Pi +-Elektroproduktion an der Schwelle

Die Messung der Elektroproduktion geladener Pionen in der Nähe der Produktionsschwelle ermöglicht die Bestimmung des axialen Formfaktors des Nukleons G_A(Q²) und aus seinem Verlauf die Extraktion der axialen Masse M_A. Diese Größe kann im Rahmen der chiralen Störungstheorie vorhergesagt werden, so daß ihre experimentelle Bestimmung eine Überprüfung der theoretischen Beschreibung des Nukleons erlaubt. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die bereits am Institut für Kernphysik der Universität Mainz in der A1-Kollaboration durchgeführten Messungen der Reaktion H(e,e'Pi+)n bei einer Schwerpunktsenergie von W = 1125 MeV und einem Vierer- impulsübertrag Q² von 0.117, 0.195 und 0.273 (GeV/c)² durch eine weitere Messung bei Q² = 0.058 (GeV/c)² ergänzt. In einer zweiten Meßperiode wurden zusätzlich die Messungen für die Q²-Werte von 0.117 und 0.195 (GeV/c)² wiederholt. Für alle Q²-Werte wurden Daten bei mindestens drei verschiedenen Werten der Polarisation des virtuellen Photons genommen, so daß für alle Messungen eine Rosenbluthseparation durchgeführt werden konnte, um den transversalen und den longitudinalen Anteil des Wirkungsquerschnitts zu bestimmen. Das Ergebnis für Q² = 0.195 (GeV/c)² stimmt im Rahmen der Fehler mit dem alten Ergebnis überein, für Q² = 0.117 (GeV/c)² ergibt sich eine deutliche Abweichung des longitudinalen Anteils. Das Ergebnis für Q² = 0.058 (GeV/c)² liegt unter der aus den alten Messungen gewonnenen Vorhersage. Der induzierte pseudoskalare Formfaktor des Nukleons G_P(Q²) kann ebenfalls in der Pionelektroproduktion bestimmt werden, wenn die Messung bei einer Schwerpunktsenergie nur wenige MeV über der Produktionsschwelle stattfindet. Eine solche Messung erfordert den Nachweis von Pionen mit kinetischen Energien unter 35 MeV, für den die in der A1-Kollaboration vorhandenen Spektrometer nicht geeignet sind. Im apparativen Teil der Arbeit wurde daher ein Szintillatorhodoskop für ein dediziertes Pionspektrometer mit kurzer Weglänge gebaut und getestet. Außerdem wurden für dieses sogenannte Short-Orbit-Spektrometer drei Kollimatoren entworfen und eingebaut.

Statistical mechanics of protein complexed and condensed DNA

In this thesis I treat various biophysical questions arising in the context of complexed / ”protein-packed” DNA and DNA in confined geometries (like in viruses or toroidal DNA condensates). Using diverse theoretical methods I consider the statistical mechanics as well as the dynamics of DNA under these conditions. In the first part of the thesis (chapter 2) I derive for the first time the single molecule ”equation of state”, i.e. the force-extension relation of a looped DNA (Eq. 2.94) by using the path integral formalism. Generalizing these results I show that the presence of elastic substructures like loops or deflections caused by anchoring boundary conditions (e.g. at the AFM tip or the mica substrate) gives rise to a significant renormalization of the apparent persistence length as extracted from single molecule experiments (Eqs. 2.39 and 2.98). As I show the experimentally observed apparent persistence length reduction by a factor of 10 or more is naturally explained by this theory. In chapter 3 I theoretically consider the thermal motion of nucleosomes along a DNA template. After an extensive analysis of available experimental data and theoretical modelling of two possible mechanisms I conclude that the ”corkscrew-motion” mechanism most consistently explains this biologically important process. In chapter 4 I demonstrate that DNA-spools (architectures in which DNA circumferentially winds on a cylindrical surface, or onto itself) show a remarkable ”kinetic inertness” that protects them from tension-induced disruption on experimentally and biologically relevant timescales (cf. Fig. 4.1 and Eq. 4.18). I show that the underlying model establishes a connection between the seemingly unrelated and previously unexplained force peaks in single molecule nucleosome and DNA-toroid stretching experiments. Finally in chapter 5 I show that toroidally confined DNA (found in viruses, DNAcondensates or sperm chromatin) undergoes a transition to a twisted, highly entangled state provided that the aspect ratio of the underlying torus crosses a certain critical value (cf. Eq. 5.6 and the phase diagram in Fig. 5.4). The presented mechanism could rationalize several experimental mysteries, ranging from entangled and supercoiled toroids released from virus capsids to the unexpectedly short cholesteric pitch in the (toroidaly wound) sperm chromatin. I propose that the ”topological encapsulation” resulting from our model may have some practical implications for the gene-therapeutic DNA delivery process.

