieves a co-stimulatory independent activation and has an anti-apoptotic effect on CD4+ T helper cells. Additionally, increasing the amount of miR181a enhances the cytolytic activity of murine CD8+ TCRtg T cells in an antigen-specific manner.rnTo test miR181a overexpressing T cells in vivo, a mouse tumor model using a B cell lymphoma cell line (A20-HA) expressing the Influenza hemagglutinin (Infl.-HA) antigen was established. The expression of model antigens in tumor cell lines enables targeted elimination of tumors using TCRtg T cells. The transfer of miR181a overexpressing Infl.-HA TCRtg CD8+ T cells alone has no positive effect neither on tumor control nor on survival of A20-HA tumor-bearing mice. In contrast, the co-transfer of miR181a overexpressing Infl.-HA TCRtg CD8+ and CD4+ T cells leads to improved tumor control and prolongs survival of A20-HA tumor-bearing mice. This effect is characterized by higher amounts of effector T cells and the expansion of Infl.-HA TCRtg CD8+ T cells.rnAll effects were achieved by changes in expression of several genes including molecules involved in T cell differentiation, activation, and regulation, cytotoxic effector molecules, and receptors important for the homing process of T cells in miR181a overexpressing T cells. The present study demonstrates that miR181a is able to enhance the anti-tumoral response of antigen-specific T cells and is a promising candidate for improving adoptive cell therapy.

Absence of somatostatin SST(2) receptor internalization in vivo after intravenous SOM230 application in the AR42J animal tumor model

Among clinically relevant somatostatin functions, agonist-induced somatostatin receptor subtype 2 (sst(2)) internalization is a potent mechanism for tumor targeting with sst(2) affine radioligands such as octreotide. Since, as opposed to octreotide, the second generation multi-somatostatin analog SOM230 (pasireotide) exhibits strong functional selectivity, it appeared of interest to evaluate its ability to affect sst(2) internalization in vivo. Rats bearing AR42J tumors endogenously expressing somatostatin sst(2) receptors were injected intravenously with SOM230 or with the [Tyr(3), Thr(8)]-octreotide (TATE) analog; they were euthanized at various time points; tumors and pancreas were analyzed by immunohistochemistry for the cellular localization of somatostatin sst(2) receptors. SOM230-induced sst(2) internalization was also evaluated in vitro by immunofluorescence microscopy in AR42J cells. At difference to the efficient in vivo sst(2) internalization triggered by intravenous [Tyr(3), Thr(8)]-octreotide, intravenous SOM230 did not elicit sst(2) internalization: immunohistochemically stained sst(2) in AR42J tumor cells and pancreatic cells were detectable at the cell surface at 2.5min, 10min, 1h, 6h, or 24h after SOM230 injection while sst(2) were found intracellularly after [Tyr(3), Thr(8)]-octreotide injection. The inability of stimulating sst(2) internalization by SOM230 was confirmed in vitro in AR42J cells by immunofluorescence microscopy. Furthermore, SOM230 was unable to antagonize agonist-induced sst(2) internalization, neither in vivo, nor in vitro. Therefore, SOM230 does not induce sst(2) internalization in vivo or in vitro in AR42J cells and pancreas, at difference to octreotide derivatives with comparable sst(2) binding affinities. These characteristics may point towards different tumor targeting but also to different desensitization properties of clinically applied SOM230.

Tumor lymphangiogenesis and metastasis to lymph nodes induced by cancer cell expression of podoplanin

The membrane glycoprotein podoplanin is expressed by several types of human cancers and might be associated with their malignant progression. Its exact biological function and molecular targets are unclear, however. Here, we assessed the relevance of tumor cell expression of podoplanin in cancer metastasis to lymph nodes, using a human MCF7 breast carcinoma xenograft model. We found that podoplanin expression promoted tumor cell motility in vitro and, unexpectedly, increased tumor lymphangiogenesis and metastasis to regional lymph nodes in vivo, without promoting primary tumor growth. Importantly, high cancer cell expression levels of podoplanin correlated with lymph node metastasis and reduced survival times in a large cohort of 252 oral squamous cell carcinoma patients. Based on comparative transcriptional profiling of tumor xenografts, we identified endothelin-1, villin-1, and tenascin-C as potential mediators of podoplanin-induced tumor lymphangiogenesis and metastasis. These unexpected findings identify a novel mechanism of tumor lymphangiogenesis and metastasis induced by cancer cell expression of podoplanin, suggesting that reagents designed to interfere with podoplanin function might be developed as therapeutics for patients with advanced cancer.

Natural variations at position 93 of the invariant Vα24-Jα18 α chain of human iNKT-cell TCRs strongly impact on CD1d binding

Human invariant natural killer T (NKT) cell TCRs bind to CD1d via an "invariant" Vα24-Jα18 chain (iNKTα) paired to semi-invariant Vβ11 chains (iNKTβ). Single-amino acid variations at position 93 (p93) of iNKTα, immediately upstream of the "invariant" CDR3α region, have been reported in a substantial proportion of human iNKT-cell clones (4-30%). Although p93, a serine in most human iNKT-cell TCRs, makes no contact with CD1d, it could affect CD1d binding by altering the conformation of the crucial CDR3α loop. By generating recombinant refolded iNKT-cell TCRs, we show that natural single-nucleotide variations in iNKTα, translating to serine, threonine, asparagine or isoleucine at p93, exert a powerful effect on CD1d binding, with up to 28-fold differences in affinity between these variants. This effect was observed with CD1d loaded with either the artificial α-galactosylceramide antigens KRN7000 or OCH, or the endogenous glycolipid β-galactosylceramide, and its importance for autoreactive recognition of endogenous lipids was demonstrated by the binding of variant iNKT-cell TCR tetramers to cell surface expressed CD1d. The serine-containing variant showed the strongest CD1d binding, offering an explanation for its predominance in vivo. Complementary molecular dynamics modeling studies were consistent with an impact of p93 on the conformation of the CDR3α loop.

Chemosensitization of carcinoma cells using epithelial cell adhesion molecule-targeted liposomal antisense against bcl-2/bcl-xL

Nanoscale drug delivery systems, such as sterically stabilized immunoliposomes binding to internalizing tumor-associated antigens, can increase therapeutic efficacy and reduce toxicity to normal tissues compared with nontargeted liposomes. The epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) is of interest as a ligand for targeted drug delivery because it is abundantly expressed in solid tumors but shows limited distribution in normal tissues. To generate EpCAM-specific immunoliposomes for targeted cancer therapy, the humanized single-chain Fv antibody fragment 4D5MOCB was covalently linked to the exterior of coated cationic liposomes. As anticancer agent, we encapsulated the previously described antisense oligonucleotide 4625 specific for both bcl-2 and bcl-xL. The EpCAM-targeted immunoliposomes (SIL25) showed specific binding to EpCAM-overexpressing tumor cells, with a 10- to 20-fold increase in binding compared with nontargeted control liposomes. No enhanced binding was observed on EpCAM-negative control cells. On cell binding, SIL25 was efficiently internalized by receptor-mediated endocytosis, ultimately leading to down-regulation of both bcl-2 and bcl-xL expression on both the mRNA and protein level, which resulted in enhanced tumor cell apoptosis. In combination experiments, the use of SIL25 led to a 2- to 5-fold sensitization of EpCAM-positive tumor cells of diverse origin to death induction by doxorubicin. Our data show the promise of EpCAM-specific drug delivery systems, such as antisense-loaded immunoliposomes, for targeted cancer therapy.