Imunidade celular: caracterização das proteínas celulares que inibem a infecção viral

Dissertação para obtenção do grau de Mestre no Instituto Superior de Ciências da Saúde Egas Moniz

Identificación de las proteínas implicadas en la respuesta al estrés en Escherichia coli y Vibrio harveyi.

187 p.

Utilización de las proteínas séricas y caseínas como suplementos dietéticos para la prolongación del efecto de saciedad en mujeres obesas

Se estudió el consumo de tres tipos de suplementos, proteínas del lactosuero, caseínas y maltodextrinas (control) en la disminución de la ingesta energética y prolongación del efecto de saciedad de 60 mujeres obesas. Después de 10 semanas, la reducción del peso corporal, IMC, % de grasa corporal y circunferencia de la cintura fue significativamente mayor (p < 0,001) en el grupo que consumió las proteínas lactoséricas frente a los otros dos grupos (control y caseínas). También se observa un descenso en la ingesta energética de -383 kcal/día en las mujeres que consumieron las proteínas de lactosuero frente a un descenso de -144 kcal/día en el grupo de caseínas y de tan solo -70 kcal/día en el grupo control. Finalmente la regulación del efecto de saciedad mediante escala visual analógica fue también más efectiva en el caso de las proteínas séricas, que en el caso de las caseínas y maltodextrinas.

Estudio de la capacidad inmunoprofiláctica de proteínas recombinantes de Leishmania infantum en el modelo murino

En esta Tesis Doctoral, cuatro proteínas que están sobre-expresadas en las fases infectivas del ciclo celular de L. infantum (STPKA, STPK, PP2B and PABP3) fueron purificadas para inmunizar ratones BALB/c, con el interés de estudiar su posible capacidad protectora contra la VL. Tres de ellas indujeron una fuerte respuesta humoral en los ratones, rLiSTPKA, rLiSTPK y rLiPABP3, a diferencia de la proteína rLiPP2B. Además, la rLiPABP3 fue la única que indujo una disminución significativa de la carga parasitara tanto en bazo como en hígado 2 meses después de la infección experimental con el parásito. Con el objetivo de determinar los efectos que la inmunización con rLiPABP3 tenía sobre el sistema inmune murino, se determinó la expresión génica de 106 genes relacionados con el sistema inmune en ratones control, inmunizados e infectados. Los niveles de expresión génica fueron comparados con los obtenidos para los grupos control. Los resultados mostraron que durante todo el experimento la proteína rLiPABP3 promueve la inhibición de la respuesta inmune inflamatoria en el bazo de los ratones infectados. Además, no se observa una respuesta adaptiva claramente polarizada hacia un tipo concreto. Un mes después de la infeccion, en los animales previamente inmunizados se observa la sobre-expresion de Il2rb lo que nos hace pensar que rLiPABP3 podría estimular la presencia de linfocitos T memoria. En fases más avanzadas de la infección, a pesar de que no observamos una clara diferenciación de una población concreta de linfocitos T efectores, sí observamos la infra-expresión del gen codificante del TNF-alfa, lo que unido a la sobre-expresión del gen Cxcr4 y la ausencia de cambios de la expresión del gen Ccr7 nos hace pensar que la inmunización no sólo mantiene la micro-arquitectura del bazo, sino que también promueve la correcta migración de las DCs desde la MZ hasta el PALS.

Evaluación de un implante de células madre mesenquimales modificadas genéticamente con proteínas morfogenéticas de huesos para la osteogénesis en ovis aries