Modulation of apoptosis by endogenously produced nitric oxide

Untersuchungen zur Expression der induzierbaren NO-Synthetase (NOS2) belegen eine häufige Expression dieses Enzyms in Tumoren unterschiedlicher Gewebe. Bislang ist jedoch ungeklärt, ob die Expression der NOS2 in Tumorzellen die apoptotische Eliminierung durch zytotoxische T-Zellen beeinflussen kann. In der vorliegenden Arbeit wurden die Folgen einer endogenen NO-Synthese auf die Apoptosesensitivität von HEK293-Zellen untersucht. Um primäre NO-Wirkungen von NO-induzierten, sekundären (kompensatorischen) Veränderungen zu trennen, wurde mit einem induzierbaren Vektorsystem gearbeitet. Die NOS2 wurde zunächst unter der Kontrolle eines Ecdyson-sensitiven Promoters in HEK293-Zellen kloniert. Es konnten regulierbare NOS2-Klone selektiert werden, die nach Ponasteronbehandlung dosisabhängig die NOS2 exprimieren und NO synthetisieren. Die NOS2-Expression wurde durch Western Blot Analyse und Immunfluoreszenzfärbung dargestellt und die NO-Produktion mit Hilfe der Griess-Reaktion gemessen. An den NOS2-induzierten Zellen wurde dann der Einfluss von NO auf die CD95-vermittelte Apoptose analysiert. Es zeigte sich nach Stimulation des CD95-Rezeptors eine deutliche Korrelation der Apoptoserate mit der NOS2-Expression. In Kokulturexperimenten mit Peptid-spezifischen zytotoxischen T-Zellen zeigte sich, dass NO-produzierende Zielzellen effektiver eliminiert werden konnten. Auch nach Behandlung der Zellen mit TRAIL ergab sich eine höhere Apoptoserate in NO-produzierenden Zellen. Die weitere Analyse der durch NO beeinflussten Signalwege ergab eine Beteiligung von ER-Stress-vermittelten Apoptosewegen. Dies zeigte sich an der Hochregulation des ER-Stress-Proteins Grp78 (BiP) nach NOS2-Expression und der Spaltung der am ER-lokalisierten Caspase-4. Darüber hinaus konnte der schnellere Verlust des mitochondrialen Membranpotentials in Abhängigkeit von der NOS2-Expression nachgewiesen werden. Weiterhin wurde die Wirkung einer dauerhaften NO-Exposition auf die Apoptosesensitivität der Zellen untersucht. Auch ohne zusätzliche CD95-Stimulation induzierte eine kontinuierliche NOS2-Expression nach wenigen Tagen in den EcR293-NOS2-Zellen Apoptose. Diese Dauerbehandlung führte zum nahezu vollständigen Absterben der Kulturen. Einige Zellen überlebten jedoch diese Behandlung und wuchsen zu Zellklonen. Diese NO-resistenten Klone konnten isoliert werden. Sie zeigten eine zusätzliche Resistenz für CD95-vermittelte Apoptosesignale und waren besser vor dem Angriff Peptid-spezifischer CTLs geschützt. Die Apoptoseresistenz blieb auch nach längerer Kultur erhalten und scheint auf NO-induzierter Genotoxizität zu beruhen. Anhand dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass allein durch chronische NO-Behandlung eine Selektion apoptoseresistenter Zellen stattfinden kann.

Analyse der konditionell-induzierten Überexpression von Smad7 in epithelialen Geweben der adulten Maus

Smad7 ist eine inhibitorische Komponente der TGF-β- bzw. Activin-Signalweiterleitung und erfüllt eine wichtige Aufgabe bei deren Regulation. So führt eine konstitutive Überexpression von Smad7 in epithelialen Geweben zum Auftreten verschiedener Phänotypen, wie embryonaler bzw. perinataler Letalität, Hyperproliferation der Epidermis und Thymusatrophie. Auch die Entwicklung der T-Zellen im Thymus und epithelialer Anhangsgebilde wie z.B. von Haaren und Zähnen wird dadurch beeinträchtigt. In dieser Arbeit sollte nun in der adulten Maus der Effekt einer Überexpression von Smad7 in epithelialen Geweben untersucht werden. Zu diesem Zweck wurde ein, auf dem Cre/loxP-Prinzip beruhendes Transgensystem verwendet (K5-Smad7-tg und K14-creERT2), welches eine konditionell-induzierte Überexpression von Smad7 in epithelialen Zellen der adulten Maus erlaubte. Die so gezüchteten doppeltransgenen Tiere wiesen keine signifikanten Veränderungen gegenüber ihren wildtyp bzw. einfachtransgenen Geschwistertieren auf. Die Überexpression von Smad7 in epithelialen Geweben der adulten Maus zu einem Auftreten verschiedenster veränderter Phänotypen der Haut und deren Anhänge, sowie der Schneidezähne. Bei diesen Tieren konnte auch ein signifikanter Körpergewichtsverlust und eine Erhöhung der Mortalitätsrate beobachtet werden, welche sich im Verlauf nach erfolgter Rekombination einstellte. Weitere Analysen zeigten signifikante Veränderungen in der Haut und im Thymus. So konnte in der Haut eine Erhöhung der Proliferationsrate epidermaler Zellen, eine reduzierte Expression von Smad3 und im Thymus Veränderungen in der Gesamtzahl der lebenden T-Zellen und deren Differenzierung beobachtete werden. Mit dieser Arbeit konnte gezeigt werden, daß die Hemmung der Signalweiterleitung der TGF-β-Superfamilie, speziell von TGF-β und Activin, zu verschiedenen morphogenetischen Defekten der Haut und deren Anhänge, der Zähne und der T-Zellentwicklung im Thymus führt.

Entstehung und Dynamik des Keratinfilament-Netzwerks

Das zytoplasmatische Zytoskelett besteht aus drei Filamentsystemen, die aus Aktin, Tubulin und Intermediärfilamentproteinen aufgebaut sind und dreidimensionale Netzwerke ausbilden. Das Intermediärfilamentsystem, dem vor allem mechanische Stabilisierungsfunktionen zugesprochen werden, unterscheidet sich von den anderen durch seine Fähigkeit, spontan aus seinen Polypeptiduntereinheiten ohne weitere Kofaktoren zu polymerisieren und durch seinen unpolaren Aufbau. Es ist bis heute unbekannt, wie Intermediärfilamentnetzwerke in vivo moduliert werden und wie ihre Anordnung in den Kontext des Gesamtzytoskeletts koordiniert wird. Am Beispiel der epithelialen Intermediärfilamentproteine, den Keratinen, sollte daher untersucht werden, wie und wo neue Intermediärfilamente entstehen, welche Bedeutung den anderen Filamentsystemen bei dem Netzwerkaufbau und –Turn-Over zukommen und wie die Netzwerkbildung gesteuert wird. Zur Beantwortung dieser Fragestellungen wurden Zellklone hergestellt, die fluoreszierende Keratine synthetisieren. In der Zelllinie SK8/18-2, deren gesamtes Netzwerk aus derartigen Chimären aufgebaut ist, konnten anhand von mikroskopischen Zeitrafferaufnahmen der Fluoreszenzmuster Keratinfilamentvorläufer (KFP) identifiziert und deren Dynamik direkt in lebenden Zellen verfolgt werden. Es konnte gezeigt werden, dass die KFP in einem Plasmamembran-nahen Bereich entstehen, in dem sie zuerst als punktförmige Partikel detektiert werden. Nach einer initialen, sphäroidalen Wachstumsphase elongieren die Partikel zu kleinen Filamentstückchen. Diese können miteinander fusionieren und werden über ihre Enden in das periphere Netzwerk integriert. Der Wachstumsprozess ist gekoppelt an eine kontinuierliche, langsame Bewegung in Richtung auf das Zellzentrum. Diese Motilität sistiert vollständig nach pharmakologisch induziertem Abbau der Aktinfilamente. In Zeitraffer-aufnahmen kann jedoch in derartig behandelten Zellen ein wesentlich schnellerer Transport, der in verschiedene Richtungen verläuft und durch lange Ruhephasen unterbrochen wird, beobachtet werden. Dieser Modus, der gelegentlich auch in unbehandelten Zellen gefunden wurde, ist abhängig von intakten Mikrotubuli. Erst durch Zerstörung der Aktinfilamente und der Mikrotubuli erlischt die Motilität der KFPs vollständig. Bei der Suche nach Regulatoren der Keratinnetzwerkbildung wurde die p38 MAPK als zentraler Faktor identifiziert. Erstmals konnte eine direkte räumliche und zeitliche Korrelation zwischen einer spezifischen Enzymaktivität durch Nachweis der phosphorylierten p38 MAPK, der daraus folgenden Phosphorylierung eines Keratins, hier Serin 73 des Keratin 8, und der daraus resultierenden Veränderung des Netzwerkaufbaus, d. h. der Ausbildung von Keratingranula, nachgewiesen werden. Diese koordinierten Veränderungen wurden in unterschiedlichen Stresssituationen in verschiedenen Zellsystemen und in Zellen mit mutierten Keratinen beobachtet. Genetische (shRNA) und pharmakologische Manipulationen der p38 MAPK-Aktivität deuten auf einen engen kausalen Zusammenhang hin.

Computation of direction selectivity in retinal starburst amacrine cell dendrites – studied using electrophysiological recordings and two-photon imaging

Neuronal circuits in the retina analyze images according to qualitative aspects such as color or motion, before the information is transmitted to higher visual areas of the brain. One example, studied for over the last four decades, is the detection of motion direction in ‘direction selective’ neurons. Recently, the starburst amacrine cell, one type of retinal interneuron, has emerged as an essential player in the computation of direction selectivity. In this study the mechanisms underlying the computation of direction selective calcium signals in starburst cell dendrites were investigated using whole-cell electrical recordings and two-photon calcium imaging. Analysis of the somatic electrical responses to visual stimulation and pharmacological agents indicated that the directional signal (i) is not computed presynaptically to starburst cells or by inhibitory network interactions. It is thus computed via a cell-intrinsic mechanism, which (ii) depends upon the differential, i.e. direction selective, activation of voltage-gated channels. Optically measuring dendritic calcium signals as a function of somatic voltage suggests (iii) a difference in resting membrane potential between the starburst cell’s soma and its distal dendrites. In conclusion, it is proposed that the mechanism underlying direction selectivity in starburst cell dendrites relies on intrinsic properties of the cell, particularly on the interaction of spatio-temporally structured synaptic inputs with voltage-gated channels, and their differential activation due to a somato-dendritic difference in membrane potential.

Die organotypische Gewebekultur der adulten Retina als Analysesystem für funktionell intakte Photorezeptorzellen

Photorezeptorzellen der Vertebraten sind hoch spezialisierte, visuell sensorische Neurone in der Retina, die die Lichtinformation in ein neuronales Signal umwandeln. Durch ihre Einbindung in die Retina im Gesamtorgan Auge, sind Photorezeptorzellen im Organismus für zellbiologische Analysen, wie beispielsweise unter Einsatz pharmakologischer Substanzen, nur schwer zugänglich. Demgegenüber ist bei der Nutzung von Zellkulturtechniken eine Beeinflussung oder externe Manipulation von Zellen mit geringem Aufwand möglich. Bei Etablierungsversuchen von Primärkulturen von Photorezeptorzellen zeigte sich jedoch, dass diese rasch ihre spezifische Kompartimentierung und das damit verbundene (lichtsensitive) Funktionsvermögen verlieren. Eine Alternative zur Einzelzellkultur bietet die Kultivierung der Retina als organotypisches Gewebe, in der, durch den überlebenswichtigen Kontakt der retinalen Zellen zu einander, deren Morphologie und Funktionsvermögen erhalten bleibt. In der vorliegenden Arbeit konnte durch Optimierung der Kultivierungstechnik erstmals die adulte Retina für mehrere Tage intakt kultiviert und deren Vitalität und physiologische Aktivität nachgewiesen werden. Nach dem Nachweis der Eignung der organotypischen Retinakultur, stand diese nun für zellbiologische Analysen von Photorezeptorzellen zur Verfügung. Die Langzeitadaptation von Photorezeptorzellen geht einher mit der Translokation der Proteine Arrestin und Transducin. Doch sind die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen dieser lichtabhängigen molekularen Bewegungen bislang noch nicht verstanden. Im Kontext der Diskussion um Diffusion oder aktivem Transport der genannten Translokationen, wurden in der vorliegenden Arbeit Experimente zur Abhängigkeit vom Cytoskelett durchgeführt. Die Ergebnisse zeigen, dass die gegensätzlichen Translokationen von Arrestin und Transducin während der Dunkeladaptation vom Aktin-, als auch Mikrotubulicytoskelett abhängig sind. Demgegenüber sind es die während der Helladaptation stattfindenden Translokationen nicht. Diese Befunde verweisen damit auf unterschiedliche Mechanismen für die untersuchten molekularen Bewegungen während der Dunkel- und Helladaptation, und das im Falle des Arrestins auch verschieden Mechanismen zusammen oder in einer Abfolge für die Bewegung durch verschiedene Zellkompartimente notwendig sind. Darüber hinaus konnte in der vorliegenden Arbeit die Eignung der Retinakulturtechnik für Gentransfers in retinale Zellen mittels verschiedener Methoden gezeigt werden. Die organotypische Gewebekultur der adulten Retina erweist sich als ein Analysesystem mit dem zellbiologische Untersuchungen an ausdifferenzierten Photorezeptorzellen durchgeführt werden können, die im lebenden Tier, bzw. der Zellkultur nicht möglich sind. Erfolgreiche Pharmakologische Beeinflussung, sowie Gentransfer in Zellen der Retinakultur prädestinieren die Retinakultur für zellbiologische und Proteinfunktionsanalysen. Dabei kann sie ferner als Modellsystem zur Evaluation von Therapiestrategien zu Retinadystrophien dienen und das ohne, oder zumindest in einer Reduktion von Tierversuchen.