Propósito y Método del Estudio: Introducción. La generación de implantes para el tratamiento y regeneración de afecciones del tejido óseo representan una enorme oportunidad de desarrollo e innovación para muchos campos de la salud humana. Metodología: nosotros generamos un implante de tres componentes (I-3C) constituido por células madre mesenquimales (CMMs), transducidas ex vivo con un vector adenoviral que expresa una combinación de las proteínas morfogenéticas de hueso 2 y 7 (AdBMP2/7), embebidas en una matriz ósea desmineralizada (MOD). Este implante fue probado en un modelo ovino (Ovis aries) en una lesión sometida a carga. Resultados: los ensayos in vitro demostraron que el tratamiento seleccionado con mayor potencial osteogénico es el que contiene la combinación AdBMP2/7 comprobado por PCR en tiempo real, Western Blot y tinciones histológicas e inmunohistoquímicas para las proteínas marcadoras de inducción a hueso, osteocalcina y colágeno tipo I. El implante fue colocado en la zona de la lesión, creada por una distracción en la diáfisis media de la tibia. Se probaron tres grupos de experimentación: control 1 sin implante (S-I); control 2 implante con CMMs (I-CMMs); implante de 3 componentes CMMs modificadas genéticamente con adenovirus que expresan proteínas morfogenéticas de hueso 2 y 7 que se encuentran embebidas en una matriz de hueso desmineralizado (I-3C). Resultados: el seguimiento radiográfico por 10 semanas después de la distracción ósea demostró una reducción en el tiempo de consolidación del grupo I-3C. La tomografía computarizada demostró en ese mismo grupo, una forma y estructura del hueso postmortem muy parecida a la de una tibia sin lesión. Estos hallazgos fueron corroborados por los ensayos de compresión e histológicos, demostrando que la calidad del hueso nuevo formado fue mayor que la de los grupos sin implante y con CMMs sin modificación genética. Contribuciones y Conclusiones: se logró desarrollar un implante de tres componentes constituido por células madre mesenquimales (CMMs), transducidas ex vivo con un vector adenoviral que expresa una combinación de las proteínas morfogenéticas de hueso 2 y 7 (AdBMP2/7), que nos permitirá continuar con los estudios clínicos necesarios para evaluar principalmente defectos en huesos y enfermedades relacionadas con el sistema óseo.

Dosificación de proteínas plasmáticas en personas sanas por electroforesis

Tecnólogo Médico en Laboratorio Clínico

Prospecção de proteínas relacionadas com a resistência à Meloidogyne enterolobii em Psidium spp.

O presente estudo tem por objetivo analisar as reações oxidativas que ocorrem em cultivares de goiaba (Psidium spp.) e araçá (Psidium cattleyanum), visando descobrir o que as tornam uma espécie susceptível e outra resistente, respectivamente.

Caracterización funcional de las proteínas TasA y TapA en la formación de fibras de tipo amiloide en Bacillus subtilis

Las proteínas amiloides son un grupo heterogéneo de proteínas diferentes en secuencia aminoacídica, pero similares en su estructura cuaternaria: fibras enriquecidas en láminas beta, con gran estabilidad, resistencia y capacidad de unión de colorantes específicos, como el rojo congo o la thioflavina T. Estas proteínas han estado tradicionalmente asociadas a patologías neurodegenerativas en humanos como el Alzheimer o el Parkinson. Sin embargo, los miembros dentro de esta familia están ampliamente distribuidas en la naturaleza, desde bacterias hasta humanos, e intervienen en un amplio rango de funciones biológicas, motivo por el que se han denominado “amiloides funcionales”. En bacterias, los amiloides funcionales son responsables de participar en funciones muy diversas como la interacción célula-célula, con superficies abióticas, y formación de biofilms. En Bacillus subtilis, la proteína amiloide TasA es el componente proteico mayoritario de la matriz extracelular del biofilm de este microorganismo y el principal elemento que constituye las fibras amiloides, mientras que la proteína auxiliar TapA, presente en mucha menor proporción, actúa favoreciendo el ensamblaje de las mismas. Estas actúan como un andamiaje proteico donde se disponen el resto de componentes de la matriz extracelular, lo que confiere a esta estructura una mayor estabilidad y, por consiguiente, proporcionan una mayor robustez al biofilm. En este este trabajo se pretende llevar a cabo el análisis de regiones o dominios tanto de TasA como de TapA importantes para la amiloidogénesis, así como para la funcionalidad de ambas proteínas. Para ello, el estudio se ha enfocado desde un punto de vista multidisciplinar, combinando pruebas clásicas de caracterización de amiloides con técnicas de biología molecular y diversas pruebas biofísicas. Los resultados obtenidos hasta la fecha han demostrado la existencia de pequeñas secuencias, dentro de las proteínas TasA o TapA con capacidad para polimerizar en la forma de fibras, lo que muestra su importancia en el proceso de fibrilación y en la funcionalidad de ambas proteínas. En el caso de la proteína TapA, las regiones analizadas ponen de manifiesto la importancia de su extremo amino-terminal tanto en la funcionalidad de la proteína como en su interacción con TasA.