Untersuchungen zum Sehen von bewegten Objekten beim Goldfisch (Carassius auratus)

In der vorliegenden Arbeit wurde das Objektbewegungssehen des Goldfischs betrachtet. Zuerst musste eine geeignete Methode gefunden werden, diese Form der Bewegungswahrnehmung untersuchen zu können, da bisherige Experimente zum Bewegungssehen beim Goldfisch ausschließlich mit Hilfe der optomotorischen Folgereaktion gemacht wurden. Anschließend sollte die Frage geklärt werden, ob das Objektbewegungssehen genau wie das Bewegungssehen einer Großfeldbewegung farbenblind ist und welcher Zapfentyp daran beteiligt ist. Die Verwendung eines Zufallpunktmusters zur Dressur auf ein bewegtes Objekt hat sich als äußert erfolgreich herausgestellt. Diese Methode hat den Vorteil, dass sich die Versuchstiere ausschließlich aufgrund der Bewegungsinformation orientieren können. In den Rot-Grün- und Blau-Grün-Transferversuchen zeigte sich, dass das Objektbewegungssehen beim Goldfisch farbenblind ist, aber erstaunlicherweise nicht vom L-Zapfen vermittelt wird, sondern wahrscheinlich vom M-Zapfen. Welchen Vorteil es haben könnte, dass für die verschiedenen Formen der Bewegungswahrnehmung verschiedene Eingänge benutzt werden, kann mit diesen Versuchen nicht geklärt werden. Farbenblindheit des Bewegungssehens scheint eine Eigenschaft visueller Systeme allgemein zu sein. Beim Menschen ist diese Frage im Moment noch nicht geklärt und wird weiterhin diskutiert, da es sowohl Experimente gibt, die zeigen, dass es farbenblind ist, als auch andere, die Hinweise darauf geben, dass es nicht farbenblind ist. Der Vorteil der Farbenblindheit eines bewegungsdetektierenden visuellen Systems zeigt sich auch in der Technik beim Maschinen Sehen. Hier wird ebenfalls auf Farbinformation verzichtet, was zum einen eine Datenreduktion mit sich bringt und zum anderen dazu führt, dass korrespondierende Bildpunkte leichter gefunden werden können. Diese werden benötigt, um Bewegungsvektoren zu bestimmen und letztlich Bewegung zu detektieren.

Differential cell type-specific transcriptional regulation of the CYP1A1 gene

Cytochrome P450 1A1 (CYP1A1) monooxygenase plays an important role in the metabolism of environmental pollutants such as polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) and halogenated polycyclic aromatic hydrocarbons (HAHs). Oxidation of these compounds converts them to the metabolites that subsequently can be conjugated to hydrophilic endogenous entities e.g. glutathione. Derivates generated in this way are water soluble and can be excreted in bile or urine, which is a defense mechanism. Besides detoxification, metabolism by CYP1A1 may lead to deleterious effects since the highly reactive intermediate metabolites are able to react with DNA and thus cause mutagenic effects, as it is in the case of benzo(a) pyrene (B[a]P). CYP1A1 is normally not expressed or expressed at a very low level in the cells but it is inducible by many PAHs and HAHs e.g. by B[a]P or 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD). Transcriptional activation of the CYP1A1 gene is mediated by aryl hydrocarbon receptor (AHR), a basic-helix-loop-helix (bHLH) transcription factor. In the absence of a ligand AHR stays predominantly in the cytoplasm. Ligand binding causes translocation of AHR to the nuclear compartment, its heterodimerization with another bHLH protein, the aryl hydrocarbon nuclear translocator (ARNT) and binding of the AHR/ARNT heterodimer to a DNA motif designated dioxin responsive element (DRE). This process leads to the transcriptional activation of the responsive genes containing DREs in their regulatory regions, e.g. that coding for CYP1A1. TCDD is the most potent known agonist of AHR. Since it is not metabolized by the activated enzymes, exposure to this compound leads to a persisting activation of AHR resulting in diverse toxic effects in the organism. To enlighten the molecular mechanisms that mediate the toxicity of xenobiotics like TCDD and related compounds, the AHR-dependent regulation of the CYP1A1 gene was investigated in two cell lines: human cervix carcinoma (HeLa) and mouse hepatoma (Hepa). Study of AHR activation and its consequence concerning expression of the CYP1A1 enzyme confirmed the TCDD-dependent formation of the AHR/ARNT complex on DRE leading to an increase of the CYP1A1 transcription in Hepa cells. In contrast, in HeLa cells formation of the AHR/ARNT heterodimer and binding of a protein complex containing AHR and ARNT to DRE occurred naturally in the absence of TCDD. Moreover, treatment with TCDD did not affect the AHR/ARNT dimer formation and binding of these proteins to DRE in these cells. Even though the constitutive complex on DRE exists in HeLa, transcription of the CYP1A1 gene was not increased. Furthermore, the CYP1A1 level in HeLa cells remained unchanged in the presence of TCDD suggesting repressional mechanism of the AHR complex function which may hinder the TCDD-dependent mechanisms in these cells. Similar to the native, the mouse CYP1A1-driven reporter constructs containing different regulatory elements were not inducible by TCDD in HeLa cells, which supported a presence of cell type specific trans-acting factor in HeLa cells able to repress both the native CYP1A1 and CYP1A1-driven reporter genes rather than species specific differences between CYP1A1 genes of human and rodent origin. The different regulation of the AHR-mediated transcription of CYP1A1 gene in Hepa and HeLa cells was further explored in order to elucidate two aspects of the AHR function: (I) mechanism involved in the activation of AHR in the absence of exogenous ligand and (II) factor that repress function of the exogenous ligand-independent AHR/ARNT complex. Since preliminary studies revealed that the activation of PKA causes an activation of AHR in Hepa cells in the absence of TCDD, the PKA-dependent signalling pathway was the proposed endogenous mechanism leading to the TCDD-independent activation of AHR in HeLa cells. Activation of PKA by forskolin or db-cAMP as well as inhibition of the kinase by H89 in both HeLa and Hepa cells did not lead to alterations in the AHR interaction with ARNT in the absence of TCDD and had no effect on binding of these proteins to DRE. Moreover, the modulators of PKA did not influence the CYP1A1 activity in these cells in the presence and in the absence of TCDD. Thus, an involvement of PKA in the regulation of the CYP1A1 Gen in HeLa cells was not evaluated in the course of this study. Repression of genes by transcription factors bound to their responsive elements in the absence of ligands has been described for nuclear receptors. These receptors interact with protein complex containing histone deacetylase (HDAC), enzyme responsible for the repressional effect. Thus, a participation of histone deacetylase in the transcriptional modulation of CYP1A1 gene by the constitutively DNA-bound AHR/ARNT complex was supposed. Inhibition of the HDAC activity by trichostatin A (TSA) or sodium butyrate (NaBu) led to an increase of the CYP1A1 transcription in the presence but not in the absence of TCDD in Hepa and HeLa cells. Since amount of the AHR and ARNT proteins remained unchanged upon treatment of the cells with TSA or NaBu, the transcriptional upregulation of CYP1A1 gene was not due to an increased expression of the regulatory proteins. These findings strongly suggest an involvement of HDAC in the repression of the CYP1A1 gene. Similar to the native human CYP1A1 also the mouse CYP1A1-driven reporter gene transfected into HeLa cells was repressed by histone deacetylase since the presence of TSA or NaBu led to an increase in the reporter activity. Induction of reporter gene did not require a presence of the promoter or negative regulatory regions of the CYP1A1 gene. A promoter-distal fragment containing three DREs together with surrounding sequences was sufficient to mediate the effects of the HDAC inhibitors suggesting that the AHR/ARNT binding to its specific DNA recognition site may be important for the CYP1A1 repression. Histone deacetylase is recruited to the specific genes by corepressors, proteins that bind to the transcription factors and interact with other members of the HDAC complex. Western blot analyses revealed a presence of HDAC1 and the corepressors mSin3A (mammalian homolog of yeast Sin3) and SMRT (silencing mediator for retinoid and thyroid hormone receptor) in both cell types, while the corepressor NCoR (nuclear receptor corepressor) was expressed exclusively in HeLa cells. Thus the high inducibility of CYP1A1 in Hepa cells may be due to the absence of NCoR in these cells in contrast to the non-responsive HeLa cells, where the presence of NCoR would support repression of the gene by histone deacetylase. This hypothesis was verified in reporter gene experiments where expression constructs coding for the particular members of the HDAC complex were cotransfected in Hepa cells together with the TCDD-inducible reporter constructs containing the CYP1A1 regulatory sequences. An overexpression of NCoR however did not decrease but instead led to a slight increase of the reporter gene activity in the cells. The expected inhibition was observed solely in the case of SMRT that slightly reduced constitutive and TCDD-induced reporter gene activity. A simultaneous expression of NCoR and SMRT shown no further effects and coexpression of HDAC1 with the two corepressors did not alter this situation. Thus, additional factors that are likely involved in the repression of CYP1A1 gene by HDAC complex remained to be identified. Taking together, characterisation of an exogenous ligand independent AHR/ARNT complex on DRE in HeLa cells that repress transcription of the CYP1A1 gene creates a model system enabling investigation of endogenous processes involved in the regulation of AHR function. This study implicates HDAC-mediated repression of CYP1A1 gene that contributes to the xenobiotic-induced expression in a tissue specific manner. Elucidation of these processes gains an insight into mechanisms leading to deleterious effects of TCDD and related compounds.

Evolutionary tendencies in flowers of Marantaceae with special reference to the style movement mechanism

One of the quickest plant movements ever known is made by the ´explosive´ style in Marantaceae in the service of secondary pollen presentation – herewith showing a striking apomorphy to the sister Cannaceae that might be of high evolutionary consequence. Though known already since the beginning of the 19th century the underlying mechanism of the movement has hitherto not been clarified. The present study reports about the biomechanics of the style-staminode complex and the hydraulic principles of the movement. For the first time it is shown by experiment that in Maranta noctiflora through longitudinal growth of the maturing style in the ´straitjacket´ of the hooded staminode both the hold of the style prior to its release and its tensioning for the movement are brought about. The longer the style grows in relation to the enclosing hooded staminode the more does its capacity for curling up for pollen transfer increase. Hereby I distinguish between the ´basic tension´ that a growing style builds up anyway, even when the hooded staminode is removed beforehand, and the ´induced tension´ which comes about only under the pressure of a ´too short´ hooded staminode and which enables the movement. The results of these investigations are discussed in view of previous interpretations ranging from possible biomechanical to electrophysiological mechanisms. To understand furthermore by which means the style gives way to the strong bending movement without suffering outwardly visible damage I examined its anatomical structure in several genera for its mechanical and hydraulic properties and for the determination of the entire curvature after release. The actual bending part contains tubulate cells whose walls are extraordinarily porous and large longitudinal intercellular spaces. SEM indicates the starting points of cell-wall loosening in primary walls and lysis of middle lamellae - probably through an intense pectinase activity in the maturing style. Fluorescence pictures of macerated and living style-tissue confirm cell-wall perforations that do apparently connect neighbouring cells, which leads to an extremely permeable parenchyma. The ´water-body´ can be shifted from central to dorsal cell layers to support the bending. The geometrical form of the curvature is determined by the vascular bundles. I conclude that the style in Marantaceae contains no ´antagonistic´ motile tissues as in Mimosa or Dionaea. Instead, through self-maceration it develops to a ´hydraulic tissue´ which carries out an irreversible movement through a sudden reshaping. To ascertain the evolutionary consequence of this apomorphic pollination mechanism the diversity and systematic value of hooded staminodes are examined. For this hooded staminodes of 24 genera are sorted according to a minimalistic selection of shape characters and eight morphological types are abstracted from the resulting groups. These types are mapped onto an already available maximally parsimonious tree comprising five major clades. An amazing correspondence is found between the morphological types and the clades; several sister-relationships are confirmed and in cases of uncertain position possible evolutionary pathways, such as convergence, dispersal or re-migration, are discussed, as well as the great evolutionary tendencies for the entire family in which – at least as regards the shape of hooded staminodes – there is obviously a tendency from complicated to strongly simplified forms. It suggests itself that such simplifying derivations may very likely have taken place as adaptations to pollinating animals about which at present too little is known. The value of morphological characters in relation to modern phylogenetic analysis is discussed and conditions for the selection of morphological characters valuable for a systematic grouping are proposed. Altogether, in view of the evolutionary success of Marantaceae compared with Cannaceae the movement mechanism of the style-staminode complex can safely be considered a key innovation within the order Zingiberales.