Estudio proteómico de las vesículas extracelulares y del secretoma de "Candida albicans" y análisis funcional de proteínas de superficie celular

Candida albicans es un importante patógeno oportunista en humanos, que puede causar distintos tipos de infecciones, desde micosis superficiales hasta sistémicas. La candidiasis invasiva es una enfermedad que puede causar mortalidad en pacientes inmunocomprometidos. Para causar daño en el hospedador, C. albicans cuenta con una serie de factores de virulencia. Entre ellos destaca la capacidad de cambiar su forma de crecimiento de levadura a hifa. La superficie celular es la estructura más externa de la célula y el punto de contacto entre el hongo y el hospedador. Las proteínas de superficie tienen un papel importante en la integridad estructural de la célula y en la adherencia e invasión de células del hospedador. Una de las proteínas localizadas en la superficie celular es Ecm33, una proteína de pared celular con anclaje glicosilfosfatidilinositol (GPI). La deleción de esta proteína afecta a la morfología tanto de levaduras como de hifas, dando como resultado células con la pared celular alterada y virulencia reducida tanto en condiciones in vitro como in vivo. El secretoma o las proteínas secretadas por C. albicans son también relevantes en la interacción patógeno-hospedador. C. albicans secreta muchas proteínas importantes relacionadas con diferentes procesos, entre los que se incluyen la formación de biofilms, la adquisición de nutrientes y el mantenimiento de la integridad de la pared celular. Muchas de estas proteínas secretadas, como las pertenecientes a las familias de aspartil proteasas (Sap) y la familia de fosfolipasas B (Plb), también han sido detectadas en la pared celular, ya que deben pasar a través de ella en su tránsito hacia el medio extracelular. Estas proteínas tienen un péptido señal en el extremo N-terminal que es el responsable de dirigirlas a la ruta clásica de secreción. Sin embargo, cerca de un tercio de las proteínas identificadas en el medio extracelular de C. albicans no poseen dicho péptido señal en su secuencia...

Estudio de las modificaciones conformacionales y su influencia en la actividad inmunológica de péptidos derivados de las familias de las proteínas spect-1 y -2, siap-1 y -2 de plasmodium falciparum

SPECT-1 y -2 y SIAP-1 y -2 son proteínas pertenecientes al esporozoíto de Plasmodium falciparum causante de la malaria más agresiva en los humanos. Estas proteínas están involucradas en el paso del parásito a través de las células del hospedero humano y en la invasión del hepatocito, haciéndolas blancos atractivos para ser estudiadas. Péptidos conservados de alta capacidad de unión (cHABPs) a células HeLa y HepG2 derivados de estas moléculas son no inmunogénicos porque son incapaces de generar una respuesta inmunitaria, pero son claves para el parásito porque cumplen una función importante durante la infección del hospedero humano. En este trabajo se encontró que algunos cHABPs pertenecientes a las proteínas SPECT-1 y -2, están posiblemente involucrados con la unión y formación de poros sobre la membrana de las células hospederas, ayudando al esporozoíto a abrirse paso través de las células del hospedero. Por otro lado, con el fin de cambiar el comportamiento inmunológico de cHABPs derivados de SPECT-1 y -2 y SIAP-1 y -2, se obtuvieron nuevos péptidos mediante el reemplazo de aminoácidos críticos por otros residuos cuya masa molecular sea similar, pero diferente en su polaridad. En este trabajo se reporta que dichas modificaciones promovieron cambios en la estructura secundaria (determinada por DC o 1H-RMN) de los péptidos modificados (mHABPs) cuando se comparó con la estructura de los cHABPs nativos; adicionalmente, estos mHABPs invirtieron su comportamiento inmunológico convirtiéndose en péptidos inmunogénicos inductores de anticuerpos. Lo que permite establecer la existencia de una relación entre la estructura que adoptan estos mHABPs con su actividad inmunológica. Además, algunos de los mHABPs estudiados aquí, pueden ser candidatos a ser incluidos en la vacuna contra la malaria químicamente sintetizada multi-epitope y multi-estadio que se está desarrollando en la Fundación Instituto de Inmunología de Colombia (FIDIC).

Estudio conformacional de péptidos modificados de las proteínas STARP, CelTOS, TRSP y SERA 5 de Plasmodium falciparum y su relación con una respuesta inmune en malaria

El desarrollo de una vacuna contra malaria es un área de exploración activa pero con enormes retos debido especialmente a la complejidad del ciclo del parásito. Así, es necesario bloquear las diferentes etapas de la invasión que tiene el Plasmodium falciparum y extraer de ellas la mayor información posible de la artillería que utiliza para su ataque. Para esto, péptidos de las proteínas STARP, CelTOS y TRSP (del esporozoito) y SERA 5 (del merozoito) que tienen alta afinidad de unión a células HepG2 y a glóbulos rojos respectivamente (conocidos como cHABPs), han sido modificados (conocidos como mHABPs), sintetizados y evaluados a nivel de respuesta inmune en monos Aotus así como estudiados en su conformación estructural por RMN de 1H. Los resultados muestran que los péptidos nativos no son inmunogénicos, pero pueden inducir altos títulos de anticuerpos cuando sus residuos críticos o sus vecinos son reemplazados por otro con un volumen y masa similar, pero diferente polaridad. El estudio conformacional pone de manifiesto que las estructuras de los péptidos nativos son diferentes de sus péptidos modificados ya sea que muestren regiones estructuradas más cortas o más largas o que no presenten ninguna, en comparación con sus análogos modificados altamente inmunogénicos. Las características estereoquímicas particulares en las cadenas laterales de algunos residuos de aminoácidos de estos péptidos modificados así como los rasgos fisicoquímicos parecen jugar un rol importante en la respuesta inmune apropiada cuando estos fueron inmunizados en grupos de monos Aotus confiriendo un avance al diseño de una vacuna contra malaria totalmente eficaz.

Caracterização bioquímica de proteínas aderidas à fibra do bagaço de cana-de-açúcar obtidas de conteúdo ruminal de ovinos.

A conversão da celulose e da hemicelulose do bagaço de cana-de-açúcar em bioetanol tem utilizado enzimas comerciais importadas, tornando o processo caro, justificando a busca e a produção de enzimas nacionais. O presente trabalho objetivou caracterizar as proteínas aderidas à fibra do bagaço de cana-de-açúcar (BCA), obtidas do conteúdo ruminal de ovinos Morada Nova, quanto à resistência térmica e à variação de pH.

Potencial genético de um cruzamento de feijão-caupi para as concentrações de proteínas, ferro e zinco no grão.

O objetivo deste trabalho foi avaliar o potencial genético de um cruzamento de feijão-caupi para as concentrações de ferro, zinco e proteína no grão.

Concentrações de ferro, zinco e proteínas em formulações de baião-de-dois elaboradas a partir de arroz integral e feijão-caupi biofortificados.

O objetivo deste trabalho foi determinar as concentrações de ferro, zinco e proteína em formulações de baião-de-dois elaborados a partir de arroz integral e feijão-caupi biofortificados.