Influence of spatial constraints in non-crystalline regions on the polymer dynamics in semi-crystalline polyethylene: a solid state NMR study

A broad variety of solid state NMR techniques were used to investigate the chain dynamics in several polyethylene (PE) samples, including ultrahigh molecular weight PEs (UHMW-PEs) and low molecular weight PEs (LMW-PEs). Via changing the processing history, i.e. melt/solution crystallization and drawing processes, these samples gain different morphologies, leading to different molecular dynamics. Due to the long chain nature, the molecular dynamics of polyethylene can be distinguished in local fluctuation and long range motion. With the help of NMR these different kinds of molecular dynamics can be monitored separately. In this work the local chain dynamics in non-crystalline regions of polyethylene samples was investigated via measuring 1H-13C heteronuclear dipolar coupling and 13C chemical shift anisotropy (CSA). By analyzing the motionally averaged 1H-13C heteronuclear dipolar coupling and 13C CSA, the information about the local anisotropy and geometry of motion was obtained. Taking advantage of the big difference of the 13C T1 relaxation time in crystalline and non-crystalline regions of PEs, the 1D 13C MAS exchange experiment was used to investigate the cooperative chain motion between these regions. The different chain organizations in non-crystalline regions were used to explain the relationship between the local fluctuation and the long range motion of the samples. In a simple manner the cooperative chain motion between crystalline and non-crystalline regions of PE results in the experimentally observed diffusive behavior of PE chain. The morphological influences on the diffusion motion have been discussed. The morphological factors include lamellar thickness, chain organization in non-crystalline regions and chain entanglements. Thermodynamics of the diffusion motion in melt and solution crystallized UHMW-PEs is discussed, revealing entropy-controlled features of the chain diffusion in PE. This thermodynamic consideration explains the counterintuitive relationship between the local fluctuation and the long range motion of the samples. Using the chain diffusion coefficient, the rates of jump motion in crystals of the melt crystallized PE have been calculated. A concept of "effective" jump motion has been proposed to explain the difference between the values derived from the chain diffusion coefficients and those in literatures. The observations of this thesis give a clear demonstration of the strong relationship between the sample morphology and chain dynamics. The sample morphologies governed by the processing history lead to different spatial constraints for the molecular chains, leading to different features of the local and long range chain dynamics. The knowledge of the morphological influence on the microscopic chain motion has many implications in our understanding of the alpha-relaxation process in PE and the related phenomena such as crystal thickening, drawability of PE, the easy creep of PE fiber, etc.

Charakterisierung von inhibitorischen, glyzinergen Synapsen bei Amakrinzellen der Säugernetzhaut

Amakrinzellen sind hemmende Interneurone der Netzhaut. Sie exprimieren erregende, ionotrope Glutamat-Rezeptoren und hemmende Glyzin- bzw. GABA-Rezeptoren. In der vorliegenden Arbeit wurden die Glyzinrezeptoren von Amakrinzellen mit Hilfe der „Patch Clamp“ Technik in Wildtyp- und Glyzin-Rezeptor Knock-out-Mäusen (Glra1spd-ot, Glra2-/-, Glra3-/-) untersucht. In Schnitten und Ganzpräparaten von akut isolierten Netzhäuten wurden Glyzin-induzierte und spontane inhibitorische postsynaptische Ströme (sIPSCs) gemessen. Die Untersuchungen beschränkten sich auf eine Gruppe von Amakrinzellen, die sich durch ein relativ kleines Dendritenfeld auszeichnen, das alle Schichten der IPL durchzieht. Dabei wurden die Ströme von zwei Typen von Amakrinzellen, den AII-Zellen und den NF-Zellen, miteinander verglichen. Alle untersuchten Amakrinzellen reagierten mit einem Stromfluss über die Membran, wenn Glyzin appliziert wurde. Bei AII-Zellen war die Amplitude des Stromes bei der Glra3-/--Maus um etwa 50 % reduziert, während bei den anderen Mauslinien kein Unterschied zum Wildtyp festgestellt wurde. Bei NF-Zellen wurde nur ein geringer Unterschied der Stromamplituden zwischen Wildtyp und Mutanten gefunden. Er war am deutlichsten bei der Glra2-/--Maus. Picrotoxinin ist ein effektiver Antagonist von homomeren Glyzinrezeptoren, während heteromere Glyzinrezeptoren relativ unempfindlich sind. Die Wirkung von Picrotoxinin war bei allen untersuchten Zellen ähnlich und reduzierte die Glyzinantwort um etwa 25 - 30 %. Dieser Effekt war unabhängig von der Mauslinie. Amakrinzellen exprimieren also zum Großteil heteromere Rezeptoren Zur Untersuchung der synaptischen Glyzinrezeptoren der Amakrinzellen wurden die spontanen inhibitorischen postsynaptischen Ströme dieser Zellen gemessen und deren Amplituden und Kinetiken bestimmt. Dabei unterschieden sich die Zeitkonstanten der Deaktivierungs/Desensitivierungskinetik (τw) von AII- und NF-Zellen, wohingegen die Aktivierungszeit nicht voneinander abwich. Spontane IPSCs, die von AII-Amakrinzellen abgeleitet wurden, hatten eine mittlere Zeitkonstante von τ = 11 ms und streuten zwischen 5 und 30 ms. Die Zeitkonstanten der sIPSCs von NF-Amakrinzellen lagen zwischen 10 und 50 ms und wiesen eine mittlere Zeitkonstante von τw = 27 ms auf. Die unterschiedlichen Zeitkonstanten spiegeln die Zusammensetzung der α-Untereinheiten des Glyzinrezeptors wider. AII-Zellen in der Glra1-/-- und in der Glra2-/--Maus hatten vergleichbare Zeitkonstanten wie die AII-Zellen im Wildtyp. Bei der Glra3-/--Maus konnten bei 50 untersuchten AII-Amakrinzellen keine sIPSCs gemessen werden. Dies und die Ergebnisse der Glyzin-induzierten Ströme von AII-Zellen lassen darauf schließen, dass die glyzinergen Synapsen dieser Zellen bevorzugt die α3-Untereinheit enthalten. Bei NF-Amakrinzellen konnte kein Unterschied zwischen Wildtyp-, Glra1spd-ot- und Glra3-/--Mäusen festgestellt werden. Dagegen zeigten die sIPSCs der NF-Amakrinzellen der Glra2-/--Maus signifikant längere Zeitkonstanten. Der Mittelwert verlängerte sich von 27 ms auf 69 ms und es war eine breitere Streuung mit Zeitkonstanten zwischen 15 und 200 ms zu sehen. Die glyzinergen Synapsen der NF-Zellen enthalten vor allem die α2-Untereinheit des Glyzinrezeptors. Die Zeitkonstanten der sIPSCs sind unabhängig von der Verteilung ihrer jeweiligen Amplituden, und zwischen Wildtyp- und KO-Mäusen wurden keine Unterschiede in den Amplituden der sIPSCs beobachtet. Während der Untersuchungen wurden sporadisch noch weitere Amakrinzellen, vor allem „widefield“- (WF) Zellen abgeleitet. Die Verteilungen der Zeitkonstanten der sIPSCs dieser Zellen streuten zwischen 8 und über 100 ms. Dabei wurden Zeitkonstanten gemessen, die noch langsamer waren als die von NF-Amakrinzellen und bei einigen WF-Zellen wurden mittlere Zeitkonstanten von mehr als 50 ms beobachtet. Diese Ergebnisse zeigen, dass unterschiedliche Klassen von Amakrinzellen verschiedene α-Untereinheiten des Glyzinrezeptors in den Synapsen exprimieren. Dies hat Auswirkung auf die Kinetik der glyzinergen Hemmung bei diesen Zellen und lässt darauf schließen, dass sie bei der zeitlichen Modulation der Lichtsignale unterschiedliche Aufgaben haben.

Quantum effects and dynamics in hydrogen-bonded systems: a first-principles approach to spectroscopic experiments

Computer simulations have become an important tool in physics. Especially systems in the solid state have been investigated extensively with the help of modern computational methods. This thesis focuses on the simulation of hydrogen-bonded systems, using quantum chemical methods combined with molecular dynamics (MD) simulations. MD simulations are carried out for investigating the energetics and structure of a system under conditions that include physical parameters such as temperature and pressure. Ab initio quantum chemical methods have proven to be capable of predicting spectroscopic quantities. The combination of these two features still represents a methodological challenge. Furthermore, conventional MD simulations consider the nuclei as classical particles. Not only motional effects, but also the quantum nature of the nuclei are expected to influence the properties of a molecular system. This work aims at a more realistic description of properties that are accessible via NMR experiments. With the help of the path integral formalism the quantum nature of the nuclei has been incorporated and its influence on the NMR parameters explored. The effect on both the NMR chemical shift and the Nuclear Quadrupole Coupling Constants (NQCC) is presented for intra- and intermolecular hydrogen bonds. The second part of this thesis presents the computation of electric field gradients within the Gaussian and Augmented Plane Waves (GAPW) framework, that allows for all-electron calculations in periodic systems. This recent development improves the accuracy of many calculations compared to the pseudopotential approximation, which treats the core electrons as part of an effective potential. In combination with MD simulations of water, the NMR longitudinal relaxation times for 17O and 2H have been obtained. The results show a considerable agreement with the experiment. Finally, an implementation of the calculation of the stress tensor into the quantum chemical program suite CP2K is presented. This enables MD simulations under constant pressure conditions, which is demonstrated with a series of liquid water simulations, that sheds light on the influence of the exchange-correlation functional used on the density of the simulated liquid.

Psychophysische Skalierung visueller Merkmalssalienz

Die Messung der Stärke von Empfindungen hat in der Psychologie eine lange Tradition, die bis in die Zeit der Entstehung der Psychologie als eine eigenständige Wissenschaft gegen Ende des 19. Jahrhunderts zurückreicht. Gustav Theodor Fechner verband die Beobachtung Webers der Konstanz des Koeffizienten des eben merklichen Unterschieds zu der Vergleichsintensität (sog. "Weber-Quotient") mit der Annahme einer sensorischen Schwelle, und entwickelte daraus erstmals eine Skala für die Stärke von Empfindungen. Die Fechner-Skala verwendet die Anzahl sukzessiver Schwellenschritte als natürliche, psychologische Einheit. Die Stärke einer Empfindung für eine gegebene Reizintensität wird ausgedrückt als die Anzahl von Schwellenschritten, die man gehen muss, um von keiner Empfindung bis zur in Frage stehenden Empfindung zu gelangen. Die Funktion, die den Zusammenhang von Reizintensität und der Anzahl nötiger Schwellenschritte beschreibt, ist stets logarithmisch und über sukzessive Schwellenmessungen für Reize aus den verschiedensten Sinnesmodalitäten bestimmbar. Derart sich ergebende Skalierungen heißen "indirekt", weil die in Frage stehende Reizintensität selbst nicht von der Urteilsperson bewertet wird. Intensitäten sind vom Urteiler nur mit anderen Intensitäten in Bezug auf ein "stärker" oder "schwächer", also ordinal, zu vergleichen. Indirekte Skalierungsmethoden eignen sich insbesondere, wenn der Reizeindruck flüchtig und von der absoluten Stärke her schwer durch den Urteiler zu quantifizieren ist. Ein typisches Beispiel hierfür ist die Auffälligkeit (Salienz) von visuellen Objekten, die in zufällig wechselnde Hintergründe eingebettet sind und dem Betrachter nur als ein rasches raumzeitliches Aufblitzen präsentiert werden. Die Stärke des Unterschieds in Merkmalen wie Helligkeit, Farbe, Orientierung, Schattierung, Form, Krümmung, oder Bewegung bestimmt das Ausmaß der Salienz von Objekten. Obschon eine Fülle von Arbeiten existiert zu der Frage, welche Merkmale und deren Kombinationen ohne Wissen des Ortes ihrer Präsentation automatisch starke Salienz ("Pop-Out") erzeugen, existieren bislang keine systematischen Versuche, die Salienz von Merkmalen für einen weiten Bereich von Merkmalsunterschieden zu erfassen und vergleichbar zu machen. Indirekte Skalierungen liegen vor für die Merkmale Kontrast (Legge und Foley, 1980) und Orientierung (Motoyoshi und Nishida, 2001). Ein Vergleich der Salienz über mehrere Merkmale und der Nachweis, dass die Salienz eine eigene, von der Merkmalsdimension unabhängige sensorische Qualität ist, steht aber bislang aus. In der vorliegenden Arbeit wird gezeigt, dass der Unterschied von Objekten zur einbettenden Umgebung hinsichtlich visueller Merkmale zu Salienz führt und diese Salienz unabhängig von dem sie erzeugenden Merkmal der Stärke nach skalierbar ist. Es wird ferner gezeigt, dass die Einheiten der für zwei Merkmale erhobenen indirekten Skalierungsfunktionen in einem absoluten Sinne gleich sind, solange sichergestellt ist, dass (i) keine alternativen Hinweisreize existieren und nur der reine Merkmalsunterschied von Objekt und Umgebung bewertet wird und (ii) das sensorische Rauschen in den aktivierten Merkmalskanälen für beide Merkmale gleich ist. Für diesen Aufweis wurden exemplarisch die Merkmale Orientierung und Ortsfrequenz ausgewählt und die Salienz ihrer Merkmalskontraste über Naka-Rushton-Funktionen, gewonnen aus den zugrundeliegenden Salienz-Inkrementschwellenmessungen, indirekt skaliert. Für das Merkmal Ortsfrequenz liegt hiermit erstmals eine indirekte Skalierung vor. Hierfür musste eine spezielle Messtechnik entwickelt werden, die die Bewertung reiner Ortsfrequenzunterschiede, frei von konfundierenden absoluten Ausprägungen der Ortsfrequenzen, sicherstellt. Die Methode ist in Kapitel 7 dargestellt. Experimente, die die konfundierende Wirkung absoluter Merkmalsausprägungen auf die Salienzmessung demonstrieren, sind in Kapitel 6 dargestellt. In Kapitel 8 findet sich ein empirischer Abgleich der Ergebnisse von Inkrement- und Dekrementschwellenmessungen, eine Messtechnik, die zur Erfassung von Unterschiedsschwellen im Extrembereich der Orientierungsunterschiede von 90° nötig ist. Kapitel 9 enthält den empirischen Aufweis der Transitivität der Gleichheitsrelation für Salienzmessungen von Orientierung und Ortsfrequenz durch Abgleich mit einem dritten Merkmal und erbringt damit den Beleg der merkmalsunabhängigen Erfassung von Auffälligkeit über die indirekte Skalierungsmethodik. Ferner wird dort die Wirksamkeit der Grundsalienz von Mustern, gegeben über externes Rauschen in den Merkmalen (sog. "Merkmalsjitter") für die Verschiebung des Nullpunktes der Skalierungsfunktion aufgezeigt. Im letzten Experiment (Kapitel 10) wird dann die Skalierung von Orientierung und Ortsfrequenz bei gleicher Grundsalienz der Muster verglichen und gezeigt, dass beide Skalen in einem absoluten Sinne gleiche Einheiten aufweisen (also gleiche Skalenzahlen gleiche sensorische Auffälligkeiten anzeigen, obwohl sie von verschiedenen Merkmalen stammen), wenn der Effekt des sensorischen Rauschens, der im Merkmal Orientierung nicht über die verschiedenen Schwellenschritte konstant ist, kompensiert wird. Die Inkonstanz des Effektes des sensorischen Rauschens im Merkmal Orientierung wird über die Veränderung der Steigung der psychometrischen Präferenzfunktion für die Vergleichsurteile der Orientierungssalienz für eine fest vorgegebene Ortsfrequenzsalienz greifbar, und der Effekt der Steigungsveränderung kompensiert exakt die Nichtlinearität in der für beide Merkmale erhobenen Salienz-Matchingfunktion. Im letzten Kapitel wird ein Ausblick auf eine mögliche Modellierung der Salienzfunktionen über klassische Multikanal-Feedforwardmodelle gegeben. In den ersten fünf Kapiteln sind einführend die Gebiete der indirekten Skalierung, der Merkmalssalienz und der Texturtrennung im menschlichen visuellen System dargestellt.

Analyse der Transmembran-Agrin-abhängigen Signalkaskade in auswachsenden Axonen des zentralen Nervensystems

Die Entdeckung einer Transmembranform des Proteoglykans Agrin führte zu der Hypothese, dass TM-Agrin ein Rezeptor oder Korezeptor mit signaltransduzierenden Eigenschaften sein könnte. Die durch Antikörper simulierte Ligandenbindung an TM-Agrin resultiert in der Bildung von zahlreichen Ausläufern sowohl auf ZNS als auch auf PNS Axonen und Dendriten und unterstützt diese Hypothese. Übereinstimmend mit diesen Ergebnissen führt die Überexpression von TM-Agrin in ZNS Neuronen ebenfalls zur Bildung von zahlreichen Ausläufern, wohingegen die Unterdrückung der TM-Agrin Expression durch siRNA die Anzahl der Ausläufer stark reduziert. Der Mechanismus der durch TM-Agrin induzierten Bildung von Ausläufern ist jedoch unbekannt. Ziel der Dissertation war es deshalb, die durch TM-Agrin induzierte Signalkaskade zu untersuchen. Mit Hilfe von biochemischen, immunozytochemischen und pharmakologischen Unter-suchungen konnte gezeigt werden, dass sich TM-Agrin auf auswachsenden Axonen und nach Überexpression in nicht-neuronalen Zellen in lipid rafts anreichert und das lipid rafts sowohl für die Bildung als auch für die Aufrechterhaltung der Ausläufer notwendig sind. Die durch polyklonale Antikörper induzierte Bildung von Ausläufern kann sowohl durch die Inhibierung der Src-Kinase Fyn, welche in lipid rafts lokalisiert ist, als auch der 44/42 MAPK gehemmt werden. Zudem führt die Aggregation von TM-Agrin durch polyklonale Antikörper zu einer erhöhten Aktivität der Fyn- und 44/42 MAP-Kinase. Im Gegensatz dazu hat eine Inhibierung der PI3-Kinase keine Auswirkungen auf die Bildung der Ausläufer. Der intrazelluläre, sekundäre Botenstoff cGMP, nicht aber cAMP, fördert die Bildung von Ausläufern. Die konzentrationsabhängige Blockierung des Coxsackie-Adenovirus-Rezeptors (CAR) führt zu einer Hemmung der Ausläuferbildung. Ferner interagiert CAR im Zentralnervensystem während der Phase des aktiven axonalen Wachstums mit TM-Agrin und induziert nach Überexpression in neuronalen und nicht-neuronalen Zellen die Bildung von Ausläufern. In der vorliegenden Arbeit konnten somit Teilabschnitte der durch TM-Agrin induzierten Signalkaskade entschlüsselt werden.